Informácie

Prečo neexistuje test ELISA na SARS-CoV-2?

Prečo neexistuje test ELISA na SARS-CoV-2?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pokiaľ viem, testy SARS-CoV-2, ktoré sa v súčasnosti používajú na celom svete, sú RT-PCR v reálnom čase. Prečo neexistuje test ELISA na SARS-CoV-2?

V porovnaní s PCR je ELISA:

  1. Oveľa lacnejšie;
  2. Oveľa rýchlejšie;
  3. Nevyžaduje vyškolených technikov ani zložité vybavenie.

Koronavírus: Čo by ste mali vedieť o testoch

Testovanie na SARS-CoV-2 sa považuje za dôležitý predpoklad postupného rušenia obmedzení. Ale koľko testov by malo byť a koho?

Na trh prichádza stále viac testov na nový koronavírus. Ku koncu júla už bolo na svete viac ako 350 rôznych produktov. Existujú tri hlavné typy: PCR testy, sérologické testy (ELISA) a antigénové testy.


Testovanie amplifikácie nukleových kyselín na infekciu SARS-CoV-2

Diagnostické testy založené na reverznej transkriptáze polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR) (ktoré detekujú vírusové nukleové kyseliny) sa považujú za zlatý štandard na detekciu súčasnej infekcie SARS-CoV-2. Nedávno NAAT zahŕňali rôzne ďalšie platformy (napr. izotermickú amplifikáciu sprostredkovanú slučkou reverznej transkriptázy [RT-LAMP]). Klinicky môže po expozícii nastať obdobie až 5 dní, kým sa môžu detegovať vírusové nukleové kyseliny. Diagnosticky môžu niektoré NAAT produkovať falošne negatívne výsledky, ak dôjde k mutácii v časti genómu vírusu, ktorá je hodnotená týmto testom. 3 FDA monitoruje potenciálne účinky genetických variácií SARS-CoV-2 na výsledky NAAT a vydáva aktualizácie, keď by konkrétne variácie mohli ovplyvniť výkonnosť NAAT, ktoré dostali EUA. Vo všeobecnosti sú falošne negatívne výsledky pravdepodobnejšie pri použití NAAT, ktoré sa spoliehajú iba na jeden genetický cieľ. Preto jeden negatívny výsledok testu nevylučuje možnosť infekcie SARS-CoV-2 u ľudí, u ktorých je vysoká pravdepodobnosť infekcie na základe ich anamnézy expozície a/alebo ich klinického obrazu. 4

Mnoho komerčných NAAT, ktoré používajú RT-PCR, sa spolieha na viacero cieľov na detekciu vírusu, takže aj keď mutácia zasiahne jeden z cieľov, ostatné ciele RT-PCR budú stále fungovať. 5 NAAT, ktoré používajú viacero cieľov, je menej pravdepodobné, že budú ovplyvnené zvýšenou prevalenciou genetických variantov. V skutočnosti, pretože každý z týchto testov sa zameriava na viaceré miesta na genóme vírusu, môžu byť užitočné pri identifikácii nových genetických variantov skôr, ako sa rozšíria v populácii. Napríklad variant B.1.1.7, ktorý bol spojený so zvýšeným prenosom, nesie veľa mutácií, vrátane dvojitej delécie v pozíciách 69 a 70 na géne spike proteínu (S-gén). Zdá sa, že táto mutácia ovplyvňuje detekciu S-génu, ale nemá vplyv na iné genetické ciele v určitých NAAT. Ak je podozrenie na COVID-19 aj po tom, čo pacient dostane negatívny výsledok testu, lekári by mali v ideálnom prípade zvážiť opakovanie testovania, mali by použiť NAAT s rôznymi genetickými cieľmi. 3

