Informácie

Prečo warfarín znižuje biologickú aktivitu proteínu C?

Prečo warfarín znižuje biologickú aktivitu proteínu C?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Warfarín inhibuje VKOR. Preto narúša závislosť od vitamínu K. $ gamma $-karboxylácia Fc-II, VII, IX, X.

Čo však presne robí s proteínom C a proteínom S? Ako to ovplyvňuje aj antikoagulačný systém?

[Ref. Kim, Yesel a Oh Young Bang. "Paradoxný prokoagulačný účinok včasných dávok warfarínu: možná úloha perorálneho antikoagulancia bez vitamínu K u pacientov s mozgovou príhodou spojenou s predsieňovou fibriláciou." Journal of stroke zv. 17,2 (2015): 216-8. doi:10.5853/jos.2015.17.2.216

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4460341/]

Nemohol som nájsť článok o mechanizme tejto inhibície. Akákoľvek pomoc bude ocenená.


Prečo warfarín znižuje biologickú aktivitu proteínu C? - Biológia

Štúdium bielkovín a čistenie bielkovín

Prečo študovať proteíny. Štúdium bielkovín a ich funkcie je kľúčové pre pochopenie buniek a organizmov. Nasleduje niekoľko dôvodov, prečo sú proteíny dôležité v biológii:

  • slúžia ako katalyzátory, ktoré udržujú metabolické procesy v bunke,
  • slúžia ako štrukturálne prvky vnútri aj mimo bunky,
  • sú to signály vylučované jednou bunkou alebo uložené v extracelulárnej matrici, ktoré rozpoznávajú iné bunky,
  • sú to receptory, ktoré do bunky prenášajú informácie o extracelulárnom prostredí,
  • slúžia ako intracelulárne signálne zložky, ktoré sprostredkovávajú účinky receptorov,
  • sú kľúčovými súčasťami mechanizmu, ktorý určuje, ktoré gény sú exprimované a či sú mRNA translatované do proteínov,
  • podieľajú sa na manipulácii s DNA a RNA prostredníctvom procesov, ako sú: replikácia DNA, rekombinácia DNA, spájanie alebo úpravy RNA.

Funguje in vitro. Vzhľadom na tieto dôležité úlohy je často cenné vedieť izolovať a čistiť proteín. Táto schopnosť izolovať a študovať vyčistený proteín leží v srdci väčšiny modernej biochémie. Ak je možné izolovať a purifikovať proteín, možno ho študovať izolovane od iných proteínov a podrobne študovať jeho enzymológiu alebo signalizačnú schopnosť. Práve táto schopnosť nezávisle izolovať proteíny a študovať ich jednotlivo alebo v zmesiach s úplnou kontrolou ich prostredia (soľ, teplota, pH atď.), je jadrom práce in vitro. Aj keď tento prístup in vitro možno jednoznačne doplniť genetickými prístupmi a prístupmi in vivo, v repertoári experimentálneho dizajnu, ktorý má moderný biológ k dispozícii, ho skutočne nenahradí.

Hodnota purifikácie proteínu. Okrem toho existuje niekoľko dôležitých dôvodov na čistenie bielkovín a ich stručný zoznam môže slúžiť na zdôraznenie toho, prečo jednotlivci pri tomto úsilí trávia toľko času a úsilia:

  1. Purifikáciou proteínu možno jasne stanoviť, že konkrétna biologická aktivita (enzymatická aktivita, signalizačná kapacita atď.) skutočne spočíva v jedinečnom proteíne.
  2. Purifikované proteíny slúžia ako mimoriadne cenné biochemické činidlá. Je pozoruhodne cenné mať možnosť získať napríklad purifikované rastové faktory alebo hormóny, proteázy, DNA polymerázy, reverzné transkriptázy, ligázy, fosfatázy alebo protilátky, ktoré rozpoznávajú konkrétny požadovaný epitop.
  3. Akonáhle je proteín purifikovaný, je možné študovať jeho enzymológiu, porozumieť jeho afinite k konkrétnym substrátom alebo rozobrať jeho schopnosť katalyzovať enzymatické reakcie. Takéto prístupy nám umožnili pochopiť, ako môžu biologické molekuly pôsobiť ako katalyzátory v metabolických procesoch alebo ako prevodníky, ktoré premieňajú chemickú energiu na iónové gradienty alebo mechanické sily.
  4. Dostupnosť purifikovaných proteínov umožňuje bioorganickým chemikom modifikovať špecifické zvyšky, aby pomohli porozumieť tomu, ako tieto zvyšky dodávajú konkrétne štruktúry alebo umožňujú proteínu fungovať ako katalyzátor.
  5. Purifikované proteíny môžu byť sekvenované buď Edmundovou degradáciou, ktorá získa sekvenčnú informáciu z N-koncovej sekvencie proteínu alebo peptidu odvodeného od proteínu. Tento prístup sa rýchlo nahrádza hmotnostnou spektroskopiou. Informácie o sekvencii je možné použiť na návrh sond na izoláciu cDNA a tieto informácie je možné použiť na odvodenie primárnej sekvencie celého proteínu. MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight) je technológia, ktorá môže poskytnúť veľa informácií o proteíne, aj keď sú k dispozícii iba malé množstvá.
  6. Čiastočne purifikované proteíny je často možné identifikovať na základe fragmentov generovaných ionizáciou proteínov alebo peptidov z nich odvodených a hmotnostnou spektroskopiou. Web zameraný na hmotnostnú spektroskopiu nájdete tu. 'PROWL', web spoločnosti Rockefeller, obsahuje protokoly, softvér a odkazy na užitočné databázy na analýzu bielkovín.
  7. Tradičné štúdie štruktúry a funkcie sa stali pozoruhodne silnejšími vďaka schopnosti izolovať a čistiť nielen konvenčné enzýmy, ale aj mutantné formy týchto proteínov. S príchodom miestne cielenej mutagenézy a expresných systémov, ktoré budú prediskutované v ďalšej časti o klonovaní cDNA, je možné produkovať a purifikovať proteín v podstate s akoukoľvek požadovanou mutáciou. To umožňuje testovanie širokého spektra hypotéz, ako aj návrh "vylepšených" proteínových molekúl.
  8. Pomocou genetického inžinierstva je možné vytvoriť nové proteíny alebo kombináciu proteínových prvkov, ktoré môžu slúžiť konkrétnej funkcii.
    • Napríklad je možné kombinovať oblasť jedného proteínu, ktorá je schopná aktivovať transkripciu, s oblasťou iného proteínu, ktorá rozpoznáva konkrétne miesto na DNA, čím vzniká nový proteín viažuci DNA. Toto je základ dvoch hybridných obrazoviek, o ktorých sa hovorí v inej časti.
    • Je dokonca možné modifikovať proteíny tak, aby sa mohli zvýšiť obzvlášť žiaduce charakteristiky, ako je tepelná stabilita alebo odolnosť voči proteázam.
  9. Ak je možné purifikovať proteín s konkrétnou enzymatickou aktivitou alebo signálnou schopnosťou, slúži to ako dôležitá indikácia fungovania biologických systémov. Dôkaz, že bunka obsahuje konkrétnu metabolickú cestu, sa dramaticky zlepšuje izoláciou enzýmov, ktoré katalyzujú zložky tejto dráhy. Izolácia konkrétneho polypeptidového rastového faktora môže byť silnou indikáciou toho, ako organizmus reguluje konkrétne bunkové alebo tkanivové procesy, ako je angiogenéza. Naše chápanie angiogenézy je napríklad dramaticky vylepšené izoláciou proteínu VEGF, ktorý stimuluje tvorbu kapilár. Podobne pochopenie toho, ako sa rastový kužeľ môže pohybovať v tele, aby vytvoril vhodné spojenia, sa dramaticky zlepší, keď sa izolujú a vyčistia molekuly schopné kolapsu rastového kužeľa (kolapsín).
  10. Akonáhle je proteín izolovaný, je možné produkovať činidlá (protilátky), ktoré sú schopné určiť umiestnenie tohto proteínu in vivo, čo môže poskytnúť dôležitú podporu pre zaujímavé hypotézy a vyvrátiť nesprávne špekulácie.
  11. Pochopením vzťahov medzi štruktúrou a funkciou proteínov je často možné navrhnúť špecifické činidlá, ktoré možno použiť na testovanie funkcie proteínu in vivo.
    • Napríklad pochopenie spôsobov, akými môžu byť G-proteíny mutované tak, že proteín môže byť buď aktívny (vždy zapnutý), alebo nemôže byť niekedy aktivovaný (konštitutívne vypnutý), umožňuje biológom preskúmať úlohu týchto jednotlivých proteínov in vivo. (Možno už viete, že G proteíny viažu GTP a GDP a pôsobia ako molekulárne prepínače a že väzba na GTP je „zapnutá“, zatiaľ čo hranica GDP je „vypnutá“). Mnohé z týchto myšlienok a ich štruktúrny základ boli vypracované s proteínom nazývaným ras, ale následne sa izolovalo mnoho desiatok podobných proteínov (napr. rac a rho) a všetky fungujú podobným mechanizmom! Porozumenie jednému teda oveľa ľahšie porozumie ostatným a rýchlo uvidíte dôležité otázky a urobíte správne experimentálne rozhodnutie. Zo znalosti ras je možné predpovedať špecifické mutácie, ktoré by mohli spôsobiť konštitutívne rac, a tieto predpovede sú správne.
    • Podobne pochopenie toho, ako proteíny viažuce DNA rozpoznávajú sekvencie DNA, nám umožňuje: (1) porozumieť významu konkrétnych mutácií DNA, (2) navrhnúť proteíny, ktoré dokážu rozpoznať modifikované sekvencie DNA alebo rozpoznať známu sekvenciu DNA a (3) navrhnúť mutantné proteíny, ktoré interferujú s aktivitou proteínov normálne prítomných v bunke. Napríklad, ak má proteín motív bHLH (základný Helix Loop Helix), je možné dobre predpovedať, ktoré sekvencie interagujú s DNA a aké mutácie môžu brániť väzbe proteínu na DNA alebo ktoré sekvencie môžu súťažiť s endogénnymi proteínmi. pre väzbu DNA.
  12. Nakoniec, zvyšujúca sa sila rôntgenovej difrakcie * a 2-D NMR na určenie štruktúry proteínu vyžaduje dostupnosť väčších množstiev purifikovaných proteínov. Pochopenie štruktúry 3-D proteínu nám začalo umožňovať porozumieť tomu, ako je kontrolované skladanie proteínov, a poskytlo pozoruhodný pohľad na spôsob, akým proteíny pôsobia in vivo. Schopnosť vizualizovať iónový kanál, dokonca aj pri nízkom rozlíšení, musí navždy zmeniť spôsob, akým vedec rozumie toku iónov cez membrány. Podobne pochopenie toho, ako proteíny rozpoznávajú špecifické sekvencie DNA, mení spôsob, akým naša komunita chápe transkripčnú aktiváciu alebo represiu. Vplyv tohto typu 3-D obrazu proteínu nemôže pomôcť, ale môže mať dramatický vplyv na spôsob, akým si predstavujeme biologické procesy.
    • Stanovenie novej proteínovej štruktúry je dôležitým krokom. Na použitie oboch metód musí byť k dispozícii veľké množstvo čistého proteínu. Na účely kryštalografie je potrebné pripraviť proteínové kryštály * a analyzovať informácie o defrakcii. Interpretácia týchto údajov vyžaduje vyriešenie problému s fázou, čo zvyčajne znamená získanie ďalších údajov o vzorci defrakcie proteínu, ktorý obsahuje ťažký kov. Táto stránka poskytuje podrobnejšiu diskusiu o difrakcii a kryštalografii.
    • 2D-NMR sa vyhýba potrebe vytvoriť kryštál, ale tento prístup je obmedzený na menšie proteíny (menej ako asi 20 000 až 50 000 daltonov) a vyžaduje starostlivú analýzu komplexného súboru údajov. Popis teórií a praktických problémov v NMT nájdete na týchto stránkach: 1, 2.
  13. Pochopenie toho, ako sa konkrétne aminokyselinové zvyšky podieľajú na funkcii proteínu, najmä ak je kombinované so znalosťou 3-D štruktúry proteínu, pomáha pochopiť, ako sa konkrétne sekvencie v proteínoch podieľajú na biologických funkciách. Akumulácia tohto typu poznatkov odvodených zo štúdia proteínov v kombinácii s obrovským množstvom informácií v databázach DNA umožnila konštrukciu toho, čo by sa dalo najlepšie nazvať „deskriptormi proteínov“. Tieto deskriptory môžu pozostávať buď z konkrétnej konzervovanej sekvencie aminokyseliny v primárnej sekvencii, alebo z konkrétneho vzoru distribuovaných aminokyselín v proteíne. Tieto deskriptory je často možné rozpoznať pomocou primárnej sekvencie proteínu, ale pochopenie toho, ako môže konkrétny deskriptor fungovať v skutočnom proteíne, môže dramaticky zvýšiť hodnotu takého deskriptora. Napríklad pre pochopenie enzymológie proteolýzy a dôležitosti katalytickej triády asp-hisiser sa oplatí hľadať vzorec v nových aminokyselinových sekvenciách. Schopnosť predpovedať, že konkrétna sekvencia aminokyselín pravdepodobne vytvorí alfa-skrutkovicu alebo náhodnú cievku, môže byť dôležitá pre pochopenie vlastností a často funkcie proteínu. Vizualizácia biologickej distribúcie leucínových zvyškov v „leucínovom zipse“ robí tento vzor leucínových opakovaní veľmi zaujímavým. Uvedomenie si, že mnohé z proteínov s „motívom zinkového prsta“ sú transkripčné faktory, často poskytne vodítko k funkcii proteínu.
  14. Hoci sa purifikované proteíny často študujú v purifikovaných systémoch (in vitro), príchod mikroinjekčných systémov umožňuje zavedenie purifikovaných proteínov do jednotlivých buniek, kde je možné určiť ich biologickú aktivitu. Na rozdiel od systémov in vitro mikroinjekcia umožňuje zavedenie purifikovaného proteínu do bunky, kde môže interagovať s obrovským množstvom proteínov a štruktúr. Je možné študovať komplexné zmeny (napr. správanie buniek, tvar buniek, delenie buniek), ktoré nie je možné ľahko rekonštituovať in vitro. Je to rýchly spôsob zavedenia rôznych proteínov do rôznych typov buniek bez použitia expresného vektora. Tento typ štúdie, ktorý je medzi klasickými štúdiami in vivo a in vitro, by sa mohol nazývať „vivtro“. Je to dôležitý prístup k štúdiu funkcie bielkovín. Podobne je často možné študovať vplyv konkrétneho proteínu na vývoj alebo fyziologickú funkciu jeho zavedením do organizmu.
  15. Purifikácia proteínu môže tiež pomôcť vyčistiť požadovanú nukleovú kyselinu. Napríklad, ak sú hnRNA, snRNA proteíny purifikované, môžu byť purifikované spolu s asociovanou RNA a naviazaná RNA môže byť amplifikovaná. Stručne, kroky v tomto postupe sú: príprava purifikovaného komplexu proteín-RNA, purifikácia viazanej RNA, reverzný prepis, pridanie chvosta polynukleotidového promótora, PCR amplifikácia. RNA, ktoré sa špecificky viažu na purifikovaný proteín, môžu byť afinitne vybrané, amplifikované a sekvenované.

Logika čistenia bielkovín. Napriek zrejmej hodnote štúdia proteínov in vitro je pozoruhodné, ako často sa nedoceňuje logika čistenia proteínov. Začnem stručným popisom logiky čistenia proteínov a potom sa pokúsim túto logiku ilustrovať na dvoch konkrétnych príkladoch. Na izoláciu proteínu sú nevyhnutné dve veci:

  1. Po prvé, človek musí mať test na požadovaný proteín a
  2. Za druhé, človek musí mať rozumný zdroj tejto činnosti.

Testy. Test na proteín je jednoducho spôsob kvantitatívneho stanovenia množstva konkrétnej prítomnej aktivity. Testy môžu byť také rozmanité, ako sú biológovia kreatívni. Môžu byť také jednoduché ako:

  • meranie zmeny absorpcie, pretože NADPH sa oxiduje v spojenej reakcii,
  • zmena molekulovej hmotnosti proteínu, ktorý je proteázovaný,
  • posun označeného fragmentu DNA alebo RNA na gél,
  • schopnosť frakcie udržať značenú DNA na filtri vytvorením komplexu DNA proteín,
  • transformácia rádioaktívne označeného substrátu z chemikálie s jednou fyzikálnou vlastnosťou na chemikáliu s inou fyzikálnou vlastnosťou,
  • schopnosť stimulovať bunkovú smrť, schopnosť stimulovať proliferáciu buniek,
  • schopnosť stimulovať diferenciáciu buniek,
  • vplyv na vývoj in vivo, príp
  • akékoľvek iné merateľné množstvo.

Ako uvidíme nižšie, je nevyhnutné, aby bol zvolený akýkoľvek test, je dôležité, aby bol kvantifikovateľný a aby bol schopný určiť, či je v konkrétnej frakcii prítomná viac alebo menej požadovanej aktivity. Napriek tomu, že existuje takmer nekonečný počet testov, existujú dve kritériá, ktoré by sa mali použiť na posúdenie hodnoty akéhokoľvek testu:

  • Po prvé, test by mal byť experimentálne vhodný. To znamená, že by mal byť primerane citlivý a ľahko vykonateľný. Ak test nie je citlivý, znamená to, že človek by musel mať veľké množstvo aktivity, aby zistil, či bola prítomná alebo nie, a také veľké množstvá často nie sú k dispozícii. Podobne, ak test vyžaduje veľa dní na vykonanie, potom to bude hlavnou prekážkou v experimentálnom pokroku. Zdá sa, že je pravidlom prírody, že ak test na proteín trvá dlho, proteín je takmer vždy nestabilný alebo podlieha proteolýze, čo znemožňuje čistenie!
  • Za druhé, použitý test musí byť špecifický pre záujmovú aktivitu. Richard Kolodner, schopný biochemik, ktorý strávil veľkú časť svojej kariéry čistením bielkovín zapojených do bakteriálnej rekombinácie, to vyjadril parafrázou piesne Rolling Stones. Zvykol spievať „Nemôžeš vždy dostať to, čo chceš, ale ak sa veľmi snažíš, niekedy dostaneš to, za čo si testoval“. Preto je dôkladné zváženie zvoleného testu nevyhnutné pre dlhodobý vedecký úspech. Vysokoškolák pracujúci v laboratóriu známeho vedca raz vyčistil to, čo považoval za jednovláknový proteín viažuci DNA. Jeho testom bola schopnosť tohto proteínu silne sa viazať na jednovláknovú DNA, čo sa na prvý pohľad môže zdať ako rozumný test pre proteín, o ktorý sa zaujímal. Bohužiaľ, proteín, ktorého biologickou úlohou je viazať sa na RNA, sa môže majú tiež značnú väzbovú aktivitu na DNA. V jeho prípade to bolo izolované! Preto je vždy dôležité zvážiť špecifickosť konkrétneho testu a vyvinúť metódu na určenie funkcie proteínu in vivo, a nie extrapoláciu na jeho aktivitu in vitro. Tu je ďalší príklad. Enzým, ktorého primárnou funkciou in vivo je redukovať etanol na aldehyd, môže mať tiež schopnosť konvertovať retinol na retinaldehyd in vitro, pričom táto aktivita nemusí mať žiadny vplyv in vivo.

