Informácie

Ako vypočítať percento mitochondriálnej heteroplazmy

Ako vypočítať percento mitochondriálnej heteroplazmy


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ako ľudia vypočítajú percento heteroplazmy mtDNA?

Predstavuje 7 % heteroplazmy z 10 buniek mutáciu nachádzajúcu sa v rovnakej polohe na genóme medzi 700 genómami mtDNA z 10 000 genómov mtDNA za predpokladu, že na bunku pripadá 1 000 genómov?

Ďakujem, že ste mi pomohli trochu lepšie pochopiť tento koncept.


Poslal som e-mail autorom článku „Akumulácia somatických mitochondriálnych DNA mutácií v dospelých iPSC súvisiacich s vekom“ a oni potvrdili, že vypočítali % heteroplazmy mtDNA nasledujúcim spôsobom: Zosúladili všetky genómy mtDNA s referenčnou sekvenciou. Akákoľvek odchýlka na konkrétnej pozícii od referencie bola „mutácia“. % heteroplazmy sa vypočítalo vydelením celkového počtu mutácií na určitej nukleotidovej pozícii celkovým počtom genómov zastúpených na pozícii vynásobeným 100. Takže inými slovami, aby som sa vrátil k mojej pôvodnej otázke – ak by bolo 10 000 zoradených genómov a v rovnakej polohe bolo 700 mutácií, táto mutácia by mala 7% heteroplazmu.


Mitochondriálna DNA heteroplazma pri chorobe a terapeutické prístupy založené na cielenej nukleáze

Mitochondriálna DNA (mt DNA) kóduje podskupinu génov, ktoré sú zodpovedné za oxidačnú fosforyláciu. Patogénne mutácie v ľudskej mt DNA sú často heteroplazmatické, kde druhy mt DNA divokého typu koexistujú s patogénnou mt DNA a bioenergetický defekt sa prejaví až vtedy, keď percento patogénnej mt DNA prekročí prah pre biochemické prejavy. Segregácia mt DNA počas vývoja zárodočnej línie môže vysvetliť niektoré extrémne variácie v heteroplazmii z jednej generácie na druhú. Pacienti s vysokou heteroplazmou pre škodlivé druhy mt DNA budú pravdepodobne trpieť mitochondriálnymi chorobami v dobrej viere, ktoré v súčasnosti nemožno vyliečiť. Posun heteroplazmy mt DNA smerom k divokým druhom mt DNA by mohol poskytnúť pacientom terapeutickú možnosť. Boli použité mitochondriálne cielené upravené nukleázy, ako sú mito TALEN a mito ZFN in vitro v ľudských bunkách, ktoré obsahujú patogénne mutácie mt DNA od pacientov a novšie in vivo na myšom modeli patogénnej bodovej mutácie mt DNA. Tieto nástroje génovej terapie na posun heteroplazmy mt DNA môžu byť tiež použité v spojení s inými terapiami zameranými na elimináciu a/alebo prevenciu prenosu patogénnej mt DNA z matky na dieťa.


Úvod

Život je neustály boj proti entropii. Na udržanie organizácie a biologických procesov, ktoré sú životu vlastné, je potrebná energia. Jedným z najdôležitejších procesov, ktoré každý organizmus vykonáva, je proces rozmnožovania. Reprodukcia umožňuje druhu zachovať si existenciu a umožňuje evolúcii formovať život v priebehu generácií. Bezprostrednejšie sa možno týka rozmnožovania, ktoré umožňuje jednotlivcom zakladať rodiny a umožňuje produkciu potravín prostredníctvom poľnohospodárstva. Vzhľadom na dôležitosť reprodukcie predstavujú špecifiká mitochondriálnej produkcie energie počas reprodukcie dôležitú oblasť štúdia. Vedci si čoraz viac uvedomujú dôležitosť mitochondriálnej biológie v reprodukcii, čo je zdôraznené nárastom publikácií, ktoré skúmajú ich vzájomné prepojenie (obr. 1). Je zrejmé, že pri skúmaní reprodukčných javov existujú významné mitochondriálne vzájomné vzťahy a funkčné úvahy. Špecifiká materskej dedičnosti mitochondriálnej DNA (mtDNA) a mitochondriálnej funkcie majú zásadný význam pre štúdium reprodukčných systémov.

Počet publikácií o mitochondriálnej biológii v reprodukcii od roku 1990 do roku 2010. Vyhľadávanie pojmov „mitochondrie*“ a „reprodukcia“ pre každý rok od roku 1990 v PubMed ilustruje dramatický nárast publika/záujem

Mitochondrie sú subcelulárne organely, o ktorých sa predpokladá, že vznikli, keď naši protoeukaryotickí predkovia buď uviazli alebo vytvorili symbiotický vzťah s iným organizmom, ktorý sa nakoniec stal mitochondriou [1]. Po integrácii týchto dvoch organizmov sa mitochondriálna biológia stala integrálnou súčasťou štúdia života.


Jednobunková analýza poskytuje nový pohľad na mitochondriálne ochorenia

Naše pozorovania naznačujú, že určité bunkové línie v našom tele môžu mať proces, ktorým sa chránia pred problematickými mutáciami mtDNA, čo je potenciálne veľmi vzrušujúce zistenie.