SARS-CoV-2 predstavuje niekoľko diagnostických výziev, vrátane potenciálne nezhodného vylučovania vírusu z horných a dolných dýchacích ciest. Vzhľadom na vysokú špecifickosť NAAT však na diagnostiku COVID-19 postačuje pozitívny výsledok NAAT vzorky horných dýchacích ciest od pacienta s nedávnym nástupom symptómov kompatibilných so SARS-CoV-2. U pacientov s COVID-19, ťažkým akútnym respiračným syndrómom (SARS) a blízkovýchodným respiračným syndrómom (MERS) majú vzorky z dolných dýchacích ciest vyššiu vírusovú záťaž, a teda aj vyššiu výťažnosť ako vzorky z horných dýchacích ciest. 6-12 Pre intubovaných alebo mechanicky ventilovaných pacientov s klinickými príznakmi a symptómami, ktoré sú v súlade s pneumóniou COVID-19, Panel odporúčaní pre liečbu COVID-19 (panel) odporúča získať vzorky dolných dýchacích ciest na stanovenie diagnózy COVID-19, ak počiatočná vzorka z horných dýchacích ciest je negatívna (BII). Panel odporúča získať endotracheálne aspiráty cez vzorky z výplachu priedušiek alebo bronchoalveolárnej laváže (BAL) pri odbere vzoriek z dolných dýchacích ciest na stanovenie diagnózy COVID-19 (BII).

BAL a indukcia spúta sú postupy vytvárajúce aerosól, ktoré by sa mali vykonávať len po dôkladnom zvážení rizika vystavenia personálu infekčným aerosólom. Zdá sa, že endotracheálna aspirácia prináša nižšie riziko tvorby aerosólu ako BAL a niektorí odborníci považujú citlivosť a špecifickosť endotracheálnych aspirátov a vzoriek BAL za porovnateľnú pri detekcii SARS-CoV-2.

Testovanie amplifikácie nukleových kyselín pre jednotlivcov s predchádzajúcim pozitívnym výsledkom testu SARS-CoV-2

NAAT môžu detekovať SARS-CoV-2 RNA vo vzorkách získaných týždne až mesiace po nástupe symptómov COVID-19. 13,14 Pravdepodobnosť obnovenia replikačne kompetentného vírusu >10 dní od nástupu symptómov u pacientov s miernym ochorením a >20 dní u pacientov s ťažkým ochorením je však veľmi nízka. 15,16 Okrem toho virologické štúdie aj sledovanie kontaktov vysokorizikových kontaktov ukazujú nízke riziko prenosu SARS-CoV-2 po týchto intervaloch. 17,18 Na základe týchto výsledkov Centrum pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC) odporúča, aby sa NAAT neopakovali u asymptomatických osôb do 90 dní po predchádzajúcej infekcii SARS-CoV-2, a to aj v prípade, že osoba bola značne vystavená na SARS-CoV-2 (AIII). 19 Ak existujú obavy, že imunokompromitovaný zdravotnícky pracovník môže byť stále infekčný > 20 dní od začiatku infekcie SARS-CoV-2, odporúča sa konzultácia s miestnymi zdravotníckymi službami pre zamestnancov ohľadom zásad testovania návratu do práce.

Reinfekcia SARS-CoV-2 bola hlásená u ľudí, ktorí dostali počiatočnú diagnózu infekcie, preto by sa mala zvážiť NAAT u osôb, ktoré sa vyliečili z predchádzajúcej infekcie a u ktorých sa prejavujú symptómy, ktoré sú kompatibilné s infekciou SARS-CoV-2. ak neexistuje alternatívna diagnóza (BIII). Je však potrebné poznamenať, že osoby infikované SARS-CoV-2 môžu mať negatívny výsledok počiatočného NAAT a potom pozitívny výsledok následného testu v dôsledku občasnej detekcie vírusovej RNA a nie v dôsledku reinfekcie. 13 Ak sú výsledky počiatočného a následného testu pozitívne, na rozlíšenie medzi pretrvávajúcou prítomnosťou vírusových fragmentov a reinfekciou sú potrebné komparatívne údaje o vírusovej sekvencii z oboch testov. Pri absencii údajov o vírusovej sekvencii môže prahová hodnota cyklu (Ct) z pozitívneho výsledku NAAT poskytnúť informáciu o tom, či novo zistená infekcia súvisí s pretrvávaním vírusových fragmentov alebo s reinfekciou. Hodnota Ct je počet cyklov PCR, pri ktorých sa cieľová nukleová kyselina vo vzorke stáva detegovateľnou. Vo všeobecnosti je hodnota Ct nepriamo úmerná vírusovej záťaži SARS-CoV-2. Pretože klinická užitočnosť hodnôt Ct je oblasťou aktívneho skúmania, ak sa tieto hodnoty používajú na usmernenie klinických rozhodnutí, mali by ste sa poradiť s odborníkom.