Zdroje. Za druhé, čistenie proteínu vyžaduje rozumný zdroj proteínu. Nie je ťažké pochopiť, že je jednoduchšie purifikovať proteín z bohatého zdroja ako z chudobného zdroja. Okrem toho bohatý zdroj pravdepodobne produkuje vyšší výťažok požadovaného proteínu. Voľba toho, aký východiskový materiál by sa mal vyskúšať, často určí úspech alebo neúspech čistenia. Napríklad izolácia acetylcholínového receptora, ktorý je v svaloch prítomný v extrémne malých koncentráciách, je náročná a extrémne ťažká úloha. Čistenie acetylcholínového receptora sa stáva oveľa jednoduchšou, aj keď stále náročnou úlohou, ak sa čistí od elektroplaxu elektrického lúča. Jeden z povrchov buniek v elektroplaxe je husto nabitý acetylcholínovým receptorom, čo výrazne uľahčuje jeho čistenie.

Vzhľadom na rozumný test a zdroj materiálu by malo byť možné vyčistiť všetky proteíny, pokiaľ je k dispozícii dostatok času, peňazí a trpezlivosti. Iste je možné, že úloha sa môže ukázať ako ťažká, pretože požadovaný proteín môže byť extrémne nestabilný. Môže byť extrémne citlivý na proteolýzu alebo môže byť ľahko denaturovaný, pozornosť k detailu často umožní tieto problémy prekonať. Problém identifikácie bohatého zdroja proteínu je často možné odstrániť nahradením umelého zdroja proteínu. Pokiaľ je možné získať cDNA kódujúcu proteín, proteín môže byť obvykle exprimovaný vo vysokých hladinách, čo dáva experimentátorovi bezprostrednú výhodu. Samozrejme, v mnohých prípadoch gén pre požadovaný proteín ešte nie je k dispozícii.

Stratégia a logika čistenia bielkovín. Na čistenie proteínu je potrebné začať s východiskovým materiálom a rozdeliť ho pomocou ktoréhokoľvek z veľkého množstva fyzikálnych alebo biochemických prístupov.Počiatočný materiál je možné rozdeliť na frakcie centrifugáciou, vyzrážaním soľou, väzbou na iónové stĺpce (iónovo-výmenná chromatografia *), rýchlostnou sedimentáciou *, rovnovážnou hustotou sedimentácie *, väzbou na afinitné kolóny *, separáciou podľa veľkosti kolón (pozri gélovú filtráciu chromatografia *), frakcionácia izoelektrickým zaostrovaním, jej schopnosť asociovať sa so známymi ligandmi alebo väzbovými partnermi alebo akákoľvek iná metóda dostupná experimentátorovi. Akonáhle je taká frakcionácia uskutočnená, záujmová aktivita by mala byť nájdená v niektorých frakciách, ale v iných nie. Za predpokladu, že aktivita nie je zničená procesom frakcionácie (predpoklad, ktorý je takmer vždy menší ako úplne správny), frakcionácia slúži na dva účely. Najprv odstráni kontaminujúci materiál a za druhé obohatí frakciu obsahujúcu záujmovú aktivitu. Obohatená frakcia sa potom môže podrobiť ďalšiemu kolu frakcionácie a postup sa môže opakovať. Ak možno presne určiť (testovať) množstvo aktivity a určiť celkové množstvo materiálu (zvyčajne proteínu) prítomného vo frakcii. Špecifická aktivita prípravku (t.j. aktivita prítomná vo frakcii delená celkovým množstvom materiálu vo frakcii) môže byť stanovená v každom stupni prípravy. Pri dobre navrhnutom purifikačnom postupe by každý krok frakcionácie mal viesť k odstráneniu kontaminačného materiálu (proteíny, nukleové kyseliny, lipidy a čokoľvek iné) a postupnému zvýšeniu špecifickej aktivity. Samozrejme, v reálnom svete dochádza nielen k nárastu konkrétnej aktivity, ale takmer vždy dochádza k strate celkovej aktivity. Maximalizácia obohatenia pri minimalizácii strát je cieľom každej schémy čistenia a vytvorenie dobrej schémy čistenia je často sériou kompromisov. Schéma čistenia môže byť zhrnutá v tabuľke čistenia*, ktorá sleduje všetky tieto čísla. Takáto tabuľka je dôležitá nielen pre formálne argumenty v článku, ale aj pre praktické rozhodnutia o tom, či konkrétny krok v schéme čistenia má zmysel (t. j. je to dobrá kombinácia obohatenia a výťažku?). Tento proces je samozrejme možné opakovať donekonečna, ale v ktorom bode je možné povedať, že proteín bol purifikovaný?

Kritériá čistoty. Klasickú odpoveď na túto otázku poskytuje myšlienka čistenia proteínu na konštantnú špecifickú aktivitu alebo čistenia na homogenitu. Purifikácia na konštantnú špecifickú aktivitu znamená, že špecifickú aktivitu frakcie nemožno zvýšiť ďalším čistením. V prísnom zmysle to znamená, že ďalšie pokusy o čistenie sú zbytočné, pretože jediným materiálom, ktorý vo frakcii zostáva, je materiál, ktorý je v skutočnosti zodpovedný za testovanú aktivitu. V záverečných fázach purifikácie by meranie špecifickej aktivity v kolóne malo viesť k konštantnému číslu, to znamená, že ak dôjde k zvýšeniu hladiny proteínu, malo by dôjsť k zodpovedajúcemu zvýšeniu hladiny aktivity. Toto klasické kritérium je teda v podstate negatívne, je to návrh, že vo frakcii, o ktorej tvrdíme, že je čistá alebo čistená, je prítomný malý alebo žiadny cudzí materiál na konštantnú špecifickú aktivitu. V skutočnosti človek nikdy nedosiahne čistotu. Dá sa len tvrdiť, že materiál má čistotu 90 %, 99 % alebo 99,99 %. Túto skutočnosť je potrebné mať na pamäti pri vytváraní vyhlásení o konkrétnom materiáli, ale dá sa účinne použiť na tvrdenie, že konkrétna aktivita spočíva v konkrétnom polypeptide alebo kombinácii polypeptidov alebo že existujú dve rôzne enzymatické aktivity (napr. DNA-polymeráza aktivita a aktivita exonukleázy) sa nachádzajú v rovnakom proteíne. Ak je možné preukázať, že dve činnosti sú frakcionované, naznačuje to, že môžu byť v rovnakom proteíne. Ak sa po opakovaných pokusoch nedajú oddeliť dve činnosti, argument sa stáva silnejším. Ak obidva súčasne frakcionujú s peptidom alebo so skupinou peptidov (podjednotky proteínového komplexu), potom je tento argument veľmi silný. Čistotu je možné samozrejme určiť iba z hľadiska toho, čo je možné detegovať. Ak sa nukleová kyselina nemeria, proteín môže byť čistý z hľadiska proteínu, ale môže obsahovať kontaminujúcu nukleovú kyselinu alebo kontaminujúci uhľohydrát. V niektorých prípadoch môže byť prítomnosť uhľohydrátu alebo nukleovej kyseliny skutočne základnou zložkou enzymatickej aktivity, a to je možné dôsledne stanoviť preukázaním, že pomer proteínu k nukleovej kyseline je tiež konštantný v celom kroku frakcionácie.

Často počujeme tvrdenie, že proteín je čistý, ak je na SDS géli alebo polyakrylamidovom géli* jediný pás (pozri SDS gél*). V tomto tvrdení je určitá pravda a určitá nepravda. Pokiaľ je na polyakrylamidovom géli detegovateľný jeden proteín, znamená to jednoducho, že v tejto frakcii nie sú prítomné žiadne ďalšie proteíny ekvivalentného zastúpenia. Ak jeden frakcionuje 10x, 100x alebo 10 000x viac proteínu, musia sa nakoniec nájsť kontaminujúce pásy. Čistenie je opäť kvantitatívnou otázkou. Podobne niektoré činnosti sú v skutočnosti kombináciou viac ako jedného proteínu (enzým môže mať mnoho podjednotiek), a preto akonáhle je aktivita purifikovaná do homogenity, purifikovaný prípravok by mal mať kombináciu polypeptidov alebo dokonca polypeptidov a nukleových kyselín v konkrétnej stecheometrii, ktorá sú potrebné pre ich enzymatickú aktivitu.

Všeobecnosť čistenia na konštantnú špecifickú aktivitu. Nakoniec je potrebné poznamenať, že tento druh logiky platí nielen pre čistenie proteínov. To isté platí pre frakcionáciu akejkoľvek inej látky, či už ide o lipid, alkaloid, psychotropnú látku, protirakovinové liečivo, uhľohydrát alebo vitamín. Schopnosť frakcionovať, merať množstvo celkového materiálu a identifikovať konkrétnu aktivitu je účinná vo všetkých aspektoch biologického a biomedicínskeho výskumu.

Frakcionácia proteínov a hodnota gélov SDS. Popis frakcionácie proteínov presahuje rámec tohto prehľadu. Zručnosť v tejto oblasti si vyžaduje znalosti chémie bielkovín a fyzikálnej biochémie. Aby sme pochopili logiku čistenia proteínov, je dôležité vedieť, že existuje široká škála prístupov, ktoré môžu oddeľovať proteíny na základe ich vlastností, vrátane veľkosti, tvaru, rýchlosti sedimentácie, schopnosti viazať sa na rôzne iónové skupiny, afinity k substrátom alebo pseudosubstráty, rozpustnosť, stabilita atď. Tieto vlastnosti sú pre rôzne proteíny rôzne. Medzi proteínmi je teda oveľa väčšia variabilita ako nukleové kyseliny.

Polyakrylamidové gély SDS poskytujú jednoduchý, ľahko prístupný a analytický nástroj, ktorý možno ľahko použiť na stanovenie proteínov prítomných v zmesi. Je to dôležité, pretože:

  • táto technika disociuje multimérne proteíny a oddeľuje peptidy podľa molekulovej hmotnosti (pozri záznam v slovníku na géloch SDS)
  • umožňuje odhad molekulovej hmotnosti každého peptidu
  • je citlivý (pri farbení pomocou Comassie Brilliant Blue je možné detegovať asi 0,1 mikrogramu a „strieborné farbenie“ je asi 100 -krát citlivejšie)
  • je citlivý na modifikáciu proteínu (glykozylácia a fosforylácia amp často menia mobilitu)
  • môže vyriešiť a umožniť vizualizáciu 50 alebo viacerých bielkovín
  • môže sa kombinovať s izotopovým značením na štúdium syntézy a obratu bielkovín
  • môže byť upravený tak, aby nasledoval antigény (pozri Western blot)
  • je to rýchle (dá sa to zvládnuť za deň)
  • ľahko sa učí a robí sa rovnakým spôsobom pre všetky proteínové zmesi
  • samozrejme denaturuje proteíny, takže biologická aktivita sa zvyčajne (ale nie vždy) stratí.

Ilustrácia strategických rozhodnutí a šťastia pri čistení bielkovín a prechode na klonovanie

Skvelým príbehom o dôležitosti úvah načrtnutých vyššie (a mostom ku klonovaniu) je, že čistenie 3 členov rodiny neurotrofínov NGF (nervový rastový faktor), BDNF (z mozgu odvodený neuronálny trofický faktor) a NT-3 ( neurotrofín 3). Tento príbeh pokrýva obdobie viac ako pol storočia, ale ilustruje dôležitosť výberu vhodného testu, vývoja vhodných testov a výberu vhodného zdroja na čistenie proteínu.

Biologický pohľad. Prvý dôkaz o existencii nervového rastového faktora, o ktorom je teraz známe, že je difúznym vylučovaným polypeptidom, ktorý zvyšuje nervové prežitie a nervovú diferenciáciu, sa začína pohľadom doktorky Rity Levi-Montalcini, ktorá v laboratóriu študovala neuroembryológiu Victora Hamburgera. Toto laboratórium skúmalo účinky transplantácie alebo odstránenia končatín kurčiat na vývoj nervového systému. Transplantované končatiny sa mohli nielen vyvíjať, ale mohli byť aj inervované a neuroanatomická práca ukázala zhodu medzi veľkosťou cieľa, ktorý má byť inervovaný (ktorý je možné zvýšiť transplantáciou alebo znížiť amputáciou) a počtom neurónov v príslušných orgánoch. miesto na inerváciu cieľa. Jedným z dôležitých príspevkov bolo pozorovanie, že transplantácia extra končatín zvýšila počet neurónov nielen v oblasti nervového systému, ktorá by inervovala tento cieľ, ale aj nervov, ktoré by neinervovali cieľ. To viedlo k domnienke, že môže existovať vylučovaný difúzny faktor, ktorý by mohol pôsobiť na diaľku a zvýšiť tak počet nervov. Šikovný experiment túto hypotézu potvrdil. Pridanie tkaniva (dokonca nádorového tkaniva) na chorioallantoickú membránu vyvíjajúceho sa slepačieho vajíčka viedlo k zvýšeniu počtu nervov vo vyvíjajúcom sa embryu. (Chorioalantoická membrána je membrána, ktorá oddeľuje vyvíjajúce sa embryo od vzduchovej kapsy vo vajci. Je priepustná pre plyny a malé molekuly, ale nie je priepustná pre bunky, takže nedochádza ku kontaktu medzi bunkou a bunkou). To ukázalo, že musí existovať faktor nejakého typu, ktorý riadi osud neurónov a Dr. Levi-Montalcini sa rozhodol tento faktor očistiť.

Lekcia jedna. V čase, keď sa tento príbeh začal, nebolo skutočne jasné, či faktorom, ktorý sa má čistiť, je proteín alebo nejaká iná forma molekuly. Ešte dôležitejšie je, že nebolo známe, či skutočnou biologickou aktivitou tohto faktora je zvýšenie počtu nervov, čo by bol najjednoduchší spôsob, ako vysvetliť problém alebo vplyv na prežitie neurónov. Nakoniec sa ukázalo, že účinkom nervového rastového faktora bolo kontrolovať množstvo bunkovej smrti, ktoré existovalo v neskorých obdobiach embryogenézy, a práve tento účinok na bunkovú smrť nakoniec spôsobil zvýšenie počtu neurónov a veľkosť zhluky neurónov (nazývané ganglia). Vytvorenie tohto mechanizmu pôsobenia NGF bolo jedným z najdôležitejších koncepčných vývojov modernej neurobiológie a poskytlo obrovský pohľad na pochopenie apoptózy. Až oveľa neskôr sa ukázalo, že nervový rastový faktor má v skutočnosti mnoho ďalších aktivít. V skorých neuroblastoch môže pôsobiť na podporu delenia av tomto zmysle je to klasický mitogénny faktor. Súčasná práca demonštruje účinky nervového rastového faktora na Schwannove bunky, čo sú neneurálne podporné bunky, ale myelinizované nervy v periférnom nervovom systéme. Pravdepodobne táto biologická aktivita mohla byť tiež cestou na čistenie nervového rastového faktora. V takom prípade by sme označovali nervový rastový faktor ako Schwannov bunkový faktor alebo nejaký iný príbuzný názov. Toto nie je vôbec nezvyčajná situácia. Rodina fibroblastových rastových faktorov má viacnásobné účinky na veľký počet rôznych tkanív, a preto prví dvaja členovia tejto rodiny, aFGF a bFGF, boli znova objavení a premenovaní vo viacerých laboratóriách a raná literatúra obsahuje najmenej 27 rôznych názvov týchto rastových faktorov. . Takže „dostanete to, na čo testujete“, ale to, čo získate, môže priniesť neočakávané prekvapenia.

Lekcia 2. Neuroanatomická analýza potrebná na stanovenie veľkosti ganglií a počtu prežívajúcich neurónov v gangliu. U vyvíjajúceho sa mláďaťa je to samozrejme časovo náročné a ťažkopádne. Pravdepodobne by takýto jav mohol slúžiť ako základ testu na rastový faktor, ale práca by určite pokračovala dosť pomaly.

Doktor Levi-Montalcini plne ocenil náročnosť použitia vyvíjajúceho sa mláďaťa ako testovacieho systému, ktorý sa rozhodol nájsť si čas na návštevu laboratória Dr. Carlosa Chagusa na univerzite v Brazílii v Rio de Janeiro, aby sa naučil tkanivovú kultúru. Toto laboratórium dokázalo vyvinúť metódy na izoláciu ganglií dorzálnych koreňov u mladých zvierat a umožnenie týmto gangliám prežiť v kultúre. Operácia potrebná na izoláciu ganglií dorzálnych koreňov (DRG) je relatívne priama a mnohé gangliá chrbtových koreňov je možné izolovať krátkym postupom. Ako hosťujúci vedec urobil Dr. Levi-Montalcini monumentálny objav, že kultivácia dorzálnych koreňových ganglií s typom nádoru nazývaným sarkóm-180 (alebo S-180) viedla k dramatickej morfologickej zmene DRG. DRG produkoval „halo“ procesov, ktoré pri ďalšej analýze jasne ukázali, že ide o predĺženia produkované neurónom. Toto bol dôležitý prielom nielen preto, že to naznačovalo niečo o molekule, ktorá sa skúmala v biologickom zmysle, ale tiež, a čo je možno dôležitejšie, pretože to poskytlo pohodlný test, ktorý by bolo možné použiť na čistenie proteínu.