BOSTON &ndash Vyšetrovatelia vedení tímom z Massachusetts General Hospital (MGH) urobili objavy na úrovni jednotlivých buniek, aby odhalili nové podrobnosti týkajúce sa mitochondriálnych chorôb a mdash dedičných porúch, ktoré narúšajú produkciu energie v tele a v súčasnosti ich nemožno vyliečiť. Zistenia, ktoré sú zverejnené v New England Journal of Medicine, by mohli byť v konečnom dôsledku prínosom pre postihnutých pacientov.

Mitochondriálne choroby sú výsledkom zlyhania mitochondrií, špecializovaných kompartmentov v bunkách, ktoré obsahujú vlastnú DNA a produkujú energiu potrebnú na udržanie života. Zdedené mutácie v mitochondriálnej DNA (mtDNA) často spôsobujú tieto ochorenia a bunky postihnutých pacientov obsahujú zmes mutantnej a nemutovanej mtDNA, fenomén nazývaný heteroplazmia. Podiel mutantnej mtDNA sa líši medzi pacientmi a medzi tkanivami pacienta. Príznaky sa tiež pohybujú od miernych po závažné a závisia od toho, ktoré bunky tela sú ovplyvnené.

&ldquoVšeobecne sa uznáva, že frakcia mutantnej heteroplazmy je tým, čo určuje, či tkanivo bude alebo nebude vykazovať ochorenie. Aby sme lepšie porozumeli heteroplazmatickej dynamike, použili sme úplne novú technológiu genomiky s rozlíšením jednotlivých buniek, pomocou ktorej sme mohli súčasne určiť typ bunky a frakciu mutantnej heteroplazmy v tisíckach jednotlivých krviniek,“ povedal hlavný autor Vamsi K. Mootha, MD, výskumník v Katedra molekulárnej biológie MGH.

Výskumníci skúmali mtDNA v rôznych typoch krvných buniek od 9 jedincov s MELAS, jednou z najbežnejších foriem ochorenia mtDNA spojenej s mozgovou dysfunkciou a epizódami podobnými mŕtvici, so širokým rozsahom závažnosti u pacientov.

&ldquoČo robí túto štúdiu jedinečnou, je to, že podľa našich vedomostí je to prvýkrát, čo bol niekto schopný kvantifikovať percento mutácií mitochondriálnej DNA spôsobujúcich ochorenie v tisíckach jednotlivých buniek rôznych typov od toho istého pacienta, ako aj vo viacerých pacientov s dedičnou mitochondriálnou chorobou,&rdquo povedala vedúca autorka Melissa A. Walker, MD, PhD, výskumníčka na oddelení neurológie v MGH.

Analýza odhalila obzvlášť nízke hladiny heteroplazmy v T bunkách, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri zabíjaní infikovaných buniek, aktivácii iných imunitných buniek a regulácii imunitných reakcií.

&ldquoNaše pozorovania naznačujú, že určité bunkové línie v našom tele môžu mať proces, ktorým sa chránia pred problematickými mutáciami mtDNA, čo je potenciálne veľmi vzrušujúce zistenie,&rdquo povedal Walker.

Sú potrebné ďalšie štúdie, aby sa zistilo, či rozdiely v heteroplazme medzi typmi imunitných buniek ovplyvňujú funkciu buniek a či hodnotenie takejto heteroplazmy môže pomôcť lekárom diagnostikovať a monitorovať mitochondriálne ochorenia. &ldquoNaša dlhodobá vízia je, že jednobunková genomika môže viesť k zlepšeniu krvných testov na sledovanie progresie týchto chorôb,&rdquo povedal Mootha.

Okrem toho pochopenie determinantov zníženej heteroplazmy T-buniek môže motivovať nové terapeutické stratégie pre mitochondriálne ochorenia, ktorým v súčasnosti chýbajú akékoľvek liečby schválené FDA.

Mootha dodal, že k mutáciám mtDNA dochádza aj spontánne počas normálneho starnutia. „Aj keď sa naša práca zameriavala na zriedkavé dedičné choroby, má potenciálne dôsledky aj na heteroplazmatickú dynamiku starnutia,“ povedal.

Štúdia bola financovaná nadáciou Marriott Foundation. Dodatočnú podporu poskytla rodina MacCurtainovcov, New York Stem Cell Foundation, National Institutes of Health, Klarman Cell Observatory a Howard Hughes Medical Institute.


Výsledky

Amplifikácia celých mitochondriálnych genómov a identifikácia predpokladaných mutácií udeľujúcich rezistenciu.