Vylúčenie zodpovednosti

Tento zoznam sa aktualizuje dvakrát týždenne a obsahuje iba testy, ktoré získali EUA Úradu pre potraviny a liečivá USA. Zahŕňa iba testy, pre ktoré sú dostupné údaje a dokumentácia a pre ktoré je ich určené zamýšľané použitie v súlade s ich regulačným štatútom. Táto stránka nie je určená na to, aby sa používala ako referencia na financovanie alebo návrhy grantov. Nezahrnutie do tohto zoznamu by sa nemalo interpretovať ako posúdenie platnosti alebo legitimity testov.

Poznámka k údajom o citlivosti a špecifickosti

Údaje o citlivosti a špecifickosti hlásené výrobcom sú uvedené, ak sú k dispozícii. Vysoko citlivý test by mal zachytiť všetky skutočne pozitívne výsledky. Vysoko špecifický test by mal vylúčiť všetky skutočne negatívne výsledky. Tieto opatrenia nie sú nezávisle potvrdené Centrom pre zdravotnú bezpečnosť Johnsa Hopkinsa. Ak citlivosť alebo špecifickosť nie je uvedená, nebola uvedená/dostupná v čase uverejnenia. Počet vzoriek použitých na definície citlivosti/špecifickosti, ak je k dispozícii, je uvedený v popise produktu v rozšírených verziách tabuliek.

Pojmy „citlivosť“ a „špecifickosť“ sa nemusia objaviť v informačných listoch výrobcov, ale skôr sa tieto hodnoty často uvádzajú ako „pozitívny percentuálny súhlas“ a „negatívny percentuálny súhlas“. Americká FDA odporúča výrobcom používať tieto výrazy na označenie toho, že pri hodnotení testu bola použitá nereferenčná norma.

Viac informácií o sérologických testoch:

Táto stránka bola naposledy aktualizovaná 25. júna 2021.


Informácie o autorovi

Títo autori prispeli rovnakým dielom: MengYa Yuan, YaoYing Wan, Cui Liu

Afiliácie

Štátne kľúčové laboratórium bunkovej biológie, Centrum excelentnosti v molekulárnej bunkovej vede, Šanghajský inštitút biochémie a bunkovej biológie, Čínska akadémia vied, Univerzita Čínskej akadémie vied, Šanghaj, Čína

MengYa Yuan, YaoYing Wan, Cui Liu, Yue Li, ZhaoYuan Liu, ChangDong Lin & JianFeng Chen

School of Life Science, Hangzhou Institute for Advanced Study, University of Chinese Academy of Sciences, Hangzhou, Čína


Výskum, ktorý je príliš nebezpečný?

Avšak princíp, ktorý je základom výskumu ziskovosti funkcie, bol v poslednom desaťročí značne spochybnený.

Klasickým a často citovaným príkladom, ktorý znepokojuje mnohých vedcov, je výskum Rona Fouchiera a Yoshihira Kawaoku o vysoko nebezpečnom víruse vtáčej chrípky H5N1. Pomocou techniky, ktorá prenášala vírus z jednej fretky na druhú mnohokrát, títo výskumníci dokázali vytvoriť vírus chrípky H5N1, ktorý by sa mohol preniesť na tento druh aerosólmi.

Štúdia bola široko diskutovaná a výskum bol nakoniec pozastavený. Americká vláda dokonca vyzvala vedecké časopisy, aby nezverejňovali jej úplné výsledky, argumentujúc tým, že tieto informácie môžu využiť bioteroristi. Výskum bol obnovený v roku 2013.