Lekcia 3. Prechod na test DRG je dôležitý. Po prvé, je to pohodlné a dovolené vykonať testy rýchlo (jeden z charakteristických znakov dobrého testu), ale je to tiež dôležité, pretože ide o jemnú zmenu typu reakcie, ktorá sa testuje. Tento test je teraz hľadaním faktora predlžovania neuritov a takýto faktor sa môže alebo nemusí podieľať na zvyšovaní počtu neurónov počas vývoja. Nakoniec sa ukázalo ako pravdivé, že NGF má účinky na prežitie aj na expresiu diferencovaných vlastností, ako je rozšírenie neuritov, takže zmena v testovacom systéme sa ukázala ako náhodná. História určite mohla nabrať iný smer. Je možné, že existujú dva faktory, jeden sa podieľa na predlžovaní neuritov a druhý na prežití buniek. V tomto prípade by zmena v testovacích systémoch viedla k izolácii a purifikácii iba jedného z dvoch faktorov. V takom prípade mohlo byť rozhodnutie nasledovať a použiť ľahký test rozumnejšie, ale bolo to šťastie doktorky Levi-Montalcini a jej spolupracovníka, že za obe činnosti bola zodpovedná jediná molekula.

S týmto testom v ruke sa Dr. Levi-Montalcini rozhodol vyčistiť nervový rastový faktor zo sarkómu-180, ktorý bol nádorom, a preto mal výhodu v tom, že bol primerane homogénnym zdrojom záujmového faktora, ktorý je možné získať v relatívne veľkých množstvách. množstvo, čo je dôležité pri čistení bielkovín. Úroveň NGF v sarkóme-180 je bohužiaľ dosť malá, a tak obtiažnosť straty, s ktorou by ste sa stretli pri čistení zo zdroja, by bola pravdepodobne neprekonateľná na začiatku 50-tych rokov, keď bola technológia čistenia proteínov menej sofistikovaná než je dnes. Náhodne, alebo možno ako náznak toho, že veľké mysle identifikujú a sledujú produktívne línie výskumu, tento problém bol prekonaný vo fascinujúcej sérii udalostí. Na začiatku 50 -tych rokov bol jedným z prístupov k purifikácii proteínov čiastočná proteolýza tkaniva, ktorá pomohla solubilizovať proteíny. V tej dobe sa hadí jed často používal ako dobrý zdroj proteáz, a tak sa extrakty zo S-180 ošetrili proteázami získanými z hadieho jedu. Účtovníctvo požadované na monitorovanie purifikácie proteínu (t. J. Nasledujúca hladina proteínu a biologická aktivita) ukázalo, že proteolýza skutočne mala za následok podstatné zvýšenie biologickej aktivity. Kontroly však ukázali, že toto zvýšenie biologickej aktivity bolo zjavne dosiahnuté z hadieho jedu, ktorý bol v skutočnosti bohatším zdrojom faktora ako S-180. To viedlo k rozhodnutiu zmeniť zdroj čistenia z S-180 na hadí jed. Hadí jed bol bohatým zdrojom tohto faktora, nebolo však ľahké ho získať vo veľkom množstve a bol drahý. Preto bolo prijaté rozhodnutie preskúmať ďalšie tkanivá, ktoré by mohli súvisieť so žľazou zodpovednou za produkciu jedu. Ukázalo sa, že slinná žľaza myší bola bohatým zdrojom nervového rastového faktora, ktorý bolo možné získať oveľa jednoduchšie ako hadí jed. Experimentálna stratégia sa teda opäť zmenila na čistenie rastového faktora zo slinnej žľazy. Čistenie z bohatého zdroja je jednoduchšie.

Lekcia 4. Identifikácia bohatého zdroja aktivity rastového faktora bola dôležitým medzníkom v príbehu, pretože teraz zaviedla dve základné zložky purifikácie proteínu. Dr. Levi-Montalcini a jej spolupracovníci mali teraz primerane pohodlný test a bohatý zdroj NGF a táto kombinácia im umožnila vyčistiť faktor na homogenitu. Existujú dva zaujímavé pomocné príbehy, ktoré poskytujú dôležité lekcie z čistenia bielkovín.

  • Zaujímavou otázkou týkajúcou sa prechodu na myšacie slinné žľazy ako zdroj purifikácie NGF je otázka, či by bola identifikovaná rovnaká molekula, ak by sa pokračovalo v úsilí o purifikáciu od S-180. Počas osemdesiatych rokov sme (John Wagner a Pat D'Amore) zistili, že kyslý FGF je schopný spôsobiť rozšírenie neuritov v bunkách PC12, ktoré bolo na nerozoznanie od toho, ktoré spôsobuje NGF. Rozhodli sme sa znova preskúmať otázku, či sarkóm-180 môže skutočne produkovať kyslý FGF, a nie NGF. Extrakty Sarcoma-180 sa frakcionovali na heparínových afinitných kolónach a izolovali sa dva píky ekvivalentnej veľkosti, jeden, ktorý sa eluoval v polohe kyslého FGF a druhý, ktorý sa eluoval v polohe NGF! Je zaujímavé si myslieť, že ak bol sarkóm-180 zdrojom materiálu na čistenie NGF a bol vybraný skôr prvý vrchol ako druhý, molekula purifikovaná Dr. Levi-Montalcini a jej spolupracovníkmi by mohla byť molekula, ktorú teraz poznáme ako kyslý FGF.
  • Ďalší zaujímavý príbeh, ktorý pochádza z tejto línie výskumu, je objavenie epidermálneho rastového faktora (EGF). Akonáhle bol NGF purifikovaný, boli potrebné protilátky proti tomuto faktoru. Prípravky nervového rastového faktora sa injekčne podávali králikom, aby sa vytvorilo antisérum, ale jedným z účinkov tejto injekcie bolo, že deti narodené králikom, ktorým sa podali injekcie, predčasne otvorili oči. Doktor Cohen sa rozhodol použiť to ako test na monitorovanie biologickej aktivity a toto bola jedna z prvých indícií, ktoré viedli k identifikácii a čisteniu EGF. EGF je prvý purifikovaný rastový faktor, ktorý bol študovaný tak rozsiahlo ako klasický mitogén. Opäť získate to, za čo testujete.

Lekcia 5. Je poučné prečítať si niektoré z úvodných prác o čistení nervového rastového faktora (Varon et al Biochemistry 6: 2202 (1967) alebo Bocchini a Angeletti (PNAS 64: 787 (1969) alebo odkazy v týchto prácach) .Tieto články sú príkladmi klasického čistenia proteínov a oba diskutujú o dôkazoch, že biologická aktivita je v jednom proteíne. Počiatočné čistenie vyžadovalo mnoho purifikačných krokov a bolo dosť namáhavé, ale umožnilo vytvoriť štruktúru NGF.

Pochopenie a ocenenie štruktúry NGF umožnilo ďalším pracovníkom vyvinúť extrémne rýchle a účinné schémy čistenia bielkovín. Mobley a kol. vyvinuli rýchly dvojstupňový postup čistenia, ktorý môže viesť k vysokým koncentráciám nervového rastového faktora zo slinných žliaz (Biochemistry, 15:5543). Toto čistenie sa opiera o poznatky, že forma nervového rastového faktora pôvodne vylučovaného slinnými žľazami je komplexom medzi aktívnou formou rastového faktora (nazývaným beta NGF) a niekoľkými ďalšími molekulami proteínu. Tento komplex je známy ako 7S NGF. Ak sú extrakty vyrobené zo slinných žliaz a sú odstránené zvyšky, extrakty môžu prejsť cez CM-celulózovú kolónu (pre karboxymetyl) v kroku, ktorý neodstráni v podstate žiadny proteín (možno 2 %), a teda nedochádza k žiadnemu obohateniu NGF. Ak sa však frakcia z tejto kolóny upraví na nízke pH, určitý materiál sa vyzráža a 7S NGF disociuje za vzniku beta NGF. Ak sa roztok potom vráti na rovnaké podmienky pH a soli, aké sa použili v prvej frakcionácii na stĺpci, a prechádza cez druhú kolónu, beta NGF, na rozdiel od 7S NGF, sa teraz na kolónu prilepí, zatiaľ čo drvivá väčšina proteínov prejde cez. (Proteíny, ktoré by sa za týchto podmienok prilepili na kolónu, boli odstránené počas prvého kroku kolóny). Do druhého stĺpca sa prichytávajú iba dva proteíny, ktoré je možné izolovať postupným premývaním s vysokým pH a vysokou soľou. Druhým z týchto proteínov je NGF, ktorého čistota je vyššia ako 99 %.

Schéma čistenia vyvinutá Mobleyom a jeho kolegami je rýchla, pretože šikovne využíva známu štruktúru proteínu. Spolieha sa na tkanivo, kde je NGF prítomný v hojnom zdroji. Výsledkom je, že je možné purifikovať miligramové množstvá takmer homogénneho proteínu za menej ako týždeň. Je to oveľa rýchlejšie a jednoduchšie ako mnoho týždňov práce, ktoré boli potrebné na vykonanie počiatočného čistenia NGF.

Lekcia 6. Čistenie NGF je v značnom kontraste k čisteniu BDNF, ktoré sa neuskutočnilo skôr ako na začiatku 80. rokov. Rozhodnutie pokúsiť sa izolovať iný proteín, ktorý mal aktivitu podobnú NGF, bolo založené na zdravom biologickom argumente. V čase, keď sa začalo čistenie BDNF, bolo známe, že musia existovať ďalšie faktory, ktoré majú aktivity podobné NGF, ale majú odlišnú biologickú štruktúru. To bolo známe, pretože mnohé neuróny prešli obdobím prirodzene sa vyskytujúcej bunkovej smrti, zatiaľ čo iba niektoré populácie reagovali na NGF. Mnohým sa zdalo zrejmé, že musia existovať ďalšie faktory, ktoré riadia rozsah bunkovej smrti. Silvio Aaron (ten istý, ktorý bol prvým autorom vyššie diskutovaného článku o purifikácii NGF) ocenil, že v periférnom nervovom systéme bola aktivita nervového rastového faktora obmedzená na bunky, ktoré vylučovali katecholamíny (epineferín a norepinefrín), zatiaľ čo účinok na bunky, ktoré vylučujú acetylcholín. Rozhodol sa preto použiť podobnú stratégiu ako Dr. Levi-Montalcini, ale namiesto použitia DRG ako ganglia sa rozhodol študovať účinky proteínových extraktov na ciliárny ganglion a tento pohľad nakoniec viedol k čisteniu CNTF ( ciliárny neurónový trofický faktor), čo je samo o sebe mimoriadne zaujímavý príbeh, ale nebudem ho tu uvádzať.

BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) je názov pre neurotrofický faktor, ktorý bol prítomný v mozgu. Mozog má tú výhodu, že je dostupný v relatívne veľkých množstvách a z pohľadu biochemika by mohol byť vynikajúcim zdrojom aktivity rastového faktora. Mladý vedec Dr. Barde a jeho kolegovia sa rozhodli použiť mozog ako zdroj na čistenie neurotrofického faktora a ako test použili účinok mozgových extraktov na líniu neuroblastómu. Bol to pohodlný test, ale samozrejme vychádzal z predpokladu, že neuroblastóm, čo je transformovaná nervová línia, by bol dobrým testom na faktor, ktorý mal in vivo požadovanú biologickú aktivitu. Ako mladý vedec si doktor Barde vybral projekt, ktorý bol mimoriadne ťažký. V mozgu bola prítomná aktivita, ale aby ju vyčistil na homogenitu, musel použiť relatívne veľký počet krokov, ktoré v každom prípade zahŕňali značné straty. Musel vyčistiť BDNF viac ako miliónkrát, aby ho bolo možné identifikovať ako jeden pás po frakcionácii na 2-D géli! Získal len malé množstvo materiálu, ktorý by bol pre väčšinu biochemických štúdií nepoužiteľný (EMBO 1: 549), ale vlna objavov zaviedla do biologického výskumu rekombinantnú technológiu. Namiesto čistenia BDNF z mozgu a skúmania jeho biologickej aktivity sa táto skupina rozhodla izolovať cDNA pre BDNF a vyčistiť molekulu z rekombinantných zdrojov. Toto rozhodnutie slúži ako úvod do našej ďalšej časti, kde budeme hovoriť o dôležitosti klonovania cDNA, ale v tejto kapitole význam klonovania BDNF skutočne spočíva v skutočnosti, že expresia BDNF v umelých systémoch poskytla týmto výskumníkom bohatý zdroj BDNF, kde bol BDNF prítomný v relatívne vysokých koncentráciách. Umožnilo im to rýchlo purifikovať BDNF a študovať jeho biologické účinky. Okrem toho klonovanie BDNF a preukázanie, že exprimovaný proteín má biologickú aktivitu, bolo silným dôkazom toho, že správna molekula bola purifikovaná a klonovaná. Ide o netradičný dôkaz, že v určitom proteíne možno nájsť biologickú aktivitu, ale je presvedčivý. Aby to bolo presné, musí sa kombinovať s klasickými dôkazmi (napr. môže sa stať, že klonovaná molekula je len časťou biologickej aktivity alebo to môže byť regulačná molekula, ktorá aktivuje expresiu skutočnej aktivity atď.). Vďaka týmto technologickým objavom sa história BDNF určite posunula oveľa rýchlejšie ako história NGF.

Posledná lekcia a most k stratégii klonovania cDNA. CDNA kódujúca BDNF predpovedala proteín, ktorý bol veľmi homológny s NGF. BDNF by teda mohol byť považovaný za člena rodiny rastových faktorov NGF. Porovnanie NGF a BDNF ukázalo, že existujú oblasti so silnou homológiou a oblasti, kde boli proteíny menej konzervované. Za predpokladu, že tieto oblasti so silnou homológiou môžu byť prítomné aj v iných členoch rodiny, ak by takíto iní členovia skutočne existovali, je možné navrhnúť stratégiu na izoláciu cDNA pre iných členov rodiny založenú čisto na primárnej štruktúre hypotetického proteínu. a jeho cDNA (do tejto doby bola cDNA pre NGF izolovaná pomocou oligonukleotidovej sondy generovanej na základe známej sekvencie, ako je popísané inde).

Vyberaním oblastí homológie a vykonaním PCR medzi nimi sa vytvorili produkty zodpovedajúce NGF aj BDNF, ale existoval aj iný produkt, ktorý by sa mohol použiť ako sonda na skríning novej cDNA. Táto stratégia viedla k izolácii novej cDNA a zodpovedajúceho proteínu extrémne rýchlym spôsobom a s dramaticky menším úsilím, ako bolo potrebné na získanie NGF alebo BDNF (Hohn a kol., Nature, 344-399 (1990)). Tretí člen rodiny neurotrofínov, ktorý bol pokrstený ako NT-3. Pretože bolo možné izolovať cDNA pre NT-3, nebolo nikdy potrebné prejsť náročným procesom čistenia z prirodzene sa vyskytujúcich zdrojov.


Molekulárna bunková biológia. 4. vydanie.

Vývoj a funkcia organizmu je z veľkej časti riadená génmi. Mutácie môžu viesť k zmenám v štruktúre kódovaného proteínu alebo k zníženiu alebo úplnej strate jeho expresie. Pretože zmena v sekvencii DNA ovplyvňuje všetky kópie kódovaného proteínu, mutácie môžu byť obzvlášť škodlivé pre bunku alebo organizmus. Na rozdiel od toho, akékoľvek zmeny v sekvenciách molekúl RNA alebo proteínov, ktoré sa vyskytujú počas ich syntézy, sú menej závažné, pretože sa syntetizuje veľa kópií každej RNA a proteínu.

Genetici často rozlišujú genotyp a fenotyp organizmu. Presne povedané, celý súbor génov nesených jednotlivcom je jeho genotyp, zatiaľ čo funkcia a fyzický vzhľad jednotlivca sa označuje ako jeho fenotyp. Tieto dva termíny sa však bežne používajú v užšom zmysle: genotyp zvyčajne označuje, či jedinec nesie mutácie v jedinom géne (alebo malom počte génov) a fenotyp označuje fyzické a funkčné dôsledky tohto genotypu.


Prečo warfarín znižuje biologickú aktivitu proteínu C? - Biológia

Na pomoc pri vyšetrovaní príčiny krvnej zrazeniny (tromboembólie), ako je hlboká žilová trombóza (DVT) alebo pľúcna embólia (PE), aby ste zistili, či môžete mať nedostatok proteínu C alebo proteínu S

Keď ste mali nevysvetliteľnú krvnú zrazeninu, najmä ak nemáte klasické rizikové faktory, máte krvnú zrazeninu v mladom veku (mladší ako 50 rokov) alebo na nezvyčajnom mieste, keď má váš novorodenec závažnú poruchu zrážanlivosti, niekedy keď blízky príbuzný má dedičný nedostatok proteínu C alebo proteínu S.

Vzorka krvi odobratá zo žily na ruke

Pred vykonaním tohto testu musíte počkať, kým sa krvná zrazenina nelieči, a kým sa stav nevyrieši. Tiež vás môže poučiť, aby ste prerušili antikoagulačnú liečbu. Dodržujte všetky pokyny, ktoré vám poskytne váš ošetrujúci lekár.

Výsledky svojich testov môžete nájsť na webovej stránke vášho laboratória alebo na portáli pre pacientov. Aktuálne ste však v laboratórnych testoch online. Možno vás sem presmeroval web vášho laboratória, aby vám poskytol základné informácie o testoch, ktoré ste vykonali. Na získanie výsledkov testov sa budete musieť vrátiť na webovú stránku alebo portál svojho laboratória alebo sa obrátiť na svojho lekára.