Amplifikovali sme, sekvenovali a porovnávali kompletné mitochondriálne genómy citlivých a rezistentných kmeňov T. urticae (GenBank EU345430, citlivý kmeň). Napriek tomu, že ide o jeden z najkompaktnejších mitochondriálnych genómov (13 103 bp), bolo zastúpených všetkých 13 génov kódujúcich proteín očakávané vo zvieracích mitochondriálnych genómoch a gény kódujúce ribozomálnu RNA S12 a S16 (obr. 1A). Porovnanie kompletných genómových sekvencií laboratórne selektovaného kmeňa rezistentného na bifenazát (prírastkové číslo GenBank EU5567754, BR-VL) s pôvodným neselektovaným kmeňom (LS-VL) ukázalo iba tri nukleotidové substitúcie, všetky nesynonymné, v cytochróm b (cytb) gén, čo vedie k substitúciám aminokyselín G126S, S141F a D161G (obr. 1B a Tabuľka 1). Cytochróm b je jedinou mitochondriálne kódovanou zložkou ubihydrochinón:cytochróm c oxidoreduktáza (cytochróm bc1, komplex III), ktorý katalyzuje prenos elektrónov z redukovaného ubichinónu na cytochróm cspojené s translokáciou protónov cez membránu. Porovnanie cytb porovnanie preložených sekvencií z citlivých a laboratórne rezistentných kmeňov s kmeňmi z niekoľkých modelových organizmov ukázalo, že tieto mutácie boli lokalizované v Qo oxidačné miesto proteínu, presnejšie v špirále cd1 vyrovnávajúcej kapsu enzýmu (8).

Cytb mutácie rezistencie v mitochondriálnom genóme. (A) Lineárne znázornenie mitochondriálneho genómu T. urticae (13 103 bp) ukazujúce polohu a orientáciu génov kódujúcich proteín (n = 13) a gény ribozomálnej RNA (n = 2). (B) Zarovnanie sekvencií konzervovaných Qo zvyšky vrecka umiestnené na cytochróme b z T. urticae s tými z S. cerevisiae (ABS28693), P. falciparum (NP_059668), Venturia inaequalis (AAC03553), Arabidopsis thaliana (CAA47966), Drosophila melanogaster (CAB91062), Gallus gallus (AAO44995) a Homo sapiens (AAX15094). Úplne konzervované zvyšky v zarovnaní sú označené čiernou farbou. Bodové mutácie spojené s rezistenciou na bifenazát v T. urticae sú označené trojuholníkmi.


Referencie

Wallace DC. Prečo stále máme mitochondriálnu DNA zdedenú po matke? Poznatky z evolučnej medicíny. Annu Rev Biochem. 200776:781–821.

Clayton DA. Replikácia a transkripcia mitochondriálnej DNA stavovcov. Annu Rev Cell Biol. 19917:453–78.

Shadel GS, Clayton DA. Udržiavanie mitochondriálnej DNA u stavovcov. Annu Rev Biochem. 199766:409–35.

Wai T, Teoli D, Shoubridge EA. Genetická prekážka mitochondriálnej DNA je výsledkom replikácie subpopulácie genómov. Nat Genet. 200840:1484–8.

Thundathil J, Filion F, Smith LC. Molekulárna kontrola mitochondriálnej funkcie v preimplantačných myších embryách. Mol Reprod Dev. 200571:405–13.

Smith LC, Thundathil J, Filion F. Úloha mitochondriálneho genómu pri preimplantačnom vývoji a technológiách asistovanej reprodukcie. Reprod Fertil Dev. 200517:15–22.

May-Panloup P, Chretien MF, Jacques C, Vasseur C, Malthiery Y, Reynier P. Nízky obsah mitochondriálnej DNA oocytov pri ovariálnej insuficiencii. Hum Reprod. 200520:593–7.

Barritt JA, Kokot M, Cohen J, Steuerwald N, Brenner CA. Kvantifikácia ľudských ooplazmatických mitochondrií. Reprod Biomed Online. 20024:243–7.

Wai T, Ao A, Zhang X, Cyr D, Dufort D, Shoubridge EA. Úloha počtu kópií mitochondriálnej DNA v fertilite cicavcov. Biol Reprod. 201083:52–62.

Sutovsky P, Van Leyen K, McCauley T, Day BN, Sutovsky M. Degradácia otcovských mitochondrií po oplodnení: dôsledky pre heteroplazmu, technológie asistovanej reprodukcie a dedičnosť mtDNA. Reprod Biomed Online. 20048:24–33.

Sutovsky P, Moreno RD, Ramalho-Santos J, Dominko T, Simerly C, Schatten G. Ubikvitinované mitochondrie spermií, selektívna proteolýza a regulácia mitochondriálnej dedičnosti v embryách cicavcov. Biol Reprod. 200063:582–90.

Šútovský P, McCauley TC, Šútovský M, Day BN. Včasná degradácia otcovských mitochondrií u domácej ošípanej (Sus scrofa) predchádza selektívnym proteazomálnym inhibítorom laktacystínu a MG132. Biol Reprod. 200368:1793–800.

Yu Y, Dumollard R, Rossbach A, Lai FA, Swann K. Redistribúcia mitochondrií vedie k výbuchom produkcie ATP počas spontánneho dozrievania myších oocytov. J Cell Physiol. 2010224:672–80.

Van Blerkom J. Mitochondriálna funkcia v ľudskom oocyte a embryu a ich úloha vo vývojovej kompetencii. Mitochondrie. 2010. doi:10.1016/j.mito.2010.1009.1012.

Yoon Y. Regulácia mitochondriálnej dynamiky: ďalší proces modulovaný signálmi Ca2+? Sci STKE. 20052005:pe18.

Motta PM, Nottola SA, Makabe S, Heyn R. Mitochondriálna morfológia v ľudských fetálnych a dospelých ženských zárodočných bunkách. Hum Reprod. 200015 (Suppl 2):129–47.