Výskum so ziskom funkcie má potenciál pomôcť zabrániť prenosu vírusu s pandemickým potenciálom zo zvieraťa na človeka. Tento typ výskumu sa však musí vykonávať vo vysoko bezpečných laboratóriách, ako sú tie známe ako BSL-4.

Pohľad na laboratórium BSL-4 vnútri Wuhanského virologického inštitútu po návšteve tímu WHO, 3. februára 2021. (AP Photo/Ng Han Guan)

Tieto laboratóriá sú postavené tak, aby chránili zamestnancov a výskumníkov pred infekciou a aby zabránili úniku organizmov. Dokumenty od predstaviteľov veľvyslanectva USA však odhalili, že normy biologickej bezpečnosti v laboratóriu BSL-4 vo WIV neboli dostatočne prísne. Okrem toho viacerí výskumníci naznačili, že štúdie inštitútu zamerané na zlepšenie funkčnosti netopierích koronavírusov boli riskantné a mohli by byť škodlivé pre ľudí, ak by unikli.


Výsledky

Demografické zistenia

Medián veku pacientov bol 39,9 rokov (5� percentil: 23,6�,8). Väčšinu tvorili muži (57,5 %) a mali mierny alebo stredne závažný klinický obraz, pričom 10 % pacientov vyžadovalo hospitalizáciu, dvaja pacienti (pacienti #37 a #38) mali diagnostikovaný syndróm akútnej respiračnej tiesne (ARDS, 5 %) a bez smrteľných výsledkov . Šestnásť pacientov (40 %) malo jeden rizikový faktor závažného ochorenia (hypertenzia, obezita alebo diabetes mellitus) a iba jeden mal dva takéto základné ochorenia. Medián vírusovej záťaže pri diagnóze bol nameraný pri 25,9 Ct (t.j. 480 950 kópií genómu/ml), rozsah 20,0�,9 (941� miliónov kópií genómu/ml). U dvoch pacientov s ARDS sa vzorky odobrali 60 dní po nástupe ochorenia. U dvoch ďalších pacientov vyžadujúcich hospitalizáciu sa vzorky odobrali 8 (pacient #9) a 15 (pacient #23) dní po nástupe. Jednotlivé výsledky testov IgG a IgM sú znázornené na obrázkoch 1A, 2A.

Postava 1. Výsledky pre IgG sérológiu. (A) Výsledky jednotlivých pacientov s COVID-19. Každý riadok predstavuje pacienta, každý stĺpec sérologický test, čierny blok pozitívny výsledok, sivý blok nepresvedčivý výsledok (pre metódy ELISA) a biely blok negatívny výsledok (B) Úplná zhoda, Cohen’ hodnota Kappa a Chi-kvadrát (alebo Fisher’ presný test kurzívou) p-hodnota medzi dvoma testami (C) Korelačný graf medzi dvoma metódami ELISA.

Obrázok 2 Výsledky pre IgM sérológiu. (A) Výsledky jednotlivých pacientov s COVID-19. Každý riadok predstavuje pacienta, každý stĺpec sérologický test, čierny blok pozitívny výsledok, sivý blok nepresvedčivý výsledok (pre metódy ELISA) a biely blok negatívny výsledok (B) Úplný súhlas, Cohen’ hodnota Kappa a Chi-kvadrát (alebo Fisher’ presný test kurzívou) p-hodnota medzi dvoma testami.