Lab Tests Online je ocenená webová stránka pre vzdelávanie pacientov, ktorá ponúka informácie o laboratórnych testoch. Obsah stránky, ktorý bol skontrolovaný laboratórnymi vedcami a inými lekárskymi odborníkmi, poskytuje všeobecné vysvetlenie toho, čo môžu výsledky znamenať pre každý test uvedený na webe, napríklad to, čo môže vysoká alebo nízka hodnota naznačovať vášmu lekárovi o vašom zdravotný alebo zdravotný stav.

Referenčné rozsahy vašich testov nájdete vo svojej laboratórnej správe. Obvykle sa nachádzajú napravo od vašich výsledkov.

Ak nemáte laboratórnu správu, obráťte sa na svojho poskytovateľa zdravotnej starostlivosti alebo laboratórium, ktoré vykonalo testy, aby ste získali referenčný rozsah.

Výsledky laboratórnych testov samy osebe nemajú význam. Ich význam pochádza z porovnania s referenčnými rozsahmi. Referenčné rozsahy sú hodnoty očakávané pre zdravého človeka. Niekedy sa im hovorí „normálne“ hodnoty. Porovnaním výsledkov testov s referenčnými hodnotami môžete vy a váš poskytovateľ zdravotnej starostlivosti zistiť, či niektoré z vašich výsledkov testov nespadajú do rozsahu očakávaných hodnôt. Hodnoty, ktoré sú mimo očakávaných rozsahov, môžu poskytnúť vodítka, ktoré pomôžu identifikovať možné stavy alebo choroby.

Zatiaľ čo presnosť laboratórneho testovania sa za posledných niekoľko desaťročí výrazne vyvinula, môže dôjsť k určitej variabilite medzi laboratóriami v dôsledku rozdielov v testovacom zariadení, chemických činidlách a technikách. To je dôvod, prečo sa na tejto stránke uvádza tak málo referenčných rozsahov. Je dôležité vedieť, že na vyhodnotenie toho, či sú vaše výsledky „v normálnych medziach“, musíte použiť rozsah dodaný laboratóriom, ktoré váš test vykonalo.

Pre viac informácií si prečítajte článok Referenčné rozsahy a čo znamenajú.

Proteín C a proteín S sú dva proteíny v krvi, ktoré pomáhajú regulovať tvorbu krvných zrazenín. V rámci skúmania možnej nadmernej zrážanlivosti sa často vykonávajú dva oddelené testy na tieto proteíny. Testy merajú množstvo každého proteínu (testy antigénu) a hodnotia, či vykonávajú svoje správne funkcie (testy aktivity).

Za normálnych okolností, keď je poranené telesné tkanivo alebo stena krvných ciev, proces nazývaný hemostáza začne vytvárať zátku v mieste poranenia, ktorá pomáha zastaviť krvácanie. Malé bunkové fragmenty nazývané krvné doštičky priľnú a agregujú na mieste a začne sa koagulačná kaskáda, keď sa proteíny nazývané koagulačné faktory aktivujú jeden po druhom. Nakoniec sa vytvorí stabilná zrazenina, ktorá zabráni ďalšej strate krvi a zostane na mieste, kým sa zranená oblasť nezahojí. Zrazenina sa potom rozloží, keď už nie je potrebná. Musí existovať primerané množstvo krvných doštičiek a dostatočné faktory zrážania a každá musí fungovať normálne, aby sa vytvorila stabilná zrazenina.

Proteíny S pôsobia ako hlavný kofaktor proteínu C. Tieto dva spolupracujú na regulácii a kontrole tvorby krvných zrazenín inaktiváciou špecifických koagulačných faktorov (faktory V a VIII), ktoré sú potrebné na tvorbu a tvorbu krvných zrazenín. To má za následok spomalenie tvorby zrazenín, podobne ako brzdy spomaľujú uháňajúce auto. Preto, ak nie je dostatok proteínu C alebo S alebo ak nefungujú normálne, tvorba zrazenín môže zostať nekontrolovaná, čo môže viesť k nadmernému zrážaniu. Tieto stavy sa môžu pohybovať od miernych až po ťažké.

Nedostatočný alebo nefunkčný proteín C alebo proteín S môže byť spôsobený základným stavom (získaným), ako je ochorenie pečene, ochorenie obličiek, závažné infekcie alebo rakovina, alebo môže byť zdedený, prenášaný z rodiča na dieťa. Deficit proteínu C aj proteínu S sú zdedené autozomálne dominantným spôsobom. Asi 1 z každých 200-500 ľudí má jeden normálny gén a jeden abnormálny gén (heterozygotný), čo spôsobuje nedostatok proteínu C. Približne 1 z 500 ľudí má nedostatok proteínu S v dôsledku heterozygotnej génovej mutácie.

Existujú dva typy zdedených nedostatok proteínu C.:

  • Typ 1 súvisí s nedostatočným množstvom.
  • Typ 2 súvisí s abnormálnou funkciou a je menej častý ako typ 1.

Proteín S existuje v krvi v dvoch formách: voľný a viazaný na iný proteín, ale k dispozícii je iba voľný proteín S, ktorý je kofaktorom proteínu C. Existujú tri typy dedičných nedostatok proteínu S:

  • Nedostatok 1. typu je spôsobený nedostatočným množstvom.
  • Typ 2 je spôsobený abnormálnou funkciou.
  • Typ 3 je spôsobený zníženými hladinami voľného proteínu S, hoci celkové hladiny proteínu S sú normálne.

Testy na proteín C a proteín S sú dva samostatné testy, ktoré sa často vykonávajú spoločne, aby pomohli diagnostikovať príčinu nevhodnej krvnej zrazeniny, ako je hlboká venózna trombóza (DVT) alebo pľúcna embólia (PE) (venózna tromboembólia alebo VTE). Testovanie sa môže použiť na pomoc pri vyšetrovaní možnej nadmernej poruchy zrážanlivosti a na určenie rizika vzniku ďalšej krvnej zrazeniny, najmä ak nemáte žiadne zjavné rizikové faktory alebo ak nemáte krvné zrazeniny v rodinnej anamnéze.

Testy na proteín C a proteín S merajú ich funkciu (aktivitu) alebo množstvo (antigén):

  • Testy funkčnosti (aktivity) proteínu C a proteínu S sa zvyčajne objednávajú spolu s ďalšími testami na nadmerné zrážanie, aby sa zmerala ich aktivita a vyhodnotila sa ich schopnosť regulovať a spomaľovať zrážanie krvi. Znížená aktivita môže byť spôsobená zníženým množstvom proteínu C alebo S alebo, zriedkavejšie, dôsledkom nefunkčného proteínu C alebo S
  • V závislosti od výsledkov funkčných testov je možné zmerať množstvo antigénu proteínu C a voľného, ​​alebo niekedy celkom, antigénu proteínu S, aby sa určilo, či je zníženie aktivity spôsobené zníženou produkciou alebo abnormálnou funkciou, a aby sa pomohlo klasifikovať typ nedostatku. Ak je nedostatok proteínu S alebo C spôsobený zdedenou genetickou zmenou, množstvo dostupného proteínu C alebo proteínu S a stupeň aktivity sa môžu použiť na určenie, či máte jednu kópiu (heterozygotnú) alebo dve kópie (homozygotnú) mutácia. Homozygotná mutácia v proteíne C alebo proteíne S je zriedkavá.

Testy na proteín C a proteín S možno objednať, keď:

  • Mali ste krvnú zrazeninu, najmä keď ste relatívne mladí (mladší ako 50 rokov)
  • Mali ste zrazeninu na nezvyčajnom mieste, ako sú žily pochádzajúce z pečene alebo obličiek alebo z krvných ciev mozgu
  • Mali ste niekoľko epizód zrážania krvi
  • Nemáte žiadne ďalšie zrejmé dôvody na rozvoj krvnej zrazeniny


Hladiny proteínu C a proteínu S sú ovplyvnené existujúcou krvnou zrazeninou a liečbou krvných zrazenín. Aby sa určili východiskové hladiny, testovanie by sa malo vykonať po liečbe a úprave krvnej zrazeniny a po prerušení antikoagulačnej liečby. Obvykle to znamená, že váš lekár bude liečiť vašu DVT alebo VTE, aby eliminoval bezprostredné zdravotné riziko z krvnej zrazeniny, a potom objedná testy o niekoľko týždňov alebo mesiacov neskôr, aby vám pomohol určiť príčinu vašej krvnej zrazeniny.

Testovanie sa typicky opakuje pri inej príležitosti, keď test, ktorý ukazuje zníženú aktivitu alebo množstvo proteínu C alebo proteínu S. Ak sa zistí získaný nedostatok, hladiny proteínu C alebo proteínu S možno príležitostne znova skontrolovať, ako prebieha alebo sa vyrieši základný stav. .

Testy na proteín C a S sa môžu objednať, ak má novorodenec závažnú poruchu zrážanlivosti, ako je diseminovaná intravaskulárna koagulácia (DIC) alebo purpura fulminans.

Testy na proteín C a proteín S môžu byť niekedy nariadené, ak máte blízkeho príbuzného s dedičným deficitom proteínu C alebo proteínu S, najmä ak má váš príbuzný ťažkú ​​formu alebo mal prvú VTE v mladom veku.

Normálna aktivita a hladina proteínu C a proteínu S zvyčajne naznačuje adekvátnu reguláciu zrážania.

Nízka hladina alebo aktivita proteínu C alebo proteínu S naznačuje, že zrážanie krvi nie je dostatočne regulované a existuje zvýšené riziko vzniku zrazeniny, ktorá blokuje prietok krvi v žilách.

  • Stupeň rizika zrážania krvi závisí od rozsahu nedostatku a/alebo dysfunkcie proteínu.
  • Nízke hladiny môžu byť dôsledkom toho, že telo neprodukuje dostatok alebo spotrebuje príliš veľa bielkovín alebo produkuje bielkoviny, ktoré nefungujú správne.
  • Malé množstvo alebo nefunkčné proteíny môžu byť spôsobené základnými získanými stavmi alebo, menej často, dedičnými (genetickými) poruchami.

Podmienky spôsobujúce nízky obsah bielkovín C a proteínu S, ktoré sa vyvinú neskôr v živote (nenarodíte sa s nimi), môžu byť mierne a dočasné alebo môžu mať rôznu závažnosť a môžu byť akútne, chronické alebo progresívne. Nasleduje niekoľko príkladov:

  • Oba proteíny sa produkujú v pečeni a produkcia závisí od vitamínu K. Nízke hladiny preto môžu byť spôsobené:
  • Warfarín (Coumadin®) antikoagulačná liečba (antagonista vitamínu K)

Dedičné mutácie v génoch, ktoré kódujú produkciu proteínu C a proteínu S, sú relatívne neobvyklé. Môžu mať za následok:

  • Znížená produkcia proteínu C alebo proteínu S
  • Abnormálny proteín C alebo S, ktorý nemôže fungovať normálne
  • Abnormálny proteín S, ktorý sa v tele vylučuje rýchlejšie (nedostatok typu 3)


Keď tieto mutácie nastanú, sú na sebe nezávislé a mutácia je v jednom alebo druhom géne (proteín C alebo proteín S). Mutácie v géne sa môžu vyskytnúť v jednej kópii génu (heterozygotná) alebo v dvoch kópiách génu (homozygotná).Mutácia v jednej kópii génu zvyšuje riziko vzniku mierneho množstva DVT a/alebo VTE, ale mutácia v dvoch kópiách génov môže spôsobiť závažné zrážanie a môže spôsobiť život ohrozujúce purpura fulminans alebo DIC u novorodenca. To si vyžaduje celoživotnú ostražitosť voči opakujúcim sa krvným zrazeninám. Homozygotné mutácie v proteíne C alebo proteíne S sú zriedkavé.

Akonáhle sa potvrdí dedičný nedostatok, váš ošetrujúci lekár bude primerane postupovať, keď sa nachádzate v situáciách, ktoré zvyšujú riziko zrážania krvi, ako je operácia, chemoterapia na rakovinu alebo užívanie perorálnej antikoncepcie.

Existujú tri typy dedičných nedostatkov proteínu S spojené s heterozygotnosťou pre nedostatok proteínu S. Ľudia, ktorí sú heterozygotní pre deficit proteínu S, majú výrazne zvýšené riziko VTE. Výsledky, ktoré možno pozorovať pri troch typoch nedostatku, sú zhrnuté nižšie. Najbežnejšie typy sú 1 a 3.

Typ
Nedostatok
Voľný proteín S. Celkový proteín S antigén Celková aktivita S proteínu
1 Poklesla Poklesla Poklesla
2 Normálne Normálne Poklesla
3 Poklesla Normálne Poklesla

Zvýšený proteín C a/alebo zvýšený proteín S obvykle nie sú spojené s zdravotnými problémami a nepovažujú sa za klinicky významné.

Zdravotnícky lekár tiež pravdepodobne nariadi ďalšie testy na zistenie základných ochorení alebo stavov, ako je ochorenie pečene, nedostatok vitamínu K alebo rakovina, ktoré môžu spôsobiť neprimerané zrážanie krvi (krvácanie alebo trombózu). Príklady ďalších testov, ktoré možno použiť na vyšetrenie nadmerného zrážania krvi, zahŕňajú:

Ak sú súčasne prítomné aj ďalšie nedostatky faktora, ako je znížený antitrombín alebo dedičné stavy, ako je mutácia faktora V Leiden alebo protrombín 20210, riziko vzniku krvných zrazenín.

Ak ste nemali krvnú zrazeninu, možno nebudete potrebovať liečbu. Ak sa u vás vyskytne krvná zrazenina, môže vám byť predpísaná štandardná antikoagulačná liečba. Zabraňuje tomu, aby sa krvná zrazenina zväčšovala, zatiaľ čo telo ju pomaly vstrebáva a tiež pomáha predchádzať tvorbe nových zrazenín. Liečba a/alebo vyriešenie základných stavov a vyhýbanie sa iným rizikovým faktorom, ako je fajčenie, môže znížiť riziko krvných zrazenín.

V prípade potreby je možné ako krátkodobé preventívne opatrenie (napríklad pred chirurgickým zákrokom) podať čerstvú mrazenú plazmu, ktorá obsahuje proteín C a proteín S, ale nejde o liečbu, ktorú je možné používať denne.

Koncentrát proteínu C schválil FDA v roku 2007 na použitie u pacientov s nedostatkom proteínu C a bezprostredne sa používa na liečbu dojčiat, ktoré trpia závažným nedostatkom proteínu C a vyvíjajú sa purpura fulminans. Jeho použitie v iných populáciách však zostáva kontroverzné.

Ak ste na antikoagulačnej terapii, váš poskytovateľ zdravotnej starostlivosti sa možno bude musieť poradiť s odborníkom na koagulačné testy a rozhodnúť, či je možné test aktivity proteínu C a/alebo proteínu S spoľahlivo vykonať a interpretovať. Antikoagulačné lieky môžu buď meniť hladiny proteínu C a proteínu S, alebo môžu interferovať s testami aktivity proteínu C a proteínu S, preto môže byť potrebné liečbu na určitý čas zastaviť, kým sa vzorky krvi neodoberú na testy.

Nie priamo. Ak máte nedostatky, ktoré sú spôsobené dočasným stavom (napríklad tehotenstvo alebo infekcia), mali by sa samy vrátiť na normálnu úroveň. Ak sú dôsledkom základného ochorenia, ako je ochorenie pečene alebo nedostatok vitamínu K, je potrebné tento stav riešiť. Ak máte zdedený nedostatok alebo dysfunkciu proteínu C alebo proteínu S, váš poskytovateľ zdravotnej starostlivosti vám často poradí, aby ste sa sústredili na zníženie iných rizikových faktorov zrážanlivosti. To môže zahŕňať nefajčenie a vyhýbanie sa užívaniu perorálnej antikoncepcie.

Nie nevyhnutne. Rutinný skríning sa neodporúča, pretože penetrácia génov je nízka. To znamená, že aj keď máte genetickú zmenu, môžete alebo nemusíte mať nikdy problém so zrážaním. Váš poskytovateľ zdravotnej starostlivosti však môže chcieť objednať toto vyšetrenie, ak máte silnú rodinnú anamnézu závažného nedostatku proteínu C alebo proteínu S alebo anamnézu vzniku trombózy v ranom veku.

Na tomto webe

Inde na webe

Zdroje použité v aktuálnom prehľade

(14. augusta 2018) Testy proteínu C a proteínu S. MedlinePlus. Dostupné online na https://medlineplus.gov/lab-tests/protein-c-and-protein-s-tests/. Prístupné 18. apríla 2019.

(4. januára 2019) Nedostatok proteínu C. Medscape. K dispozícii online na https://emedicine.medscape.com/article/205470-overview. Prístup k 18. aprílu 2019.

(©2019) Nedostatok proteínu S. Centrum pre hemofíliu a trombózu v Indiane. Dostupné online na https://www.ihtc.org/protein-s-deficiency/. Prístupné 21. apríla 2019.

Krvné zrazeniny. Americká hematologická spoločnosť. K dispozícii online na https://www.hematology.org/Patients/Clots/. Prístupné 21. apríla 2019.

(© 2019) Proteín C (krv). Lekárske centrum Univerzity v Rochesteri. Dostupné online na https://www.urmc.rochester.edu/encyclopedia/content.aspx?contenttypeid=167&contentid=protein_c_blood. Prístupné 21. apríla 2019.

(©2019) Aktivita proteínu C, Plazma. Laboratóriá kliniky Mayo. K dispozícii online na https://hematology.testcatalog.org/show/CFX. Prístupné 22. apríla 2019.

(©2019) Protein S Activity, Plasma. Laboratóriá kliniky Mayo. Dostupné online na https://hematology.testcatalog.org/show/S_FX. Prístup k 22. aprílu 2019.

(2016) Nedostatok proteínu C. Národná organizácia pre zriedkavé poruchy. Dostupné online na https://rarediseases.org/rare-diseases/protein-c-deficiency/. Prístupné 22. apríla 2019.

(október 2009) Nedostatok proteínu C. Úvodná referencia genetiky. K dispozícii online na https://ghr.nlm.nih.gov/condition/protein-c-deficiency#statistics. Prístupné 22. apríla 2019.

(18. októbra 2018) Vrodený nedostatok proteínu C alebo S. MedlinePlus. Dostupné online na https://medlineplus.gov/ency/article/000559.htm. Prístupné 22. apríla 2019.