Anderson E, Albertini DF. Medzerové spojenia medzi oocytom a sprievodnými folikulovými bunkami vo vaječníku cicavca. J Cell Biol. 197671:680–6.

Johnson MT, Freeman EA, Gardner DK, Hunt PA. Na meiotické dozrievanie myších oocytov in vivo je potrebný oxidačný metabolizmus pyruvátu. Biol Reprod. 200777:2–8.

Kameyama Y, Ohnishi H, Shimoi G, Hashizume R, Ito M, Smith LC. Asymetrická alokácia mitochondriálnej DNA k blastomérom počas prvých dvoch štiepení u myších embryí. Reprod Fertil Dev. 201022:1247–53.

Ruiz-Pesini E, Lapena AC, Diez C, Alvarez E, Enriquez JA, Lopez-Perez MJ. Semenná kvalita koreluje s mitochondriálnou funkčnosťou. Clin Chim Acta. 2000300:97–105.

Spiropoulos J, Turnbull DM, Chinnery PF. Môžu mutácie mitochondriálnej DNA spôsobiť dysfunkciu spermií? Mol Hum Reprod. 20028:719–21.

Nakada K, Sato A, Yoshida K, Morita T, Tanaka H, ​​Inoue S, Yonekawa H, Hayashi J. Mužská neplodnosť súvisiaca s mitochondriami. Proc Natl Acad Sci USA. 2006103:15148–53.

Marin S, Chiang K, Bassilian S, Lee WN, Boros LG, Fernandez-Novell JM, Centelles JJ, Medrano A, Rodriguez-Gil JE, Cascante M. Metabolická stratégia kančích spermií odhalená metabolomickou charakterizáciou. FEBS Lett. 2003554:342–6.

Miki K, Qu W, Goulding EH, Willis WD, Bunch DO, Strader LF, Perreault SD, Eddy EM, O’Brien DA. Glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza-S, glykolytický enzým špecifický pre spermie, je potrebný pre pohyblivosť spermií a mužskú plodnosť. Proc Natl Acad Sci USA. 2004101:16501–6.

Gallon F, Marchetti C, Jouy N, Marchetti P. Funkčnosť mitochondrií rozlišuje ľudské spermie s vysokou a nízkou schopnosťou oplodnenia. Fertil Steril. 200686:1526–30.

Wallace DC. Mitochondriálne ochorenia u človeka a myši. Veda. 1999283:1482–8.

Cannon MV, Pinkert CA, Trounce IA. Xenomitochondriálne embryonálne kmeňové bunky a myši: modelovanie ľudskej mitochondriálnej biológie a choroby. Gene Ther Regul. 20042:283–300.

Cree LM, Samuels DC, de Sousa Lopes SC, Rajasimha HK, Wonnapinij P, Mann JR, Dahl HH, Chinnery PF. Redukcia molekúl mitochondriálnej DNA počas embryogenézy vysvetľuje rýchlu segregáciu genotypov. Nat Genet. 200840:249–54.

Jenuth JP, Peterson AC, Fu K, Shoubridge EA. Náhodný genetický drift v ženskej zárodočnej línii vysvetľuje rýchlu segregáciu mitochondriálnej DNA cicavcov. Nat Genet. 199614:146–51.

Cao L, Shitara H, Sugimoto M, Hayashi J, Abe K, Yonekawa H. Nové dôkazy potvrdzujú, že mitochondriálne úzke miesto sa vytvára bez zníženia obsahu mitochondriálnej DNA v skorých primordiálnych zárodočných bunkách myší. PLoS Genet. 20095:e1000756.

Wonnapinij P, Chinnery PF, Samuels DC. Predchádzajúce odhady variácií úrovne mutácie mitochondriálnej DNA nezohľadnili chybu pri odbere vzoriek: porovnanie genetického prekážku mtDNA u myší a ľudí. Am J Hum Genet. 201086:540–50.

Samuels DC, Wonnapinij P, Cree LM, Chinnery PF. Prehodnocovanie dôkazov o postnatálnej mitochondriálnej genetickej prekážke. Nat Genet. 201042:471–2 (odpoveď autora 472–3).

Trounce IA, Pinkert CA. Cybridné modely ochorenia a prenosu mtDNA z buniek na myši. Curr Top Dev Biol. 200777:157–83.

Vazin T, Freed WJ. Ľudské embryonálne kmeňové bunky: derivácia, kultúra a diferenciácia: prehľad. Restor Neurol Neurosci. 201028:589–603.

Stadtfeld M, Hochedlinger K. Indukovaná pluripotencia: história, mechanizmy a aplikácie. Genes Dev. 201024:2239–63.

Varum S, Momcilovic O, Castro C, Ben-Yehudah A, Ramalho-Santos J, Navara CS. Posilnenie pluripotencie ľudských embryonálnych kmeňových buniek prostredníctvom inhibície mitochondriálneho dýchacieho reťazca. Kmeňové bunky Res. 20093:142–56.

Armstrong L, Tilgner K, Saretzki G, Atkinson SP, Stojkovic M, Moreno R, Przyborski S, Lako M. Ľudské línie pluripotentných kmeňových buniek vykazujú obranné mechanizmy proti stresu a mitochondriálnu reguláciu podobné tým, ktoré majú ľudské embryonálne kmeňové bunky. Kmeňové bunky. 201028:661–73.