Detekcia SARS-CoV-2 IgG

Anti-SARS-CoV-2 IgG detekcia bola zahrnutá v piatich testoch (obrázok 1). Kontrolné séra boli anti-SARS-CoV-2 IgG negatívne pri všetkých testoch (údaje nie sú uvedené). U pacientov bolo porovnanie intermetód na stanovenie IgG 50 % alebo viac (obrázok 1B). Interné IFA a EuroImmun mali miernu zhodu so všetkými ostatnými systémami (aspoň 60 % zhoda a 0,26 Cohen’s Kappa), okrem vzájomných (Cohen’s Kappa 0,05 a Chi-square p-hodnota 0,72). T-Tek a NovaLisa mali tiež miernu zhodu so všetkými systémami (najmenej 62,5 % zhoda a 0,29 Cohen’s Kappa), okrem vzájomných (Cohen’s Kappa 0,13, Fisherov test p-hodnota 0,476). Spoločnosť Sure Bio-tech preukázala spravodlivú zhodu so všetkými systémami (dohoda 60�% Cohen’s Kappa 0,26𠄰,48 Chi-kvadrát alebo Fisherov test sú všetky významné). Korelačný graf medzi dvoma systémami ELISA (obrázok 1C) odhalil významnú koreláciu medzi výsledkami EuroImmun a NovaLisa IgG (korelačný koeficient = 0,35 p-hodnota Pearson’s testu = 0,025, napriek tomu, že väčšina pozitívnych výsledkov s EuroImmun bola slabá (medzi 1,1 a 4), čo môže vysvetliť mierny korelačný koeficient. Najlepšie odhadované citlivosti (obrázok 1A a tabuľka 3) boli zistené pri Sure Bio-tech a EuroImmun (71,0 a 61,3 %), zatiaľ čo citlivosť iných metód bola nižšia ako 50 %. Pokiaľ ide o dvoch pacientov s ARDS, IgG boli detegované vo všetkých systémoch. U dvoch ďalších hospitalizovaných pacientov bol len nepresvedčivý výsledok u pacientov č. 9 a č. 23 s EuroImmun a pozitívny výsledok u pacientov č. 23 s IFA.

Tabuľka 3 Odhadované citlivosti pre výsledky IgG a IgM.

Detekcia SARS-CoV-2 IgM

Detekcia anti-SARS-CoV-2 IgM bola dostupná so štyrmi hodnotenými testami (obrázok 2). Kontrolné séra boli anti-SARS-CoV-2 IgM negatívne pri všetkých testoch (údaje nie sú uvedené). Najlepšia zhoda medzi metódami bola medzi dvomi riešeniami LFA Sure Bio-tech a T-Tek (65 % 0,353 Cohen’s Kappa a Fisherov test p-hodnota 0,005), inak v rozsahu od 30 do 72,5 % súhlas, 𢄠.349𠄰.106 Cohen’s Kappa. Napriek významnému testu Chi-kvadrát medzi T-Tek a IFA (p = 0,017), súhlas bol nízky (negatívny Cohen’s Kappa a 30 % súhlas). Odhadovaná citlivosť (obrázok 2A a tabuľka 3) bola 64,5 % pre T-Tek, ale iba 19,4�,5 % pre IFA, NovaLisa a Sure Bio-tech. U dvoch pacientov s ARDS boli anti-SARS-CoV-2 IgM detegované iba s T-Tek. U dvoch ďalších hospitalizovaných pacientov mal č. 9 pozitívny výsledok len pri T-Tek, zatiaľ čo č. 23 mal pozitívny výsledok pri IFA a NovaLisa.


Nový výskum odhaľuje, prečo niektorí pacienti môžu mať pozitívny test na COVID-19 dlho po uzdravení

Obrázok buniek rakoviny pľúc infikovaných vírusom SARS-CoV-2. Modrá predstavuje DNA, zelená znázorňuje nukleokapsidový proteín SARS-CoV-2 a červená predstavuje dvojvláknovú RNA, ku ktorej dochádza, keď vírus replikuje svoj genóm. Nová štúdia z laboratória Jaenisch naznačuje, že niektoré vírusové RNA je možné reverzne prepísať a vložiť do ľudského genómu, čo môže vysvetľovať, prečo niektorí pacienti aj po uzdravení naďalej pozitívne testujú na COVID-19. Kredit Alexsia Richards/Whitehead Institute

V prvých mesiacoch pandémie COVID-19 si zdravotnícki pracovníci, ktorí analyzovali výsledky testov, začali všímať niečo zvláštne: pacienti, ktorí sa už vyliečili z COVID-19, mali niekedy nevysvetliteľne pozitívny test PCR o týždne alebo dokonca mesiace neskôr.