Zdroje použité v predchádzajúcich recenziách

Thomas, Clayton L., redaktor (1997). Taberov cyklopedický lekársky slovník. F.A. Davis Company, Philadelphia, PA [18. vydanie].

Pagana, Kathleen D. & amp Pagana, Timothy J. (2001). Referencia k diagnostickým a laboratórnym testom Mosby, 5. vydanie: Mosby, Inc., Saint Louis, MO.

Gardner, B. (2001, 3. apríla). Nedostatok proteínu C. Medscape Primary Care, Pediatrics Opýtajte sa odborníka [Online informácie]. K dispozícii online na http://www.medscape.com/viewarticle/413850_print.

Testovacie panely koagulácie. Floridský nemocničný ústav pre rakovinu, klinické a výskumné laboratóriá [online informácie]. Dostupné online na http://www.fhci-labs.com/researchlabs/clinicallabs/hemostasisandthrombosis/panels.htm.

Mätúce názvy koagulačných testov. UAB Coagulation Service, Univ of Alabama at Birmingham [Online informácie]. Dostupné online na http://peir.path.uab.edu/coag/article_187.shtml and Protein C Activity, Activated Protein C Resistance (Screen for Factor V Leiden) at http://peir.path.uab.edu/coag /cat_index_14.shtml#191.

Schlesinger, K. a Ragni, M. (2002). DIC, zápal, sepsa a aktivovaný proteín C (APC). Aktualizácia transfúzneho lekárstva, číslo 3 [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.annals.org/issues/v135n5/full/200109040-00013.html.

Kapitola 132 Trombotické poruchy, všeobecné. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Section 11. Hematology and Oncology [Online information]. K dispozícii online na http://www.merck.com/pubs/mmanual/section11/chapter132/132a.htm.

Nedostatok proteínu C. University of Illinois - Urbana/Champaign, Carle Cancer Center, stránka zdrojov hematológie, zdroje pacientov [On -line informácie]. Dostupné online na http://www-admin.med.uiuc.edu/hematology/PtProtC.htm.

Nedostatok proteínu S. University of Illinois - Urbana/Champaign, Carle Cancer Center, stránka zdrojov hematológie, zdroje pacientov [On -line informácie]. Dostupné online na http://www-admin.med.uiuc.edu/hematology/PtProtS.htm.

Bardi, J. (2002). Odhalené záhady terapie. Výskumný ústav Scripps, novinky a zobrazenie zosilňovačov [on-line spravodaj]. Dostupné online na http://www.scripps.edu/newsandviews/e_20020617/print-ruf.html.

Elstrom, R. (28. októbra 2001, aktualizované). Proteín C. MedlinePlus Zdravotné informácie, Lekárska encyklopédia [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003659.htm.

Elstrom, R. (28. október 2001, aktualizované). Protein S. MedlinePlus Zdravotné informácie, Lekárska encyklopédia [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003660.htm.

Testovacie panely koagulácie. Klinické a výskumné laboratóriá, Floridský inštitút onkologického rakoviny [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.fhci-labs.com/researchlabs/clinicallabs/hemostasisandthrombosis/panels.htm.

Laposata, M. & amp Vancott, E. (2000 január). Ako vypracovať hyperkoagulabilitu. CAP v správach [On-line prípadová štúdia koagulácie]. K dispozícii online na http://www.cap.org/CAPToday/casestudy/coag5.html.

Jedovaté uhryznutie a uštipnutie. The Merck Manual of Medical Information-Home Edition, oddiel 24. Nehody a úrazy, Kapitola 287 [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.merck.com/mrkshared/mmanual_home/sec24/287.jsp.

Menta, S. (1999 jar). Koagulačná kaskáda. Hodnotenie fyziologických porúch, College of Medicine, University of Florida [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.medinfo.ufl.edu/year2/coag/title.html.

Bauer, K. (2001). Trombofílie: dobre definované rizikové faktory s neistými terapeutickými dôsledkami. Ann Intern Med. 2001135:367-373 [Vestník]. Dostupné online prostredníctvom http://www.annals.org.

DeLoughery, T. (1999, 15. marca). Testy hemostázy a trombózy. OHSU [Online študentský leták]. Dostupné online na http://www.ohsu.edu/som-hemonc/handouts/deloughery/printtest.html.

(10. januára 2001, zmenené). Popisy koagulačných testov. Clinical Coagulation Laboratory, A Division of Duke University Regional Referral Laboratory Services [Online information]. Dostupné online na http://pathology.mc.duke.edu/coag/TestDes.htm.

Pagana, Kathleen D. & amp Pagana, Timothy J. (© 2007). Referencia k diagnostickému a laboratórnemu testu Mosbyho, 8. vydanie: Mosby, Inc., Saint Louis, MO. P 781-782.

Nanda, R. (2005, 15. apríl). Vrodený nedostatok proteínu C alebo S. MedlinePlus [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000559.htm. Prístup k 3/25/07.

Nanda, R. (15. apríla 2005). Protein C. MedlinePlus [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003659.htm. Prístup k 3/25/07.

Nanda, R. (2005, 15. apríl). Protein S. MedlinePlus [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003660.htm. Prístup k 3/25/07.

(© 2007). Laboratórne problémy pri diagnostike abnormalít proteínu C, trombomodulínu a receptora proteínu C endotelových buniek. CAP [On-line informácie]. K dispozícii online na adrese http://www.cap.org. Prístup k 3/25/07.

(© 2007). Prehľad technických, diagnostických a epidemiologických úvah o testoch na proteín S. CAP [On-line informácie]. K dispozícii online na adrese http://www.cap.org. Prístupné dňa 25.3.2007.

Dugdale, D. et. al. (Aktualizované 2. marca 2009). Protein C. MedlinePlus Medical Encyclopedia [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003659.htm. Sprístupnené v septembri 2010.

Dugdale, D. a kol. al. (Aktualizované 28. marca 2010). Vrodený nedostatok proteínu C alebo S. Lekárska encyklopédia MedlinePlus [On-line informácie]. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000559.htm. Prístup k septembru 2010.

Cuker, A. a Pollak, E. (Aktualizované 11. júna 2009). Nedostatok proteínu C. eMedicine [On-line informácie]. K dispozícii online na http://emedicine.medscape.com/article/205470-overview. Prístup k septembru 2010.

(Recenzované v októbri 2009). Nedostatok proteínu C. Referencia domovskej genetiky [Informácie on-line]. Dostupné online na http://ghr.nlm.nih.gov/condition/protein-c-deficiency. Prístup k septembru 2010.

(Recenzované v októbri 2009). Nedostatok proteínu S. Referencia domovskej genetiky [Informácie on-line]. Dostupné online na http://ghr.nlm.nih.gov/condition/protein-s-deficiency. Prístup k septembru 2010.

Spence, R. a kol. al. (Aktualizované 12. januára 2010). Hemostatické poruchy, nešpecifické eMedicine. [On-line informácie]. K dispozícii online na http://emedicine.medscape.com/article/210467-overview. Sprístupnené v septembri 2010.

Godwin, J. (Aktualizované 27. augusta 2009). Nedostatok proteínu S. eMedicine [On-line informácie]. K dispozícii online na http://emedicine.medscape.com/article/205582-overview. Prístup k septembru 2010.

Pagana, K. D. & Pagana, T. J. (© 2007). Mosby's Diagnostic and Laboratory Test Reference 8th Edition: Mosby, Inc., Saint Louis, MO. Pp 781-782.

Wu, A. (© 2006). Tietz Clinical Guide to Laboratory Tests, 4th Edition: Saunders Elsevier, St. Louis, MO. S. 922-923, 926-927.

Národná aliancia krvných zrazenín. Nedostatok proteínu C. Dostupné online na http://www.stoptheclot.org/News/article136.htm. Sprístupnené v septembri 2010.

Národná aliancia krvných zrazenín. Nedostatok proteínu S: klinický pohľad. Dostupné online na http://www.stoptheclot.org/News/article137.htm. Sprístupnené v septembri 2010.

Chen, Yi-Ben. et. al. (Aktualizované 3. marca 2013). Proteín C. MedlinePlus Medical Encyclopedia. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003659.htm. Sprístupnené v októbri 2014.

Gersten, T. a kol. al. (Aktualizované 8. februára 2012). Vrodený nedostatok proteínu C alebo S. Lekárska encyklopédia MedlinePlus. Dostupné online na http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000559.htm. Prístup k októbru 2014.

Cuker, A. a Pollak, E. (Aktualizované 5. marca 2013). Nedostatok proteínu C. eMedicine. Dostupné online na http://emedicine.medscape.com/article/205470-overview. Prístup k októbru 2014.

(Recenzované máj 2013). Nedostatok proteínu C. Úvodná referencia genetiky. Dostupné online na http://ghr.nlm.nih.gov/condition/protein-c-deficiency. Prístup k októbru 2014.

(Recenzované v októbri 2009). Nedostatok proteínu S. Referencie pre domovskú genetiku. Dostupné online na http://ghr.nlm.nih.gov/condition/protein-s-deficiency. Sprístupnené v októbri 2014.

(© 1995-2014) Aktivita proteínu S, plazma. Lekárske laboratóriá Mayo. http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/80775. Sprístupnené v októbri 2014.

Sadaka, F. a kol. Aktivovaný proteín C v septickom šoku: analýza prispôsobená sklonu. Intenzívna starostlivosť 2011, 15: R89. doi: 10,1186/cc10089. Dostupné online na http://ccforum.com/content/15/2/R89. Prístup k októbru 2014.

Godwin, J. (Aktualizované 10. januára 2012). Nedostatok proteínu S. eMedicine. Dostupné online na http://emedicine.medscape.com/article/205582-overview. Prístup k októbru 2014.

Pagana, K. D. & amp Pagana, T. J. (© 2012). Referencia diagnostických a laboratórnych testov Mosbyho, 11. vydanie: Mosby, Inc., Saint Louis, MO. Pp 767-768.


Vplyv warfarínu na vaskulatúru

Warfarín, ktorý sa široko používa pri fibrilácii predsiení, mŕtvici a hyperkoagulačných poruchách, si získal širokú popularitu pre svoje antikoagulačné účinky. Blokovaním VKDP γ-karboxylácie v pečeni zabraňuje hepatálnej tvorbe faktorov zrážania. Warfarín však ovplyvňuje aj periférnu karboxyláciu, čo interferuje s periférnou produkciou VKDP. Osteokalcín, VKDP dôležitý v kostrovom zdraví (a nie je tu podrobne preskúmaný), je inhibovaný warfarínom a u zvierat, ktoré boli liečené warfarínom, sa do niekoľkých mesiacov vyvinie osteopénia (37). In vitro experimenty ukázali, že warfarín inhibuje karboxyláciu Gas-6 (38) aj MGP (39). V štúdiách na celých zvieratách, Cena a kol. ukázali, že warfarín vyvoláva rozsiahlu vaskulárnu kalcifikáciu u potkanov (40). V tomto modeli kombinácia warfarínu a hyperposfatémie vyvolanej vitamínom D spôsobila masívnu vaskulárnu kalcifikáciu u mladých, ale nie zrelých zvierat. Táto kalcifikácia zahŕňa predovšetkým elastické lamely média s intimálnym šetrením, podobné tým, ktoré sa pozorujú pri nedostatku MGP. Relatívny príspevok warfarínu, vitamínu D, fosfátu a veku k procesu kalcifikácie zostáva neznámy, no vzhľadom na rozšírené používanie analógov vitamínu D a warfarínu vyvolávajú problémy potenciálneho účinku lieku. Zdá sa, že distribúcia vaskulárneho postihnutia u zvierat liečených warfarínom uprednostňuje stredne veľké cievy s relatívnym šetrením kapilár a žíl (29). To vyvoláva otázky, či sú niektoré cievne lôžka náchylnejšie na vaskulárnu kalcifikáciu a či sa expresia VKDP môže vo vaskulatúre líšiť. Minimálne v in vitro pokusy a celé mladé zvieratá podávali vitamín D, zdá sa, že warfarín zhoršuje kalcifikáciu ciev.

Tento vzťah nebol skúmaný u ľudí. Napriek tomu, že warfarín bol v kardiovaskulárnej literatúre široko skúmaný, najmä vo vzťahu k priechodnosti arteriálneho bypaspu, väčšina štúdií sa spoliehala na angiografické hodnotenie priechodnosti lúmenu. Pretože vaskulárna kalcifikácia je často obmedzená na médiá, bez ovplyvnenia lúmenu, je stále ťažké urobiť konečné závery. Malá štúdia počítačovej tomografie však zistila, že používanie warfarínu je spojené s valvulárnou aj koronárnou kalcifikáciou (41). Histopatologické vyšetrenie aortálnych chlopní nahradených pre aortálnu stenózu zistilo, že pacienti liečení warfarínom mali dvojnásobné zvýšenie kalcifikácie chlopní (42). Začatie liečby warfarínom bolo tiež spojené s kalcemicko-uremickou arteriopatiou (43), čo je systémový vaskulárny kalcifikačný syndróm, ktorý typicky zahŕňa malé kapiláry. V konečnom dôsledku, bez dobre vykonaných štúdií zameraných na kvantifikáciu vaskulárnej kalcifikácie nemožno urobiť žiadne závery o účinku warfarínu na vaskulárnu kalcifikáciu. Je zrejmé, že tieto observačné štúdie môžu urobiť viac, ako naznačujú asociáciu, ale potenciálny vzťah prinajmenšom vyžaduje rozsiahlejšie prospektívne štúdie na lepšie vyhodnotenie vzťahu medzi warfarínom a vaskulárnou kalcifikáciou.


Nedostatok prírodných antikoagulancií, proteínu C, proteínu S a antitrombínu

Z centra hematológie/onkológie (B.L.) a hemofílie a trombózy (D.L.O.), Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Libanon, NH oddelenia medicíny a patológie, Dartmouth Medical School, Hanover, NH (D.L.O.).

Z hematológie/onkológie (B.L.) a Hemophilia and Thrombosis Center (D.L.O.), Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Libanon, NH Departments of Medicine and Patology, Dartmouth Medical School, Hanover, NH (D.L.O.).

U vás alebo u člena rodiny sa mohla vyvinúť krvná zrazenina v jednej z hlbokých žíl v tele (tj hlboká žilová trombóza alebo DVT) alebo ste mali krvnú zrazeninu, ktorá sa dostala do pľúc (tj pľúcna embólia alebo PE ). V rámci vašej lekárskej starostlivosti vás lekár mohol vyhodnotiť na stavy, ktoré mohli prispieť k vzniku krvnej zrazeniny.

Trombofília je stav, pri ktorom je zvýšená tendencia vytvárať krvné zrazeniny.Môže byť dedičná a udelená génmi zdedenými od jedného alebo viacerých rodičov, alebo môže byť získaná v situáciách, ako je operácia, rakovina, tehotenstvo alebo niektoré lieky (napr. niektoré antikoncepčné a menopauzálne hormonálne substitučné produkty). Dve najbežnejšie dedičné trombofílie sú génové mutácie faktora V Leiden a protrombínu 20210, ktoré boli predmetom predchádzajúcich stránok kardiologického pacienta. 1,2 Táto stránka kardiologického pacienta bude popisovať nedostatky prírodných antikoagulancií, proteínu C, proteínu S a antitrombínu, ktoré môžu mať za následok buď dedičnú alebo získanú trombofíliu.

Aké sú prírodné antikoagulanciá?

Krv preteká krvnými cievami a dodáva kyslík a živiny do všetkých tkanív tela. Keď je cieva poranená, spustí sa proces koagulácia spôsobuje, že krv tvorí zrazeniny, ktoré zastavujú krvácanie z poškodenej cievy. Hneď ako začne koagulácia, ostatné látky v krvi, prírodné antikoagulanciá, pôsobia ako brzdy, ktoré obmedzujú koaguláciu v konkrétnej oblasti poškodenia, čím sa zabráni tvorbe dostatočne veľkých zrazenín, ktoré by bránili normálnemu prietoku krvi. Pri práci existuje jemná rovnováha, ktorá zaisťuje dostatočnú – ale nie príliš veľkú – schopnosť zrážania krvi. Príliš malá schopnosť zrážania vedie k problémom s krvácaním, zatiaľ čo prílišná schopnosť zrážania (trombofília) môže viesť k tvorbe krvných zrazenín. Stav tejto rovnováhy medzi krvácaním a zrážaním sa líši od človeka k človeku a mnohé veci môžu narušiť rovnováhu (obrázok). Pretože sú prírodné antikoagulanciá nevyhnutné na zastavenie procesu zrážania, nedostatky jednej z týchto látok môžu narušiť túto rovnováhu a viesť k trombofílii. Najdôležitejšími prírodnými antikoagulanciami sú proteín C, proteín S a antitrombín (ktorý sa kedysi nazýval antitrombín III kým sa jeho názov nezmení na antitrombín).

Obrázok. Normálna rovnováha medzi zrážaním a krvácaním je narušená pri nedostatku jedného z prírodných antikoagulancií. Existuje jemná rovnováha medzi zrážaním a krvácaním v krvi. Látky, ktoré spôsobujú tvorbu bežných krvných zrazenín (tzv prokoagulanty) sú starostlivo vyvážené prírodnými antikoagulanciami (A), aby došlo k dostatočnému zrážaniu krvi, aby sa zabránilo krvácaniu, ale nie natoľko, aby sa spustila veľká krvná zrazenina, ktorá upchá žilu a zabráni prietoku krvi. Keď je nedostatok jedného z prírodných antikoagulancií (B, šípka nadol), rovnováha sa nakloní v smere zrážania tak, aby jedinci s týmito nedostatkami mali zvýšenú tendenciu vytvárať abnormálne krvné zrazeniny.

Čo spôsobuje nedostatok prírodných antikoagulancií?