Prigione A, Fauler B, Lurz R, Lehrach H, Adjaye J. Dráha mitochondriálneho/oxidačného stresu súvisiaca so starnutím je potlačená v ľudských indukovaných pluripotentných kmeňových bunkách. Kmeňové bunky. 201028:721–33.

Suhr ST, Chang EA, Tjong J, Alcasid N, Perkins GA, Goissis MD, Ellisman MH, Perez GI, Cibelli JB. Mitochondriálne omladenie po indukovanej pluripotencii. PLoS One. 20105:e14095.

Ingraham CA, Pinkert CA. Vývojový osud mitochondrií mikroinjikovaných do myších zygot. Mitochondrie. 20033:39–46.

Spikings EC, Alderson J, St John JC. Prenos mitochondriálnej DNA po asistovanej reprodukcii a prenose jadra. Aktualizácia Hum Reprod. 200612:401–15.

Pinkert CA, Trounce IA. Produkcia transmitochondriálnych myší. Metódy. 200226:348–57.

Cohen J, Scott R, Alikani M, Schimmel T, Munne S, Levron J, Wu L, Brenner C, Warner C, Willadsen S. Ooplazmatický prenos v zrelých ľudských oocytoch. Mol Hum Reprod. 19984:269-80.

Barritt J, Willadsen S, Brenner C, Cohen J. Cytoplazmatický transfer v asistovanej reprodukcii. Aktualizácia Hum Reprod. 20017: 428–35.

St John JC, Lloyd RE, Bowles EJ, Thomas EC, El Shourbagy S. Dôsledky prenosu jadra na vývoj plodu cicavcov a prežitie potomstva. Mitochondriálna DNA perspektíva. Reprodukcia. 2004127:631–41.

Bredenoord AL, Pennings G, de Wert G. Ooplazmatický a jadrový prenos na prevenciu porúch mitochondriálnej DNA: koncepčné a normatívne problémy. Aktualizácia Hum Reprod. 200814:669–78.

Takeda K, Tasai M, Iwamoto M, Onishi A, Tagami T, Nirasawa K, Hanada H, Pinkert CA. Mikroinjekcia cytoplazmy alebo mitochondrií odvodených zo somatických buniek ovplyvňuje partenogenetický vývoj myších oocytov. Biol Reprod. 200572:1397–404.

Takeda K, Tasai M, Akagi S, Matsukawa K, Takahashi S, Iwamoto M, Srirattana K, Onishi A, Tagami T, Nirasawa K a kol. Mikroinjekcia sérovo vyhladovaných mitochondrií získaných zo somatických buniek ovplyvňuje partenogenetický vývoj hovädzích a myších oocytov. Mitochondrie. 201010:137–42.

McKenzie M, Trounce IA, Cassar CA, Pinkert CA. Produkcia homoplazmatických xenomitochondriálnych myší. Proc Natl Acad Sci USA. 2004101:1685–90.

Trounce IA, McKenzie M, Cassar CA, Ingraham CA, Lerner CA, Dunn DA, Donegan CL, Takeda K, Pogozelski WK, Howell RL a kol. Vývoj a počiatočná charakterizácia xenomitochondriálnych myší. J Bioenerg Biomembr. 200436:421–7.

Cannon MV, Dunn DA, Irwin MH, Brooks AI, Bartol FF, Trounce IA, Pinkert CA. Xenomitochondriálne myši: skúmanie mitochondriálnych kompenzačných mechanizmov. Mitochondrie. 201111:33–9.

Pinkert CA, Trounce IA, Liza AP, Eric AS. Generácia transmitochondriálnych myší: vývoj xenomitochondriálnych myší na modelovanie neurodegeneratívnych ochorení. Metódy v bunkovej biológii. 200780:549–69.

Pogozelski WK, Fletcher LD, Cassar CA, Dunn DA, Trounce IA, Pinkert CA. Sekvencia mitochondriálneho genómu Mus terricolor: porovnanie s Mus musculus domesticus a implikácie pre modelovanie xenomitochondriálnych myší. Gene. 2008418:27–33.

Pinkert CA, Smith LC, Trounce IA. Transgénne zvieratá: modifikácia mitochondriálneho genómu. In: Pond AW, Bell WG, redakcia. Encyklopédia vedy o zvieratách. 2. vyd. New York: Taylor & Francis 2010. s. 1044–6.

Fan W, Waymire KG, Narula N, Li P, Rocher C, Coskun PE, Vannan MA, Narula J, Macgregor GR, Wallace DC. Myší model mitochondriálnej choroby odhaľuje selekciu zárodočnej línie proti závažným mutáciám mtDNA. Veda. 2008319:958–62.

Pinkert CA. Technológia transgénnych zvierat: alternatívy v genotypizácii a fenotypizácii. Comp Med. 200353:126–39.