Hoci ľudia môžu dostať COVID-19 druhýkrát, nezdalo sa, že by to tak bolo v prípade týchto pacientov, z ich vzoriek neboli izolované žiadne živé vírusy a niektoré štúdie zistili tieto falošne pozitívne výsledky, aj keď boli účastníci v karanténe. Tiež RNA majú vo všeobecnosti krátku životnosť – väčšinou sa držia len niekoľko minút – takže bolo nepravdepodobné, že by pozitívne testy boli výsledkom zvyškových RNA.

Teraz môže nový článok z laboratória člena Whitehead Institute a profesora biológie na MIT Rudolfa Jaenischa ponúknuť odpoveď na to, prečo niektorí pacienti pokračujú v pozitívnych testoch aj po zotavení z COVID-19. V novinách publikovaných online 6. mája v Zborník Národnej akadémie viedJaenisch a spolupracovníci ukazujú, že genetické sekvencie z RNA vírusu SARS-CoV-2 sa môžu integrovať do genómu hostiteľskej bunky prostredníctvom procesu nazývaného reverzná transkripcia. Tieto časti genómu sa potom dajú „prečítať“ do RNA, ktoré by sa potenciálne dali zachytiť testom PCR.

SARS-CoV-2 nie je jediný vírus, ktorý sa integruje do ľudského genómu. Približne osem percent našej DNA pozostáva zo zvyškov starých vírusov. Niektoré vírusy, nazývané retrovírusy, sa spoliehajú na integráciu do ľudskej DNA, aby sa mohli replikovať. "SARS-CoV-2 nie je retrovírus, čo znamená, že na svoju replikáciu nepotrebuje reverznú transkripciu," hovorí postdoc a prvý autor Whitehead Institute Liguo Zhang. "Avšak neretrovírusové sekvencie vírusu RNA boli zistené v genómoch mnohých druhov stavovcov vrátane ľudí."

S ohľadom na túto skutočnosť Zhang a Jaenisch začali navrhovať experimenty, aby otestovali, či by k tejto vírusovej integrácii mohlo dôjsť s novým koronavírusom. S pomocou postdoktorky laboratória Jaenisch Alexsia Richards výskumníci infikovali ľudské bunky koronavírusom v laboratóriu a potom o dva dni neskôr sekvenovali DNA z infikovaných buniek, aby zistili, či obsahuje stopy genetického materiálu vírusu.

Aby sa zabezpečilo, že ich výsledky sa dajú potvrdiť inou metodológiou, použili tri rôzne techniky sekvenovania DNA. Vo všetkých vzorkách našli fragmenty vírusového genetického materiálu (aj keď vedci zdôrazňujú, že žiadny z vložených fragmentov nestačil na opätovné vytvorenie živého vírusu).

Zhang, Jaenisch a kolegovia potom skúmali DNA lemujúcu malé vírusové sekvencie, aby našli stopy mechanizmu, ktorým sa tam dostali. V týchto okolitých sekvenciách vedci našli charakteristický znak genetického znaku nazývaného retrotranspozón.

Transpozóny, niekedy nazývané „skákacie gény“, sú úseky DNA, ktoré sa môžu presúvať z jednej oblasti genómu do druhej. Často sú aktivované, aby „skákali“ v podmienkach vysokého stresu alebo počas rakoviny alebo starnutia a sú silnými činiteľmi genetickej zmeny.

Jeden bežný transpozón v ľudskom genóme sa nazýva retrotranspozón LINE1, ktorý sa skladá z výkonnej kombinácie strojov na rezanie DNA a reverznej transkriptázy, enzýmu, ktorý vytvára molekuly DNA z templátu RNA (ako je RNA SARS-CoV-2 ).

„Integrácia LINE1 má veľmi jasnú stopu,“ hovorí Jaenisch. "Na križovatke vírusovej sekvencie s bunkovou DNA vytvára duplikáciu 20 párov báz."

Okrem duplikácie je ďalšou vlastnosťou ako dôkaz integrácie sprostredkovanej LINE1 rozpoznávacia sekvencia endonukleázy LINE1. Výskumníci identifikovali tieto vlastnosti v takmer 70 percentách DNA, ktoré obsahovali vírusové sekvencie, ale nie vo všetkých, čo naznačuje, že vírusová RNA sa môže integrovať do bunkovej DNA prostredníctvom viacerých mechanizmov.