Nízke hladiny prírodných antikoagulancií alebo prírodných antikoagulancií, ktoré nefungujú správne, môžu byť buď zdedené, alebo sa môžu vyskytnúť počas určitých životných udalostí. Gény, vrátane tých pre prirodzené antikoagulanciá, sú zdedené od vašich rodičov v 2 kópiách, 1 od vašej matky a 1 od vášho otca. Ľudia narodení s nedostatkom niektorého z prírodných antikoagulancií zdedia jeden abnormálny gén buď od svojej matky alebo otca. Zriedkavo môžu ľudia zdediť abnormálne gény od oboch rodičov, ale to často vedie k vážnym problémom so zrážanlivosťou, ktoré sú diagnostikované v detstve. Ľudia, ktorí zdedili normálne hladiny prírodných antikoagulancií, môžu napriek tomu vyvinúť nedostatky v určitých situáciách, ako je tehotenstvo, ochorenie pečene, závažná infekcia alebo iné ochorenie, nedostatok vitamínu K a niektoré lieky, napríklad estrogén, heparín a warfarín. Nedávna krvná zrazenina môže navyše znížiť hladiny prirodzených antikoagulancií v krvi.

Ako sa robí diagnostika?

Testovanie sa vykonáva krvným testom na meranie hladín a aktivity prirodzených antikoagulancií vo vašej krvi. Testovanie by sa malo vykonať najmenej niekoľko týždňov po epizóde akútnej zrážanlivosti a najmenej 3 až 6 týždňov po ukončení podávania warfarínu alebo heparínu. Na potvrdenie abnormálnych výsledkov by sa malo vykonať opakované testovanie, pretože falošne pozitívne výsledky sú bežné. Napríklad antikoncepčné pilulky a tehotenstvo často spôsobujú falošne nízku hladinu proteínu S.

Aké sú dôsledky?

Dedičné nedostatky prírodných koagulantov sú neobvyklé. Nedostatok proteínu C sa vyskytuje u ≈1 z 200 až 500 ľudí, zatiaľ čo nedostatok proteínu S možno očakávať u ≈1 z každých 500 jedincov. Nedostatok antitrombínu je najmenej častý z týchto troch nedostatkov a vyskytuje sa u ≈ 1 z 2 000 až 5 000 ľudí.

Ľudia s dedičným nedostatkom proteínu C alebo proteínu S majú asi 2 až 11-násobne zvýšené riziko vzniku DVT alebo PE v porovnaní s ľuďmi bez nedostatku. To zhruba znamená, že DVT alebo PE sa vyskytne u ≈1 z každých 100 až 500 ľudí s jedným z týchto nedostatkov ročne. Nedostatok antitrombínu je spojený s vyšším rizikom vzniku DVT a PE a odhaduje sa, že až 50% ľudí s dedičným nedostatkom antitrombínu počas života zažije krvnú zrazeninu.

Nedostatky prírodných antikoagulancií sú primárne spojené so zvýšeným rizikom vzniku krvných zrazenín v žilách a zdá sa, že zohrávajú malú alebo žiadnu úlohu pri vzniku krvných zrazenín v tepnách, napr. srdcový infarkt a mŕtvica. Nedávna štúdia však naznačuje, že nedostatok proteínu C a proteínu S (ale nie antitrombínu) môže byť spojený so zvýšeným rizikom tvorby krvných zrazenín v tepnách u ľudí mladších ako 55 rokov.

Hoci je spojené so zvýšeným rizikom tvorby krvných zrazenín, je dôležité si uvedomiť, že mnohí (možno väčšina) ľudí s nedostatkom prírodných antikoagulancií nikdy nezaznamenajú komplikácie z nedostatku.

Ako sa lieči nedostatok prírodných antikoagulancií?

Ak ste mali DVT alebo PE, s najväčšou pravdepodobnosťou ste boli liečení antikoagulanciami (riedidlá krvi). Warfarín je v súčasnosti najčastejšie predpisovaným antikoagulantom na dlhodobú liečbu po DVT alebo PE, ale musí sa podávať na začiatku s ďalším injekčným antikoagulantom (zvyčajne heparínom, nízkomolekulovým heparínom alebo podobným liekom), kým sa warfarín neupraví. plne účinné. Ak máte nedostatok proteínu C alebo proteínu S, nikdy nesmiete dostať warfarín bez toho, aby ste súčasne nedostali ďalšie antikoagulancium. Warfarín inhibuje vlastnú produkciu bielkovín C a proteínu S v tele. Preto počiatočná liečba samotným warfarínom u ľudí s nedostatkom proteínu C alebo proteínu S môže dočasne zhoršiť zrážanie alebo vyvolať vznik novej zrazeniny alebo závažnú kožnú vyrážku známu ako nekróza kože. Obvykle je bezpečné užívať warfarín samotný po 5 alebo viacerých dňoch súbežnej liečby heparínom, nízkomolekulárnym heparínom alebo príbuzným liekom, ako je fondaparinux.

Po prvej DVT alebo PE je riziko vzniku druhej zrazeniny pravdepodobne vyššie u jedincov s nedostatkom niektorého z prirodzených antikoagulancií ako u jedincov bez tohto nedostatku. Hoci sa celoživotná liečba antikoagulanciami po prvej krvnej zrazenine vždy neodporúča, trvanie antikoagulačnej liečby bude závisieť od presného typu prirodzeného nedostatku antikoagulancia, ktorý máte, okolností vašej zrazeniny a iných rizikových faktorov, ktoré môžete mať. Trvanie antikoagulácie bude preto potrebné starostlivo zvážiť so svojím lekárom.

Ak máte nedostatok jedného z prírodných antikoagulancií, ale nikdy ste nemali krvnú zrazeninu, potom nebudete bežne liečení antikoagulantom. Mali by ste sa však zamerať na zníženie alebo odstránenie iných faktorov, ktoré môžu v budúcnosti zvýšiť riziko vzniku krvnej zrazeniny (tabuľka 1). Okrem toho môžete potrebovať dočasnú liečbu antikoagulanciami počas období obzvlášť vysokého rizika, ako je operácia alebo tehotenstvo. Je preto veľmi dôležité, aby ste informovali všetkých svojich lekárov, ak máte takýto nedostatok.

Stôl 1. Rizikové faktory pre DVT a PE

DVT indikuje hlbokú žilovú trombózu PE, pľúcnu embóliu.

Aké sú špeciálne úvahy pre ženy s nedostatkom jedného z prírodných antikoagulancií?

Nedostatok prírodných antikoagulancií si vyžaduje osobitnú pozornosť v období tehotenstva alebo užívania hormónov (perorálne kontraceptíva alebo menopauzálna hormonálna substitučná terapia). Užívanie hormónov je v bežnej populácii spojené so zvýšeným rizikom vzniku krvných zrazenín, ale toto riziko je ešte vyššie u žien s nedostatkom prirodzených antikoagulancií. Hoci sa zdá, že lieky, ktoré obsahujú estrogén, sú spojené s najvyšším rizikom, antikoncepčné prostriedky obsahujúce iba progestín môžu toto riziko o niečo zvýšiť. Je dôležité poznamenať, že len progestínová antikoncepcia má vyššiu mieru zlyhania, a teda aj vyššiu mieru gravidity ako kombinovaná perorálna antikoncepcia obsahujúca estrogén aj progestín. Okrem toho majú antikoncepčné prostriedky obsahujúce iba progestín zvýšené riziko nepravidelného krvácania, ktoré môže viesť k tomu, že niektoré ženy prestanú užívať liek. Vnútromaternicové teliesko vylučujúce levonorgestrel (Mirena) nie je spojené so zvýšeným rizikom vzniku krvných zrazenín a často sa odporúča ženám s trombofíliou alebo s krvnými zrazeninami v anamnéze. Napriek tomu, že intrauterinné zariadenie levonorgestrel má tiež riziko nepravidelného krvácania, miera zlyhania prvého roka prináša oveľa nižšie riziko tehotenstva ako iné antikoncepčné metódy. Ženy by sa pred rozhodnutím o užívaní hormónov mali so svojim lekárom zoznámiť s rizikami a prínosmi rôznych možností.

Počas tehotenstva a počas prvých 4 až 6 týždňov po pôrode existuje u všetkých žien zvýšené riziko vzniku krvných zrazenín. Táto miera je vyššia pre tých, ktorí majú ako u tých, ktorí nemajú nedostatok jedného z prírodných antikoagulancií. Tiež môže existovať zvýšené riziko predčasných a neskorých potratov. Ženy s nedostatkom jedného z prírodných antikoagulancií, ktoré plánujú tehotenstvo, by mali úzko spolupracovať so svojim pôrodným poradcom, hematológom a/alebo odborným poradcom pre trombózu, aby určili vhodnú liečbu počas tehotenstva a po ňom.

Kto by mal byť testovaný na nedostatok prírodných antikoagulancií?

Testovanie môžete zvážiť, ak sa vám vyvinie krvná zrazenina a máte člena rodiny s nedostatkom jedného z prírodných antikoagulancií alebo ak máte nevysvetliteľné alebo opakujúce sa DVT alebo PE bez rodinnej anamnézy. Môžu nastať aj iné situácie, v ktorých je možné po konzultácii s lekárom zvážiť testovanie. Testovanie zdravých príbuzných ľudí s nedostatkom prirodzeného antikoagulancia je kontroverzné a malo by sa o tom starostlivo porozprávať so svojím lekárom. Výhody testovania môžu zahŕňať zvýšenie informovanosti o rizikových faktoroch a príznakoch krvných zrazenín. K nevýhodám patrí možná obava z diagnózy, ktorá nemusí nikdy vyvolať príznaky, nedostatok poistného krytia pre nevhodné testovanie a zbytočné zadržiavanie niektorých liekov, ako sú perorálne kontraceptíva alebo hormonálna substitučná terapia.

Ako minimalizujem riziko spôsobené nedostatkom prírodných antikoagulancií?

Aj keď genetické riziko z nedostatku prirodzených antikoagulancií nemožno zmeniť, jednotlivci môžu upraviť životný štýl, aby znížili ďalšie rizikové faktory. Hlavným rizikovým faktorom krvných zrazenín je napríklad obezita, ktorá predstavuje silnejšie riziko ako niektoré z dedičných trombofilií. Tipy na zníženie rizika DVT a PE sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2 Kroky, ktoré je potrebné urobiť, aby sa minimalizovalo riziko vzniku DVT alebo PE

DVT indikuje hlbokú žilovú trombózu PE, pľúcnu embóliu.

Závery

Nedostatky prírodných antikoagulancií sú zriedkavé a sú buď dedičné pri narodení, alebo sa získavajú niekedy počas života. Prirodzený nedostatok antikoagulancií je jedným z mnohých stavov, ktoré môžu zvýšiť riziko vzniku DVT alebo PE (tabuľka 1), ale u mnohých ľudí s takýmto nedostatkom sa krvné zrazeniny nikdy nevyvinú. Hoci dedičné riziká nemožno zmeniť, je možné urobiť veľa vecí, aby sa u jednotlivca znížilo celkové riziko vzniku krvných zrazenín (tabuľka 2). Zdravý životný štýl srdca je mimoriadne dôležitý pre minimalizáciu rizika trombózy. Rozpoznanie symptómov DVT alebo PE umožňuje včasnú liečbu, aby sa minimalizovalo riziko trvalých vedľajších účinkov. Nakoniec je dôležité spolupracovať so svojím lekárom, aby ste pochopili vaše individuálne riziká, preventívne stratégie a terapeutické možnosti v prípade DVT alebo PE.

Dodatočné zdroje

1. Heit J. Trombofília: bežné otázky týkajúce sa laboratórneho hodnotenia a manažmentu. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:127–135.

2. Foy P, Moll S. Thrombophilia: aktualizácia 2009. Možnosti ošetrenia Curr Cardiovasc Med. 200911: 114–128.

3. Middeldorp S, van Hylckama Vlieg A. Pomáha testovanie trombofílie pri klinickom manažmente pacientov? Br J Hematol. 2008143:321–335.

4. Dalen JE. Mali by byť pacienti s venóznou tromboembóliou vyšetrení na trombofíliu? Am J Med. 2008121:458–463.


Abstrakt—Vysoké dávky warfarínu spôsobujú u potkanov fokálnu kalcifikáciu elastických lamiel v médiách veľkých tepien a aortálnych srdcových chlopní. Kalcifikácia aorty sa prvýkrát pozorovala po 2 týždňoch liečby warfarínom a postupne sa zvyšovala hustota po 3, 4 a 5 týždňoch liečby. Do 5 týždňov bola na röntgenových snímkach a vizuálnou kontrolou tepny viditeľná vysoko ohnisková kalcifikácia hlavných tepien. Kalcifikácia artérií indukovaná warfarínom je podobná ako u myši s deficitom matrix Gla proteínu (MGP), čo naznačuje, že warfarín indukuje kalcifikáciu artérie inhibíciou y-karboxylácie MGP, a tým inaktivuje predpokladanú aktivitu proteínu inhibujúcu kalcifikáciu. . Liečba warfarínom výrazne zvýšila hladiny MGP mRNA a proteínu v kalcifikujúcich artériách a znížila hladinu MGP v sére. Liečba warfarínom neovplyvnila rast kostí, celkový prírastok na hmotnosti ani hladiny vápnika a fosforu v sére a vzhľadom na súbežné podávanie vitamínu K boli protrombínové časy a hematokrity normálne. Výsledky naznačujú, že vylepšený liečebný protokol warfarín plus vitamín K vyvinutý v tejto štúdii by mal poskytnúť užitočný model na skúmanie úlohy MGP pri prevencii kalcifikácie tepien a srdcových chlopní.

Proteín Matrix Gla (MGP 1) je proteín vylučovaný 10 kDa, ktorý obsahuje 5 zvyškov aminokyseliny viažucej vápnik závislej od vitamínu K, kyseliny γ-karboxyglutámovej (Gla). 1 2 MGP bol pôvodne objavený v demineralizačných extraktoch kostí, ale teraz je známe, že sú exprimované širokou škálou tkanív a bunkových typov. Tkanivá potkanov s najvyššími hladinami MGP mRNA sú chrupavka, srdce, obličky a pľúca 3 4 a bunky, o ktorých je známe, že exprimujú MGP mRNA, zahŕňajú osteoblasty, chondrocyty, bunky hladkého svalstva ciev, pneumocyty, obličkové bunky a fibroblasty. 3 4 5 6 7 8 Aj keď niekoľko nekalcifikovaných tkanív exprimuje MGP mRNA na vyššej úrovni ako kosť, významné hladiny proteínu sa zistili iba v kosti a kalcifikovanej chrupavke. 4 9 Toto pozorovanie naznačuje, že proteín sa môže akumulovať v miestach kalcifikácie a že veľká časť proteínu vylučovaného nekalcifikovanými tkanivami pravdepodobne uniká do plazmy, kde sa MGP nachádza v koncentráciách 0,3 až 1 μg/ml v závislosti od druhu. Okrem y-karboxylácie je MGP cieľom niekoľkých ďalších posttranslačných modifikácií. Špecifické proteolytické štiepenie na konzervovanom dvojsýtnom mieste v C-koncová oblasť bola pozorovaná v MGP izolovanom z ľudských, hovädzích a žraločích tkanív, 10 a konzervovaná fosforylácia 3 fosfoserínových zvyškov v N.-v MGP bola nájdená koncová oblasť zo žraločích, potkaních, kravských a ľudských tkanív. 11

Funkcia MGP bola nedávno preskúmaná cielenou deléciou génu u myši. 12 Výskumníci zistili, že myši s deficitom MGP sú normálne pri narodení, ale že kalcifikácia arteriálneho média sa prvýkrát objavuje vo veku 1 týždňa a rýchlo postupuje tak, že zahŕňa celé médium vo veku 3 týždňov. Do značnej miery kalcifikované tepny sú krehké a väčšina myší s nedostatkom MGP zomiera na vykrvácanie vo veku 3 až 6 týždňov. Prežívajúce zvieratá začínajú vykazovať známky postihnutia kostí, vrátane kalcifikácie chrupavky rastovej platne so zatváraním rastovej platničky, osteopénie a zlomeniny kostí, po 3 týždňoch veku.

Cieľom súčasnej štúdie bolo určiť účinok antagonistu vitamínu K warfarínu na kalcifikáciu mäkkých tkanív u potkanov. Použité postupy majú svoj pôvod v predchádzajúcich štúdiách s kostným proteínom Gla závislým od vitamínu K (osteokalcín), 13 14, ktorý viedol k zisteniu, že vitamín K nemôže pôsobiť proti účinku warfarínu v extrahepatálnych tkanivách. 15 Tento výsledok je vo výraznom kontraste s dobre preukázanou schopnosťou vitamínu K pôsobiť proti účinku warfarínu na syntézu faktorov zrážanlivosti krvi v pečeni. 16 Základná dichotómia v schopnosti vitamínu K pôsobiť proti účinku warfarínu v rôznych tkanivách umožňuje nepretržité udržiavanie zvierat na dávkach warfarínu postačujúcich na závažnú inhibíciu γ-karboxylácie proteínov syntetizovaných extrahepatálnymi tkanivami pri zachovaní normálnych časov zrážania krvi. 14 17 Uvádzame, že upravená verzia protokolu warfarín plus vitamín K použitá v pôvodných štúdiách s proteínom Gla z kostí vytvára rýchlu a rozsiahlu kalcifikáciu elastických lamiel v aorte a iných tepnách, ktorá je dosť podobná fenotypu MGP- deficitná myš.

Metódy

Materiály

Vitamín K1 (fylochinón) a warfarín boli zakúpené od spoločnosti Sigma Chemical Co. Na injekcie zásobné roztoky vitamínu K1 (10 mg/ml) boli pripravené a uložené v sterilných nádobách zabalených vo fólii pri 4 ° C. Pripravili sa zásobné roztoky warfarínu sodného (50 mg/ml) a uchovávali sa pri 4 ° C. Potkany Simonsen albino (odvodené od potkanov Sprague-Dawley) boli zakúpené od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA).

Metódy

Kalcifikované tkanivá sa vysušia, odvážia a extrahujú 10-násobným prebytkom (hmotn./obj.) 10% kyseliny mravčej počas 16 hodín pri 4 ° C. Hladiny MGP v kyslých extraktoch a sére sa stanovili rádioimunotestom, ako je opísané vyššie. 18 Hladiny vápnika v kyslých tkanivových extraktoch sa stanovili kolorimetricky pomocou krezolftaleínového komplexu 1 (Sigma) a hladiny fosfátu sa stanovili kolorimetricky, ako je opísané vyššie. 19 Rezanie tkaniva a farbenie bolo uskutočnené službou biologického testovania. Pri rádiografiách boli krčné tepny a brušná aorta odstránené pri pitve, očistené od nevaskulárneho tkaniva a fotografované pomocou röntgenového systému Hewlett-Packard model 4380N Flexitron. Protrombínové časy boli určené použitím tromboplastínového času s vápnikovými činidlami a podľa postupu výrobcu (Sigma).