Absolútna kvantifikácia delécie heteroplazmatickej mitochondriálnej DNA pomocou multiplexného trojprimerového testu PCR v reálnom čase

Kvantifikácia mitochondriálnej DNA divokého typu a deletovanej mitochondriálnej DNA (mtDNA), ktorá koexistuje v tej istej bunke (aka heteroplazmia), je dôležitá pri mitochondriálnom ochorení a starnutí. Uvádzame vývoj multiplexného trojprimerového PCR testu, ktorý je schopný súčasne absolútne kvantifikovať divokú a deletovanú mtDNA. Molekulové majáky boli navrhnuté tak, aby hybridizovali s oboma typmi molekuly mtDNA, čo umožňuje detekciu v reálnom čase počas amplifikácie PCR. Test je špecifický a dokáže detegovať až šesť kópií mtDNA, vďaka čomu je vhodný pre jednobunkové analýzy. Relatívna štandardná odchýlka v počte prahových cyklov je približne 0,6 %. Heteroplazma bola kvantifikovaná v jednotlivých cytoplazmatických hybridných bunkách (cybridoch), obsahujúcich veľkú deléciu mtDNA, a vo vzorkách hromadných buniek. Jednotlivé cybridné bunky obsahovali 100-2600 kópií mtDNA divokého typu a 950-4700 kópií deletovanej mtDNA a percento heteroplazmy sa pohybovalo od 43 ± 16 do 95 ± 16 %. Priemerné množstvo celkovej mtDNA bolo 3800 ± 1600 kópií/cybridná bunka a priemerné percento heteroplazmy dobre korelovalo s objemovou vzorkou buniek. Jednobunková analýza tiež odhalila, že heteroplazmia v jednotlivých bunkách je vysoko heterogénna. Tento test bude užitočný na monitorovanie klonálnych expanzií delécií mtDNA a skúmanie úlohy heteroplazmy v heterogenite medzi bunkami v bunkových modeloch mitochondriálnych chorôb a starnutia.

Bibliografická poznámka


Mikroheteroplazma

V biológii, mikroheteroplazmy je forma heteroplazmy, typ mutačného poškodenia mitochondriálnej DNA. Zatiaľ čo heteroplazmia vo všeobecnosti zahŕňa mutácie prítomné v akejkoľvek frakcii mitochondriálnej DNA (od zlomkov percenta po takmer sto percent), mikroheteroplazmia je prítomnosť úrovní mutácií až do približne 2–5 % mitochondriálnych genómov. V ľudskej mitochondriálnej DNA predstavuje mikroheteroplazma stovky nezávislých mutácií v jednom organizme, pričom každá mutácia sa zvyčajne nachádza v 1–2 % všetkých mitochondriálnych genómov. [1]

Rozlíšenie mikroheteroplazmy a hrubšej heteroplazmy je dané technickými úvahami – klasické sekvenovanie DNA mitochondriálnej DNA pomocou PCR je schopné detegovať iba mutácie na úrovniach 10 % a viac, v dôsledku čoho mutácie na nižších úrovniach nikdy neboli systematicky pozorované až do práce Lin et al. [2]

Ako sa ukázalo po použití Linovej stratégie klonovania a sekvenovania, ktorá je schopná detegovať mutácie na úrovniach 1 % alebo menej, takáto nízkoúrovňová heteroplazmia alebo mikroheteroplazmia je mimoriadne bežná a je v skutočnosti najbežnejšou formou mutačného poškodenia. na ľudskú DNA doteraz nájdenú. U starších dospelých má každá kópia mitochondriálnej DNA v priemere 3,3 mutácií, ktoré menia štruktúru proteínu. To prevyšuje predchádzajúce odhady o viac ako tri rády.

Objav mikroheteroplazmy podporuje mitochondriálnu teóriu starnutia a už bol spájaný s príčinou Parkinsonovej choroby. [3]


Navrhovaný model starnutia srdca

Jadrom nášho modelu a hlavnou hnacou silou starnutia je heteroplazmia mtDNA (obrázok 2). U mladých ľudí so zdravým srdcom a kardiomyocytmi je účinnosť OXPHOS vysoká a úroveň mutácie mtDNA nízka (mutovaná mtDNA je reprezentovaná jedným alebo viacerými “X” na dvojvláknovej kruhovej DNA). Podľa tohto scenára funguje mitochondriálny životný cyklus na riedenie mutovaných kópií mtDNA pomocou MtDy a mitofágie. Tak sa to nazýva v našom modeli Cnostný cyklus. Jedným z hlavných kontrolórov mitofágie je os PINK/PARKIN/P62. Keď sú aktívne, sú inhibované a degradované dva represory mitochondriálnej biogenézy, PARIS a KEAP1, čím sa uvoľní transkripčný koaktivátor PGC-1α a transkripčný faktor NFE2L2, ktoré sú tiež aktivované AMPK - prostredníctvom zvýšeného pomeru AMP / ATP - a ROS. AMPK bude tiež inhibovať dráhu mTOR na vyvolanie mitofágie. Okrem toho zvýšený NAD + /NADH aktivuje SIRT1, ktorý tiež indukuje PGC-1α pre mitochondriálnu biogenézu. Akonáhle sa vytvoria autofagozómy, sú eliminované ich fúziou s lyzozómami alebo vypudené z bunky ako exosféry, aby boli pohltené makrofágmi. Posledne uvedený je nový mechanizmus opísaný len pre kardiomyocyty.