Na skríning vírusovej integrácie mimo laboratória výskumníci analyzovali publikované súbory údajov transkriptov RNA z rôznych typov vzoriek vrátane vzoriek pacientov s COVID-19. Pomocou týchto súborov údajov boli Zhang a Jaenisch schopní vypočítať frakciu génov, ktoré boli prepísané v bunkách týchto pacientov, ktoré obsahovali vírusové sekvencie, ktoré bolo možné odvodiť z integrovaných vírusových kópií. Percento sa líšilo od vzorky k vzorke, ale pre niektorých sa zdá, že relatívne veľká časť vírusových transkriptov bola prepísaná z vírusového genetického materiálu integrovaného do genómu.

Predchádzajúci návrh článku s týmto zistením bol publikovaný online na predtlačovom serveri bioRxiv. Nedávny výskum však odhalil, že aspoň niektoré vírusovo-bunkové čítania by mohli byť produktom zavádzajúcich artefaktov metódy sekvenovania RNA. V tomto článku boli výskumníci schopní eliminovať tieto artefakty, ktoré mohli zakrývať výsledky.

Namiesto jednoduchého sčítania prepisov, ktoré obsahovali vírusový materiál, vedci skúmali, ktorým smerom boli prepisy čítané. Ak by boli vírusové čítania výsledkom živých vírusov alebo existujúcich vírusových RNA v bunke, výskumníci by očakávali, že väčšina vírusových transkriptov by bola prečítaná v správnej orientácii pre príslušné sekvencie v akútne infikovaných bunkách v kultúre, viac ako 99 percent má správnu orientáciu. Ak by však transkripty boli produktom náhodnej vírusovej integrácie do genómu, došlo by k rozdeleniu takmer 50-50 – polovica transkriptov by sa čítala dopredu, druhá polovica dozadu, vzhľadom na hostiteľské gény. "To je to, čo sme videli na niektorých vzorkách pacientov," hovorí Zhang. "Naznačuje to, že veľká časť vírusovej RNA v niektorých vzorkách by mohla byť transkribovaná z integrovaných sekvencií."

Pretože súbor údajov, ktorý použili, bol pomerne malý, Jaenisch zdôrazňuje, že je potrebných viac informácií, aby sme presne určili, aký bežný je tento jav v reálnom živote a čo to môže znamenať pre ľudské zdravie.

Je možné, že len veľmi málo ľudských buniek vôbec zažije nejaký druh vírusovej integrácie. V prípade iného RNA vírusu, ktorý sa integruje do genómu hostiteľskej bunky, len zlomok percenta infikovaných buniek (medzi 0,001 a 0,01) obsahoval integrovanú vírusovú DNA. V prípade SARS-CoV-2 je frekvencia integrácie u ľudí stále neznáma. "Podiel buniek, ktoré sa integrujú, môže byť veľmi malý," hovorí Jaenisch. "Ale aj keď je to zriedkavé, existuje viac ako 140 miliónov ľudí, ktorí sa už nakazili, však?"

V budúcnosti plánujú Jaenisch a Zhang preskúmať, či by sa fragmenty genetického materiálu SARS-CoV-2 mohli bunkou premeniť na proteíny. "Ak to urobia a vyvolajú imunitné reakcie, môže to poskytnúť nepretržitú ochranu pred vírusom," hovorí Zhang.

Dúfajú tiež, že preskúmajú, či by tieto integrované časti DNA mohli byť čiastočne vinné za niektoré z dlhodobých autoimunitných následkov, ktoré niektorí pacienti s COVID-19 pociťujú. "V tejto chvíli môžeme len špekulovať," hovorí Jaenisch. "Ale jedna vec, ktorú si myslíme, že môžeme vysvetliť, je, prečo sú niektorí pacienti dlhodobo pozitívni na PCR."