Na analýzu Northern blot bola celková RNA izolovaná z hrudných aort a buniek normálnych potkaních obličiek 3 pomocou súpravy RNA STAT-60 (Tel-Test B). Štyridsať mikrogramov celkovej RNA z každej vzorky bolo frakcionovaných na 1% formaldehyd-agarózovom géli v pufri MOPS a prenesené na membránu Hybond-N (Amersham). Po 3 hodinách prehybridizácie v 50% formamide, 5 × SSC, 5 × Denhardtovom roztoku a 100 µg/ml denaturovanej DNA spermií lososa pri 42 ° C sa blot hybridizoval s cDNA sondou cDNA označenou 32 P náhodne pripravenou pre potkany MGP 20 na 16 hodín. Membrána sa premývala trikrát 1 hodinu vždy s 0,1 x SSC obsahujúcim 0,1% SDS pri 65 ° C a potom sa vystavila rôntgenovému filmu.

Údržba zvierat

Postupy štúdie boli pred začatím preskúmané a schválené Výborom pre zvieratá na University of California, San Diego. Samcom potkanov Sprague-Dawley bol poskytnutý voľný prístup k diéte pre hlodavce 5001 (Purina Mills), ktorá predstavuje 0,67% fosforu a 0,95% hmotnosti vápnika. Táto diéta obsahuje 500 μg fylochinónu/kg a neobsahuje žiadne pridané menadion. Všetky injekcie boli podávané subkutánne do chrbta zvierat v podstate tak, ako bolo opísané vyššie. 13 14 15 Dvadsaťštyri a 48 hodín pred prvou injekciou warfarínu dostali všetky potkany dávky 1,5 mg vitamínu K1/100 g telesnej hmotnosti. Predchádzajúce štúdie ukázali, že táto nasycovacia dávka vitamínu K je potrebná na prevenciu krvácania počas prvého týždňa liečby warfarínom. 15 Prvá dávka warfarínu, 15 mg/100 g, a 1,5 mg vitamínu K1/100 g sa podávalo o 8:00, keď potkany dosiahli vek 42 dní. Druhá dávka warfarínu 15 mg/100 g bola podaná o 20. hodine bez sprievodného vitamínu K. Táto rutina sa udržiavala každý deň až do ukončenia experimentu. Na zníženie traumy v miestach vpichu boli na všetky injekcie použité ihly 25-gauge a miesta subkutánnej injekcie sa striedali medzi 4 kvadrantmi chrbta. Zvieratá boli usmrtené vykrvácaním, zatiaľ čo boli pod anestéziou metofánu, a vybrané tkanivá boli odstránené a fixované v 10% pufrovanom formalíne alebo zmrazené pri -70 ° C na neskoršie štúdie.

Prvá 5-týždňová štúdia sa uskutočnila s 10 potkanmi v skupine liečenej warfarínom a 10 potkanmi v kontrolnej skupine potkany v kontrolnej skupine dostávali denne injekcie rovnakej dávky vitamínu K1 ale žiadny warfarín. V nasledujúcej štúdii boli 2 potkany udržiavané na warfaríne počas 1 týždňa a 2 počas 2 týždňov. V tretej štúdii boli 2 potkany chované na warfaríne 3 týždne, 2 počas 4 týždňov a 2 počas 5 týždňov. Nakoniec, v priebehu vývoja režimu dávkovania pre revidovaný protokol warfarínu, sme udržiavali 4 zvieratá na štandardnej dávke 15 mg warfarínu/100 g každých 12 hodín po dobu 3 týždňov buď so štandardným 1,5 mg vitamínu K1/100 g denne alebo jednu polovicu tejto dávky.

Výsledky

Modifikácia protokolu Warfarin Plus Vitamin K

V počiatočnej štúdii účinku experimentálne indukovaného nedostatku vitamínu K na arteriálnu kalcifikáciu boli 42-dňové samce potkanov liečené 6 týždňov dennými dávkami warfarínu a vitamínu K, ktoré v predchádzajúcich štúdiách 14 znížili hladiny kostí. Gla proteín v kosti na 2% normálnych hladín. Prítomnosť mineralizácie v artériách potkanov ošetrených warfarínom nebola detekovaná, ani ako zvýšenie hladín vápnika v aorte, ani ako prítomnosť farbenia von Kossa v histologických rezoch aorty, femorálnej artérie alebo krčnej tepny (údaje nie sú zobrazené). Jedným z možných vysvetlení, prečo sa nepodarilo nájsť zvýšenie arteriálnej kalcifikácie u týchto potkanov liečených warfarínom, je, že protokol vyvinutý na zníženie hladín kostného proteínu Gla v kosti na 2 % normálnych hladín nevyvolal porovnateľne významný defekt v y-karboxylácii. spoločnosti MGP. Ďalšou možnosťou je, že dokonca 2% normálnej MGP y-karboxylácie môžu byť dostatočné na to, aby sa zabránilo významnej kalcifikácii v tepnách potkanov ošetrených warfarínom. V každom prípade by riešením problému arteriálnej kalcifikácie bolo ďalšie zníženie úrovne y-karboxylácie MGP. Preto sme zvýšili dávku warfarínu 2 -krát a túto dávku sme podávali každých 12 hodín, nie každých 24 hodín. Celková denná dávka warfarínu sa tým zvýšila 4-násobne.

Potkany udržiavané počas 5 týždňov na tomto revidovanom protokole warfarínu plus vitamínu K boli celkom zdravé. Ako je znázornené na obrázku 1, modifikovaný protokol ošetrenia warfarínom nemal žiadny vplyv na rýchlosť, ktorou pôvodne 6-týždňové potkany priberali na hmotnosti počas 5 týždňov experimentu. Nebol tiež žiadny účinok 5-týždňovej liečby warfarínom na dĺžku tibie, ktorá bola 3,9 cm u potkanov liečených warfarínom a kontrolných potkanov, a neexistoval ani rádiografický dôkaz fúzie rastovej platne (rádiografy nie sú uvedené). Absencia účinku warfarínu na rast kostí je v súlade s výsledkami predchádzajúcich štúdií, ktoré ukázali, že warfarín spôsobuje fúziu rastovej platničky iba u potkanov vo veku 4 mesiacov alebo starších. 21 Chemické testy séra vykonané po 4 týždňoch liečby nezistili významný rozdiel medzi skupinou liečenou warfarínom a kontrolnou skupinou v žiadnom z meraných parametrov, vrátane hladín vápnika a fosforu v sére. Rovnako ako v predchádzajúcich pokusoch, 1415 súbežná liečba zvierat vysokými dávkami vitamínu K bola schopná pôsobiť proti účinku warfarínu na karboxyláciu koagulačných faktorov krvi v pečeni, ako ukazuje skutočnosť, že protrombínový čas a hematokrity zostali počas celého obdobia normálne. experimentu a že v mieste vpichu nedošlo k jedinému prípadu nekontrolovaného krvácania.

Účinok warfarínu na kalcifikáciu tepien

Časový priebeh arteriálnej kalcifikácie bol skúmaný u 42-dňových samcov potkanov. 10 pokusným zvieratám bol podávaný warfarín každých 12 hodín a vitamín K každých 24 hodín, 10 kontrolným potkanom bol podávaný samotný vitamín K každých 24 hodín. Z každej skupiny boli každý týždeň usmrtené dve zvieratá a aorta, srdce, pľúca, obličky a krčné a stehenné tepny boli fixované vo formalíne. Po 1 týždni liečby warfarínom von Kossa farbením rezov brušnej aorty nebola zistená žiadna kalcifikácia. Do 2 týždňov liečby však pozdĺžne rezy brušnej aorty obsahovali tmavo zafarbené oblasti kalcifikácie, ktoré boli obmedzené na lineárne štruktúry v aortálnom médiu (obrázok 2). Tieto lineárne štruktúry boli identifikované ako elastické lamely aortálneho média farbením sériových rezov brušnej aorty na elastín a minerál. Do 3 týždňov liečby sa počet kalcifikovaných oblastí v brušnej aorte výrazne zvýšil (obrázok 2). Každá kalcifikovaná oblasť bola ohnisková, s oblasťami intenzívneho von Kossovho farbenia na minerály rozptýlenými oblasťami aortálneho média zjavne bez akejkoľvek kalcifikácie. O 4 a 5 týždňov liečby sa intenzita farbenia von Kossa v oblastiach kalcifikácie ešte zvýšila a niektoré kalcifikované oblasti sa nakoniec stali takými tvrdými, že počas rezania dochádzalo k fragmentácii (obrázok 2). Podobný časový priebeh a vzor mediálnej kalcifikácie sa pozoroval aj vo von Kossa zafarbených rezoch koronárnych, karotických a femorálnych artérií potkanov liečených warfarínom (mikrografy nie sú zobrazené).

Zistili sme, že časový priebeh arteriálnej kalcifikácie vyvolanej warfarínom je pozoruhodne reprodukovateľný. V nasledujúcich experimentoch sme skúmali rozsah arteriálnej kalcifikácie u potkanov udržiavaných na warfaríne počas 1, 2, 3, 4 alebo 5 týždňov a výsledky týchto experimentov uskutočnených počas 4-mesačného obdobia s 2 potkanmi v časovom bode, boli na nerozoznanie od časového priebehu zobrazeného na obrázku 2. V samostatnom experimente sme skúmali vplyv zníženia udržovacej dávky vitamínu K faktorom 2 na rozsah kalcifikácie po 3 týždňoch liečby warfarínom. Štyri zvieratá boli udržiavané na warfaríne, 2 so štandardnou dávkou vitamínu K a 2 s polovičnou dávkou. Kalcifikácia brušnej aorty v týchto dvoch skupinách bola nerozlíšiteľná, ako sa dalo predpokladať z predtým dokumentovanej neschopnosti vitamínu K pôsobiť proti účinku warfarínu v extrahepatálnych tkanivách. 15 Pretože protrombínový čas bol predĺžený 1,2-krát až 1,6-krát v skupine, ktorá dostala polovicu štandardnej dávky vitamínu K, použili sme štandardnú dávku 1,5 mg vitamínu K/100 g telesnej hmotnosti vo všetkých ostatných tu uvedených experimentoch.

Prehľad o vzore arteriálnej kalcifikácie u potkanov liečených warfarínom možno získať buď vizuálnou kontrolou tkanív pomocou pitevného mikroskopu alebo vyšetrením röntgenových snímok tepien. Vizuálna detekcia kalcifikácie je najjednoduchšia v krčnej tepne, ktorá má normálne priesvitný vzhľad. Ako je znázornené na obrázku 3, kalcifikácia krčnej tepny u potkanov ošetrených warfarínom sa javí ako nesúvislé, belavé usadeniny na pozadí inak priesvitného tkaniva. Tieto biele oblasti často tvoria nepravidelné pásy okolo tepny, ktoré sa zdajú byť tvrdé, keď sa s tkanivom manipuluje. Potom, čo bola karotická artéria znázornená na obrázku 3 fixovaná a pozdĺžne rozrezaná, kalcifikácia sa objavila ako fokálne ložiská podobné tým, ktoré sú znázornené na obrázku 2. Preto usudzujeme, že ohnisková kalcifikácia pozorovaná v pozdĺžnych rezoch môže v niektorých prípadoch predstavovať prierezové rezy cez obvodové pásy kalcifikácie. Kalcifikácia sa dá ľahko zistiť rádiograficky v aorte a krčnej tepne po 5 týždňoch liečby warfarínom (obrázok 4). V každom prípade je kalcifikácia videná na röntgenograme výrazne diskontinuálna, pričom oblasti kalcifikácie sú oddelené zdanlivo nekalcifikovanými oblasťami tepny. Röntgenové snímky krčnej tepny a aorty tiež ukazujú, že kalcifikácia sa často javí skôr ako nepravidelné pásy než ako bodkovité ložiská.

Chemické analýzy sa vykonali na aorte a vybraných ďalších tkanivách potkanov sa udržiavali 4 týždne podľa revidovaného protokolu warfarín plus vitamín K. Ako je uvedené v tabuľke 1, liečba warfarínom zvýšila celkovú hladinu vápnika v kyslých extraktoch aorty ~ 4-násobne. Hladiny fosfátov v kyslých extraktoch sa zvýšili v podobnom rozsahu (údaje nie sú uvedené). Liečba warfarínom tiež spôsobila 4-násobné zvýšenie hladiny vápnika v obličkách (tabuľka 1).

Účinok warfarínu na expresiu MGP

Účinok liečby warfarínom na expresiu MGP v tepnách bol hodnotený 2 spôsobmi. Northern blot analýza hladín MGP mRNA sa uskutočnila na RNA izolovanej z aort potkanov ošetrovaných počas 4 týždňov warfarínom a samotným vitamínom K alebo vitamínom K. Ako je znázornené na obrázku 5, liečba warfarínom významne zvýšila hladinu expresie MGP mRNA v aorte potkanov ošetrených warfarínom. Hladiny antigénu MGP boli tiež stanovené rádioimunologickým testom kyslých demineralizačných extraktov aorty potkanov udržiavaných počas 4 týždňov na warfaríne a kontrolných protokoloch. Ako je uvedené v tabuľke 1, liečba warfarínom zvýšila hladinu MGP v aorte zvierat liečených warfarínom 13-násobne.

Dramatická akumulácia antigénu MGP v kalcifikovaných aortách potkanov ošetrených warfarínom naznačuje, že y-karboxylácia proteínu nemusí byť nevyhnutná pre jeho akumuláciu v kalcifikovanom tkanive. Aby sme túto hypotézu ďalej testovali, skúmali sme hladinu MGP v segmente metafýzy, ktorá sa vytvorila v priebehu predĺženia kosti počas 4 týždňov liečby warfarínom. Ako je uvedené v tabuľke 1, antigén MGP nahromadený v oblastiach kalcifikácie kostí vytvorených počas intervalu liečby warfarínom, ale hladina MGP na jednotku minerálneho vápnika bola znížená ≈ 5-násobne v porovnaní s hladinou v kontrolnom kostnom tkanive. Podobné zníženie hladín MGP bolo tiež pozorované v SDS géloch proteínov extrahovaných kyselinou z tejto oblasti metafýzy potkanov liečených warfarínom počas 4 týždňov (údaje nie sú uvedené).

Pretože kalcifikácia indukovaná warfarínom zvyšuje hladinu MGP mRNA a antigénu vo vaskulárnych tkanivách, dalo by sa predpokladať, že dôjde aj k zvýšeniu hladiny antigénu MGP v krvi. Ako je uvedené v tabuľke 2, hladina sérového MGP bola v skutočnosti takmer 3-krát nižšia u potkanov ošetrených warfarínom. Tento pokles je v sérovom MGP, ktorý sa nezmenil počas 5 týždňov liečby warfarínom, a preto nesúvisel s arteriálnou kalcifikáciou. Zdá sa pravdepodobnejšie, že pokles hladín MGP v sére bol spôsobený buď zvýšeným klírensom nekarboxylovaného proteínu, alebo warfarínom indukovaným poklesom sekrécie MGP z buniek podobným warfarínom indukovanému zníženiu sekrécie protrombínu hlásenému u potkanov hepatocyty. 22 23

Účinok warfarínu na kalcifikáciu srdca, pľúc a obličiek

Pretože najvyššie hladiny MGP mRNA boli nájdené v srdci, pľúcach a obličkách potkanov v tomto veku, 3 zdá sa logické dospieť k záveru, že každé z týchto tkanív môže byť za určitých okolností náchylné na kalcifikáciu. Na vyhodnotenie účinku liečby warfarínom na kalcifikáciu týchto tkanív sa srdce, pľúca a obličky odobrali pri pitve potkanov liečených 4 týždne warfarínom a vitamínom K alebo samotným vitamínom K. Rezy každého tkaniva sa potom podrobili von Kossovmu farbeniu, aby sa zistili oblasti mineralizácie. V obličkách bola kalcifikácia zistená v elastických lamelách tepien v renálnom hile, ale nie v žiadnej inej štruktúre (nezobrazené). V srdci bola kalcifikácia zistená iba v elastických lamelách koronárnej artérie (nezobrazené) a aortálnej srdcovej chlopni (obrázok 6). V pľúcach bola kalcifikácia nájdená v elastických lamelách mnohých artérií, ale nie v iných štruktúrach. Aj keď sme histologickými metódami nehodnotili kalcifikáciu akýchkoľvek iných mäkkých tkanív u potkanov ošetrených warfarínom, treba poznamenať, že tieto kalcifikácie, ak sú prítomné, neboli dostatočne rozsiahle na to, aby boli detegovateľné na rádiografoch celých zvierat potkanov ošetrených warfarín po dobu 5 týždňov.