Obrázok 2. Navrhovaný model starnutia srdca. Jadrom nášho modelu a hlavnou hybnou silou starnutia je heteroplazmia mtDNA. Pri starnutí boli definované dva začarované cykly. Začarovaný cyklus č. 1 bude postupne zvyšovať úroveň heteroplazmy mtDNA a znižovať účinnosť OXPHOS v bode, ktorý ovplyvní mitofágiu a nastaví začiatok začarovaného cyklu č. 2, ktorý bude progresívne inhibovať mitochondriálnu biogenézu a antioxidačnú odpoveď v dôsledku inhibície PGC-1α a stimulácie a upregulácia NCoR1. V dôsledku toho sa budú hromadiť dysfunkčné mitochondrie, čím sa zvýši počet mitoflashov a patologických ROS, aby sa nakoniec spustilo otvorenie mPTP a uvoľnenie DAMP, aby sa iniciovala zápalová bunková odpoveď a apoptotický/nekrotický stimul. Okrem toho dôjde k metabolickému prechodu z oxidácie mastných kyselín na oxidáciu glukózy. Celkovo tieto udalosti vedú ku kardiovaskulárnym ochoreniam a zlyhaniu srdca. Na druhej strane u mladých ľudí nízka úroveň heteroplazmy mtDNA udrží účinnosť systému OXPHOS, ktorý zachová nízke pomery NAD + /NADH a AMP/ATP a fyziologické množstvo ROS. Tieto podmienky umožňujú cnostný cyklus, kde MtDy oddelí dysfunkčné mitochondriálne jednotky na degradáciu mitofágiou a aktivuje PGC-1α a NFE2L2 pre mitochondriálnu biogenézu. Je potrebné poznamenať, že srdcové bunky sú schopné vypudiť mitochondrie vo vezikulách nazývaných exosféry, ktoré sú degradované okolitými makrofágmi. V tomto modeli sme predpokladali, že uvoľňovanie exosféry, ktoré je závislé od autofagického mechanizmu, sa pri starnutí znižuje. Zatiaľ tiež nie je jasné, či sa pri starnutí srdca proteín MUL1 podieľa na mitofágii, ale ukázalo sa, že je pri poškodení srdca upregulovaný. Spolu s NCoR1 sa ukázalo, že ďalší transkripčný korepresor ako SMRT sa podieľa na starnutí.

Keďže heteroplazmia mtDNA presahuje 60 %, bude ovplyvnená replikácia a transkripcia mtDNA, čím sa zníži počet kópií mtDNA a proteíny potrebné na zostavenie dýchacieho reťazca, čo vedie k mitochondriálnej dysfunkcii a narušeniu mitofágie. V dôsledku toho sa dysfunkčné mitochondrie budú hromadiť v bunkách a potreby bunkovej bioenergetiky nebudú uspokojené, čo spôsobí ATP-krízu, bunkovú atrofiu alebo smrť, čo v konečnom dôsledku povedie k starnutiu a chorobám spojeným so starnutím. Choroby súvisiace so starnutím, ako je rakovina, cukrovka, srdcové choroby, svalová slabosť alebo atrofia, Alzheimerova choroba a Parkinsonova choroba, okrem iného, ​​sú spôsobené najmä stratou integrity mtDNA a zlyhaním mitochondriálneho životného cyklu. (biogenéza, MtDy, mitofágia). K dnešnému dňu bolo s ľudskými chorobami spojených viac ako 400 mutácií mtDNA, ako aj zníženie počtu kópií mtDNA a zníženie mitofágie (Tuppen et al., 2010 Li et al., 2019b). Mutácie mtDNA a heteroplazmia ovplyvnia výkon systému OXPHOS a znížia jeho účinnosť v dôsledku progresívnej straty zostavy a spojenia respiračného komplexu, čím sa generuje abnormálne množstvo ROS. Táto ROS bude produkovať viac mutácií mtDNA, čím sa postupne zvýši úroveň heteroplazmy mtDNA. Tento proces zodpovedá začarovanému cyklu č. 1 v našom modeli. ROS neovplyvňuje len mtDNA, ale aj proteíny a lipidy. Poškodí sa tak replikačný mechanizmus mtDNA, ako aj membránové proteíny a membránové fosfolipidy vrátane kardiolipínu. V tomto ohľade je proteín ANT spojený so zvýšenou tvorbou mitoflash (prechodná mitochondriálna depolarizácia), ktorá oddeľuje syntézu ATP od elektrónového transportného reťazca a generovania ROS. Za týchto podmienok je mPTP náchylný na otvorenie, kolaps mitochondriálnej funkcie, uvoľnenie mtDNA a iných DAMP a spustenie zápalovej reakcie a bunkovej smrti. Súčasne nadmerné množstvo ROS inhibuje os PINK/PARKIN/P62, čo znamená, že PARIS a KEAP1 budú aktívne a potom NFE2L2 a PGC-1α neaktívne. Potom sa mitochondriálna biogenéza zníži. Okrem toho inhibícia osi PINK/PARKIN/P62 aktivuje NCoR1, ktorý zase blokuje PGC-1α a mitochondriálnu biogenézu. Toto sa nazýva začarovaný kruh No2. Keď sa mitofágia zníži, očakáva sa, že je ovplyvnené aj uvoľňovanie exosféry, pričom sa v cytosóle hromadí mnoho dysfunkčných mitochondrií náchylných na uvoľňovanie väčšieho množstva DAMP a na vyvolanie bunkovej smrti. Ďalšou dôležitou črtou starnutia je metabolický prechod z oxidácie mastných kyselín na oxidáciu glukózy, daný inhibíciou NFE2L2 a PGC-1α, ktoré zvyšujú reguláciu oxidácie mastných kyselín a antioxidačné gény, a aktiváciou NCoR1, ktorá znižuje lipogénnu aktivitu. a ketogénne gény, ako aj antioxidačné gény. Všetky tieto metabolické zmeny vyskytujúce sa pri starnutí majú svoj začiatok v heteroplazmatickej mtDNA a ich konečným dôsledkom sú dysfunkčné a hypertrofické kardiomyocyty vedúce k zlyhaniu srdca.