4. V súčasnosti sa vyvíjajúce koncepcie diagnostiky COVID-19

4.1. Technológia klastrových pravidelne medzipriestorových krátkych palindromických opakovaní (CRISPR/Cas13)

Nedávno bol vyvinutý test založený na klastrovaných pravidelne medzipriestorových krátkych palindromických opakovaniach (CRISPR/Cas12a) s vizuálnymi údajmi. Test dokáže detegovať 10 kópií vírusového génu len za 45 minút a poskytuje jednoduchú a spoľahlivú diagnostickú metódu, ktorá navyše preukazuje vysokú citlivosť a špecifickosť. S cieľom umožniť rýchlu diagnostiku v nemocnici alebo pri prijatí bol test vybavený reportérom ssDNA označeným prázdnou zelenou fluorescenčnou časticou, ktorá sa odštiepi proteínom Cas12a, keď sa nukleová kyselina SARS-CoV-2 sa nachádza v detekčnom systéme. Týmto spôsobom sa získa zelený fluorescenčný signál viditeľný voľným okom vo svetle s vlnovou dĺžkou 485 nm. Vysoká špecifickosť testu bola dosiahnutá navrhnutím 15 crRNA, ktoré dokážu rozlíšiť polymorfizmy jedného nukleotidu s inými vírusmi súvisiacimi so SARS v štyroch doménach: ORF1a alebo ORF1b, N a E gény [37].

4.2. Kondenzát vydychovaného dychu (EBC)

Pokračuje sa v hľadaní nových diagnostických metód. Keďže SARS-CoV-2 sa šíri kvapôčkami, zatiaľ čo index diagnostickej citlivosti a špecificity pre testy RT-qPCR je najvyšší pri bronchoalveolárnom výplachu (BAL) (vyšší ako pri výteroch spúta alebo nosa/krku), vedci nedávno navrhli použitie kondenzátu vydychovaného vzduchu (EBC) na diagnostické účely. EBC je svojím biochemickým zložením a pôvodom najpodobnejšia BAL. Vyšetrenia s využitím EBC sú relatívne novou diagnostickou metódou, ktorá sa používa najmä na hodnotenie zápalu v dýchacom trakte a jej zložky odzrkadľujú zloženie tekutiny výstelky priedušiek a alveol. EBC je kondenzovaná forma malých kvapôčok tekutiny vystielajúcej pľúca, ktorá je zvyčajne vydychovaná, obsahuje rôzne zložky, od malých iónov až po bielkoviny a organely, dokonca môže obsahovať vírusy, plesne a baktérie. Odber vzoriek kondenzátu je bezpečný, úplne neinvazívny, jednoduchý na vykonanie, možno ho mnohokrát opakovať, možno ho vykonať aj u pacientov s ťažkými komplikáciami COVID-19, jeho obrovskou výhodou je, že ho možno vykonať aj u malých detí , s použitím špeciálnych pleťových masiek. Priebeh vyšetrenia je taký, že pacient je vyzvaný na výdych, keď dýcha nerovnomerne asi 10-15 minút, do prístroja vybaveného chladiacim systémom, ktorý nám umožňuje hromadiť kondenzát, v ktorom sa môže nachádzať SARS-CoV-2. zistené. Aplikácia tejto metódy sa zdá byť opodstatnená z hľadiska verejného zdravia. Falošne pozitívne výsledky, ktoré sa v súčasnosti dosahujú, prispievajú k pokračujúcemu šíreniu vírusu po celom svete [38,39].


Autori vyhlasujú, že nemajú potenciálny konflikt záujmov.

Sme vďační Dr. Philipovi Heimannovi za jeho interpretáciu technológie a výsledkov plazmónového rezonančného snímania na báze nanočastíc, Dr. Yun Zhao za jej talentovaný návrh všetkých obrázkov prezentovaných v článku a Dr. Cliona McHale za korektúru rukopisu a zmysluplné návrhy. Sme tiež vďační za COVID-19 Open Research Dataset (CORD-19) –, bezplatný, otvorený zdroj pre globálnu výskumnú komunitu, väčšinu časopisov a ich vydavateľov, ktorí nám poskytli všetky články o COVID-19 zadarmo, všetkým výskumníkom a verejnosti! Bez týchto obohatených zdrojov by pre nás nebolo možné vytvoriť tento projekt písania.