Dodatočný súbor 1

: Obrázok S1 Prehľad množiny údajov. Prehľad súboru údajov pre každý klad (pomenovaný ako v Peter et al. 2018) pre počet izolátov so sekvenovaným genómom, kompletnými zostavenými CDS a neredundantnými profilmi. Obrázok S2 Genetická diverzita jadrových a mitochondriálnych génov pre tri druhy kvasiniek. Distribúcia hodnôt π mitochondriálnych a jadrových proteínov kódujúcich gény pre S. cerevisiae a ďalšie dva druhy kvasiniek, Lachancea kluyveri a Lachancea thermotolerans. S. cerevisiae genetická diverzita je vyššia v mitochondriálnom genóme v porovnaní s jadrovým genómom na rozdiel od týchto dvoch Lachancea druh. Obrázok S3 Medzikladové vzdialenosti pre domestikované a divoké línie. Ružové bodky predstavujú vzdialenosti medzi izolátmi patriacimi k domestikovaným kladom, zelené bodky predstavujú vzdialenosti medzi izolátmi patriacimi k divokým kladom. Mitochondriálne rozdiely v divokých kladoch sa nezväčšujú s jadrovou vzdialenosťou. Domáce klady vykazujú vyššiu diverzitu pri nižších jadrových vzdialenostiach v porovnaní s divokými kladmi. Obrázok S4 Rozptylový graf percent CDS SNP v rámci kladov. Svetlosivé bodky predstavujú vzdialenosti medzi izolátmi patriacimi do odlišných kladov, zatiaľ čo tmavosivé bodky predstavujú vzdialenosti medzi izolátmi patriacimi do rovnakého kladu. Tmavosivé bodky zakrúžkované čiernou farbou predstavujú izoláty patriace do kladu zmiešaného pôvodu. Čiara predstavuje ekvivalenciu medzi týmito dvoma vzdialenosťami. Bodky pod čiarou predstavujú izolované páry, ktorých mitochondriálna vzdialenosť je menšia ako genómová vzdialenosť. Klad so zmiešaným pôvodom má vyššiu variáciu v genómovom CDS ako mitochondriálny CDS. Použili sa iba izoláty s úplnými údajmi CDS (N.=353). 5. Obrázok S5 Porovnanie 8-génových sietí pre mitochondriálne a jadrové sekvencie. Vysoko divergentné línie (AMH –Taiwanské- a BAG –CHNII-) sa skoro nerozvetvujú ani v mitochondriálnej sieti (a), ani v mitochondriálnom susednom strome (b), pretože ich sekvenčná diverzita nie je vyššia ako typická mitochondriálna . Mixed origin clade isolates confirm a much lower level of nuclear similarity (c and d) compared to the mitochondrial one, in which case their sequences are virtually identical. Finally, three isolates belonging to somehow related clades (BLG -Wine/European-, CCL - Mediterranean oak- and AQM -French Dairy-), while remaining related also in the mitochondrial network, are located further apart (a). Obrázok S6 Frequency of different COX1 introns. The heatmap shows the frequency of the COX1 introns across the S. cerevisiae nuclear clades. Black cells indicate presence in >90% the isolates, white cells indicate <10% in the clade. Obrázok S7 Frequency of SNPs at the exon/intron boundary for COX1 and COB genes. Intron/exon boundaries of COX1 (black dots) are enriched for high frequency minor alleles compared with COB intron/exon boundaries (grey dots). Obrázok S8 Mitochondrial genome size variation. Size of all genetic elements located on the 250 circularized assemblies, grouped by clade (as described in Peter et al. 2018). Figure S9 Mitochondrial genome size variation is driven by introns and intergenic regions. Correlation between the length of the mt genome and the cumulative size of the (a) CDS, (b) introns (p-value 1.33e-47), (c) intergenic regions (p-value 4.05e-50), (d) intergenic regions and introns. Figure S10 Structural variation in mitochondrial genomes. Dotplots comparison between the reference genome and the mitochondrial assembly of 4 isolates showing different large inversions. Figure S11 Copy number of mtDNA across clades. The copy number is calculated as ratio with nuclear genome, to subtract variation derived by the ploidy. Mitochondrial genome copy number is relatively uniform (median


Pozri si video: FINANČNÁ MATEMATIKA - počítame ÚROKOVÚ MIERU % (November 2022).