Diskusia

Porovnanie účinku warfarínu u potkanov s fenotypom myši s nedostatkom MGP

Ako je uvedené vyššie, cielená delécia génu MGP u myší spôsobuje kalcifikáciu hlavných artérií, ktorá sa môže najskôr detegovať vo veku 1 týždňa. 12 Táto kalcifikácia začína v elastických lamelách arteriálneho média a postupuje do bodu, keď sa z tepien stanú tuhé trubice, ktoré sú krehké a prasknú, čo spôsobuje smrť vykrvácaním u väčšiny myší s deficitom MGP vo veku 3 až 6 týždňov. Tracheálna prstencová chrupavka tiež kalcifikuje u myší s deficitom MGP vo veku 2 až 3 týždňov. Po troch týždňoch života prežívajúce myši rastú pomalšie, čiastočne kvôli abnormálnej kalcifikácii chrupavky rastovej platničky a nakoniec majú osteopéniu a zlomeniny kostí. 12

Väčšina výrazných fenotypových znakov, ktoré sa objavujú skoro u myší s deficitom MGP, sa tiež nachádza v trochu tlmenej miere u potkanov liečených warfarínom. Rovnaké tepny sa tiež kalcifikujú u potkanov ošetrených warfarínom a kalcifikácia tiež začína v rámci elastickej lamely aortálneho média. Kalcifikácia však postupuje pomalšie u potkanov liečených warfarínom a má fokálny a diskontinuálny vzhľad, na rozdiel od kalcifikácie pozorovanej u myší s deficitom MGP, ktorá tvorí súvislú kalcifikačnú vrstvu, ktorá zahŕňa celé arteriálne médium. Veríme, že tlmený rozsah kalcifikácie vyvolanej warfarínom u potkanov je spôsobený skutočnosťou, že y-karboxylácia MGP nebola úplne inhibovaná dávkami warfarínu, ktoré sme použili. Je však tiež možné, že proteín je v skutočnosti úplne ne-γ-karboxylovaný pri týchto dávkach warfarínu a že ne-γ-karboxylovaný proteín si zachováva určitú zvyškovú aktivitu ako inhibítor kalcifikácie. Hlavným rozdielom medzi fenotypom myši s deficitom MGP a potkana ošetreného warfarínom je absencia zníženého rastu kostí, osteopénie a zlomenín u potkanov liečených warfarínom, ktoré sú znakmi myšieho fenotypu po 3 týždňoch veku. Jedným z možných vysvetlení tohto rozdielu je, že defekt MGP y-karboxylácie produkovaný warfarínom nemá žiadny vplyv na metabolizmus kostí. Je tiež možné, že potkany vo veku tých, ktoré boli použité v tejto štúdii, sú viac podobné myšiam v prvých 3 týždňoch života, v období, v ktorom neboli u myši s nedostatkom MGP pozorované abnormality rastu kostí. 12 Túto možnosť podporujú výsledky predchádzajúcich štúdií na potkanoch na warfaríne, ktoré zistili, že liečba warfarínom spôsobuje abnormálnu kalcifikáciu chrupavky rastovej platničky a sprievodné zastavenie rastu pozdĺžnych kostí, ktoré sú v zásade identické s tými, ktoré sa pozorujú u myší s nedostatkom MGP, ale ktoré sa vyskytujú len u potkanov vo veku 4 mesiacov alebo starších. 14 21

Záhadným znakom myšieho fenotypu s nedostatkom MGP a syndrómu potkanov ošetrených warfarínom je absencia dôkazu kalcifikácie na iných miestach tkaniva, o ktorých je známe, že exprimujú MGP vysokou rýchlosťou. Jednou z možností je, že hlodavce udržiavané na starostlivo zostavenom krmive bez stresov, s ktorými by sa v prírode mohli stretnúť, môžu mať veľmi malú tendenciu vápenatieť väčšinu mäkkých tkanív. Jedným testom tejto hypotézy bude skúmanie kalcifikácie vybraných mäkkých tkanív u zvierat liečených warfarínom, ktoré boli podrobené diétnym manipuláciám, ako sú zmenené hladiny vápnika a fosfátu. V tejto súvislosti stojí za zmienku, že kalcifikácia obličiek je už dlho problémom krmív pre hlodavce a že odstránenie tohto problému pri diétach, ako je tá, ktorá sa tu používa, si vyžaduje starostlivú úpravu obsahu vápnika a fosfátu v potrave. 24 25 26 Je preto možné, že diéty s rôznym obsahom vápnika a fosfátu a rôznym pomerom vápnika k fosfátu povedú k urýchlenej kalcifikácii obličiek a iných mäkkých tkanív u potkanov ošetrených warfarínom. Ďalším testom hypotézy, že MGP funguje ako kalcifikačný inhibítor v tkanivách iných ako tepny, bude podrobenie potkanov ošetrených warfarínom stresom, o ktorých je známe, že spôsobujú systémovú alebo fokálnu kalcifikáciu na cievnych miestach u ľudí, ako je urémia, trauma tkaniva a rakovina.

Arteriálna kalcifikácia a mechanizmus činnosti MGP

Predchádzajúce štúdie na myšiach s nedostatkom MGP a súčasná štúdia na potkanoch ošetrených warfarínom poskytujú silný dôkaz, že MGP funguje in vivo ako inhibítor kalcifikácie. Pokiaľ je nám známe, nebol stanovený žiadny iný proteín, ktorý by mal túto funkciu in vivo, a žiadny iný proteín nemá cielenú deléciu, ktorá spôsobuje zvýšenú kalcifikáciu akéhokoľvek tkaniva. Skutočnosť, že kalcifikácia tepien je u zvierat taká rozsiahla, že buď neexprimujú tento gén, alebo nemôžu γ-karboxylovať tento proteín, silne argumentuje proti hypotéze, že vo vaskulárnom tkanive existuje ekvivalentne aktívny inhibítor kalcifikácie a že MGP má iba záložnú funkciu. pri prevencii kalcifikácie tohto tkaniva. Zdá sa pravdepodobnejšie, že MGP je ústredným prvkom procesu, ktorým je kalcifikácia artérií normálne inhibovaná in vivo.

Pôvod kalcifikácie v rámci elastických lamiel média tepien u myší s nedostatkom MGP a potkanov ošetrených warfarínom naznačuje, že elastické lamely tepien sú náchylné na kalcifikáciu in vivo. Túto hypotézu podporujú štúdie, ktoré ukazujú, že elastické lamely sú prvými miestami arteriálnej kalcifikácie u ľudí a že akumulácia kalcifikácie v týchto elastických lamelách začína v druhej dekáde života a s vekom sa postupne zvyšuje. 27 28 29 30 31 32 Elastín sa tiež ukázal ako účinný a reprodukovateľný iniciátor kalcifikácie in vitro. 33 34 35 36 37 38 39 In vitro kalcifikácia elastínu prebieha v sére a neutrálnych pufrovaných roztokoch pri fyziologických koncentráciách vápnika a fosfátu. Toto zistenie je vo výraznom kontraste s výsledkami väčšiny štúdií o kalcifikácii vyvolanej makromolekulami alebo bunkovou kultúrou, ktoré sa na dosiahnutie kalcifikácie spoliehali na suprafyziologické koncentrácie vápnika a fosfátu alebo látky β-glycerofosfát.

Ohnisková povaha kalcifikácie v aorte potkanov ošetrených warfarínom môže poskytnúť pohľad na mechanizmus, ktorým MGP normálne inhibuje arteriálnu kalcifikáciu in vivo.U myší s deficitom MGP nie je pozorovaná fokálna mineralizácia, pravdepodobne preto, že je tak malá schopnosť inhibovať kalcifikáciu, že všetky mnohé kryštálové jadrá generované elastínom môžu rásť a vytvárať tak pevný list mediálnej kalcifikácie. U potkanov liečených warfarínom by schopnosť inhibovať kalcifikáciu pravdepodobne zostala dostatočná na inaktiváciu väčšiny kryštálových jadier, pravdepodobne procesom, ktorý zahŕňa priamu väzbu MGP na minerálny povrch. Niekoľko jadier by však narástlo a dosiahlo kritickú veľkosť kalcifikácie, pri ktorej generovanie zárodočných kryštálov prevyšuje schopnosť zvyškovej aktivity MGP inhibovať kalcifikačnú reťazovú reakciu a kalcifikácia by sa v tomto prípade ohniskovo rozšírila do elastických lamiel a prípadne medzi ne stránky.

Podrobný mechanizmus MGP, ktorý najlepšie vyhovuje dostupným údajom, je ten, v ktorom sa proteín pevne a selektívne viaže na jadrá kryštálov hydroxyapatitu a zabraňuje ich rastu a schopnosti naočkovať dcérske kryštály. Je tiež možné, že predpokladané kryštály potiahnuté MGP môžu bunky rozpoznať v blízkosti nukleačných miest elastínu a že bunky môžu niektoré z týchto potiahnutých kryštálov vyčistiť a rozpustiť v bunke. Inhibičná aktivita kalcifikácie MGP je pravdepodobne vysoko regulovaná, čo môže vysvetľovať karboxylové koncové spracovanie MGP 10 a prítomnosť fosfoserínu na 3 konzervovaných miestach čiastočnej fosforylácie. 11 Táto inhibičná aktivita musí byť poháňaná neobvykle silnou asociáciou proteínu s minerálnymi jadrami. Špekulujeme, že táto asociácia zahŕňa silné bočné interakcie medzi susednými molekulami MGP viazanými na minerály a že táto laterálna interakcia odráža schopnosť MGP sa asociovať. Predtým sme ukázali, že MGP je vysoko nerozpustný in vitro kvôli svojej tendencii k asociácii a že táto vlastnosť proteínu je v MGP zachovaná od druhov od žraloka po človeka. 19

Účinok warfarínu na expresiu MGP v tepnách

Súčasná štúdia preukázala, že warfarín spôsobuje zvýšenú hladinu expresie MGP mRNA a akumuláciu antigénu MGP v aorte. Najpravdepodobnejším vysvetlením nárastu MGP mRNA v aorte je zvýšená syntéza proteínu bunkami hladkého svalstva ciev v reakcii na kalcifikáciu aortálneho média. O bunkách hladkého svalstva ciev je známe, že exprimujú MGP mRNA v bunkovej kultúre 6 a v miestach kalcifikácie v aterosklerotických plakoch. 40 41 V anatómii aortálneho média potkana sú bunky cievneho hladkého svalstva rozptýlené medzi každou elastickou lamelou. Pretože kalcifikácia začína v rámci elastickej lamely, je možné, že vaskulárne bunky hladkého svalstva snímajú prítomnosť blízkych oblastí kalcifikujúceho elastínu a reagujú zvýšenou expresiou MGP, aby pomohli zastaviť ďalší rast kalcifikácie. Sú potrebné štúdie na koreláciu bunkových hladín MGP mRNA v bunkách hladkého svalstva tepny s blízkosťou týchto buniek k aktívnej kalcifikácii elastických lamiel a na identifikáciu mechanizmov, pomocou ktorých bunky vnímajú blízke miesta prebiehajúceho narastania vápnika.

Dramatické 13-násobné zvýšenie hladiny antigénu MGP v aorte po 4 týždňoch liečby warfarínom pravdepodobne pochádzalo z MGP vylučovaného bunkami hladkého svalstva ciev v aorte a MGP bol pravdepodobne viazaný na samotnú kalcifikáciu. Túto poslednú hypotézu podporuje skutočnosť, že MGP sa môže z aorty uvoľňovať iba demineralizáciou tkaniva. Ak sa MGP v skutočnosti akumuluje na povrchu kryštálov v priebehu arteriálnej kalcifikácie, môže byť múdrejšie vyjadriť obsah MGP v aorte na jednotku minerálneho vápnika než na miligram sušiny. Keď je vyjadrený týmto spôsobom, obsah MGP v kalcifikujúcej aorte je >20-krát vyšší ako v kosti (tabuľka 1) alebo v akomkoľvek inom doteraz skúmanom tkanive. 4 Najjednoduchším vysvetlením tohto pozorovania je, že lokálna koncentrácia MGP sa môže udržiavať na oveľa vyššej úrovni v blízkosti miest arteriálnej mineralizácie, než je tomu v prípade kostí.

Skutočnosť, že MGP sa akumuluje v kostnej metafýze a aorte potkana ošetreného warfarínom (tabuľka 1) napriek pravdepodobnej nedostatočnej γ-karboxylácii proteínu, naznačuje, že γ-karboxylácia MGP nie je potrebná na väzbu na kalcifikujúce tkanivá a prípadne na apatit v týchto tkanivách. Na podporu tejto hypotézy sme zistili, že tepelná dekarboxylácia MGP in vitro neovplyvňuje schopnosť proteínu viazať sa na sérum na hydroxyapatit. Ak sa non-γ-karboxylovaný MGP akumuluje v kalcifikujúcej aorte kvôli jeho schopnosti viazať sa na hydroxyapatit v tomto tkanive, nie je jasné, prečo ne-γ-karboxylovaný proteín nedokáže zastaviť rast minerálu.

Dávka warfarínu a kalcifikácia tepien

Dramatický rozdiel medzi úplnou absenciou kalcifikácie tepien pri dávke warfarínu podávanou raz za 24 hodín a rozsiahlou a rýchlou kalcifikáciou tepien s dvojnásobnou dávkou podávanou každých 12 hodín môže byť čiastočne spôsobený rýchlym klírensom warfarínu z plazmy v potkan. Predchádzajúce štúdie ukázali, že warfarín sa vylučuje z plazmy potkanov s polčasom 5 hodín a polčas na klírens warfarínu nie je ovplyvnený vekom alebo pohlavím zvieraťa. 42 Polčas klírensu warfarínu nie je ovplyvnený dávkou warfarínu, 43 a R a S enantioméry warfarínu sa odstraňujú približne rovnakou rýchlosťou. 44 Vzhľadom na rýchly klírens warfarínu z plazmy klesne koncentrácia warfarínu dosiahnutá krátko po jednorazovej subkutánnej injekcii liečiva na 20% tejto hodnoty za 12 hodín a na <4% tejto hodnoty do 24 hodín. Denná schéma injekcií, ako sa používa v našej skoršej verzii protokolu warfarín plus vitamín K, 13 14 15 21 preto spôsobí výrazné oscilácie v plazmatickej koncentrácii lieku. Ak je účinok warfarínu na y-karboxyláciu proteínov v extrahepatálnych tkanivách úmerný plazmatickej koncentrácii liečiva, denný injekčný protokol spôsobí vážne poškodenie y-karboxylácie krátko po podaní warfarínu, po ktorom nasleduje podstatné zotavenie do času ďalšia injekcia o 24 hodín. Tu použitý 12-hodinový injekčný protokol by naopak spôsobil 12-hodinovú osciláciu medzi koncentráciou warfarínu krátko po injekcii a koncentráciou, ktorá je 20% tejto hladiny, a preto by umožnila podstatne kratší čas pri nižších plazmatických hladinách warfarínu pre obnovenie stavu y-karboxylácie extrahepatálneho proteínu.

Možno argumentovať, že kontinuálny rast kalcifikačných jadier do veľkých ložísk nerastov je v skutočnosti viac závislý od minimálnej hladiny warfarínu v plazme počas každých 24 hodín ako od maximálnej hladiny. Je to preto, že proces mineralizácie je autokatalytický proces, podobne ako reťazová reakcia, ktorý potrebuje na udržanie rastu nepretržitú rýchlosť generovania kryštálových jadier. Keď hladina y-karboxylácie MGP stúpne do tej miery, že aktivita MGP vylučovaného v blízkosti miesta kalcifikácie je dostatočná na zníženie úrovne vytvárania kryštálových jadier pod úroveň potrebnú na udržanie mineralizačnej reťazovej reakcie, rast minerálnej fázy bude prestaň. Pretože normálne y-karboxylovaný MGP by teraz pravdepodobne potiahol a tým inaktivoval minerálne povrchy, následná dávka warfarínu by nebola schopná reštartovať rast minerálov na tomto mieste. Denná dávka warfarínu potrebná na vyvolanie arteriálnej kalcifikácie by preto bola určená potrebou udržiavať plazmatickú koncentráciu liečiva nad danou hodnotou počas každých 24 hodín.

Dávka vitamínu K, koagulácia krvi a kalcifikácia tepien

Zmena z danej dávky warfarínu podávanej každých 24 hodín na dvojnásobok tejto dávky podávanej každých 12 hodín ovplyvňuje dávku vitamínu K potrebnú na potlačenie účinku warfarínu na zrážanlivosť krvi. Keď sa zvieratá udržiavali v novom režime vyšších dávok warfarínu a predchádzajúcej dávke vitamínu K 0,75 mg/100 g, koagulačné časy krvi boli dlhšie ako normálne a príležitostne sa vyskytlo krvácanie okolo miest podkožného vpichu. Zdvojnásobenie tejto dávky vitamínu K obnovilo normálne koagulačné časy a eliminovalo krvácanie v miestach vpichu. Schopnosť vitamínu K pôsobiť proti účinku warfarínu na γ-karboxyláciu faktorov zrážania krvi pečeňou bola preukázaná v skorších štúdiách. 15 16

Naopak, zdvojnásobenie dávky vitamínu K významne neovplyvnilo rozsah kalcifikácie artérií spôsobený novým režimom dávkovania vyššieho warfarínu. Neschopnosť vitamínu K pôsobiť proti účinku warfarínu na syntézu kostného proteínu Gla osteoblastmi v kosti bola zaznamenaná v predchádzajúcich štúdiách, 15 a špekulovalo sa, že vitamín K môže pôsobiť proti účinku warfarínu iba v miestach faktora zrážania krvi. syntéza v hepatocytoch. 15 Výsledky súčasnej štúdie podporujú túto hypotézu a naznačujú, že artérie a kostné bunky zdieľajú mechanizmus recyklácie epoxidovej reduktázy, ktorý je inhibovaný warfarínom spôsobom, ktorý nemožno ovplyvniť ani vysokými dávkami vitamínu K.

Zrýchľuje defektná karboxylácia MGP kalcifikáciu mäkkých tkanív u ľudí?

Výsledky súčasnej štúdie naznačujú, že je možné, že porucha y-karboxylácie MGP u ľudí by mohla urýchliť kalcifikáciu tepien a srdcových chlopní. Možný význam príjmu vitamínu K pre kalcifikáciu tepien podporuje nedávna správa, že nižší príjem vitamínu K v strave koreluje so zvýšenou kalcifikáciou aorty u ľudí. 45 Aby sme ďalej otestovali hypotézu, že defektná y-karboxylácia MGP prispieva k arteriálnej kalcifikácii, a aby sme stanovili príjem vitamínu K potrebný na opravu tohto defektu, v súčasnosti vyvíjame testy na meranie stavu y-karboxylácie plazmatického MGP analogického s hydroxyapatitom. väzbový test, ktorý sme vyvinuli skôr na určenie stavu y-karboxylácie kostného proteínu Gla v sére. 13

Postava 1. Účinok liečby warfarínom na rast. Šesťtýždňovým samcom potkanov Sprague-Dawley sa podávali injekcie samotného vitamínu K každých 24 hodín alebo vitamínu K každých 24 hodín a warfarínu každých 12 hodín. Údaje sú priemerné hmotnosti stanovené pre potkany v každej skupine. (Podrobnosti nájdete v časti Metódy.)

Obrázok 2. Účinok liečby warfarínom na kalcifikáciu aorty. Rezy ukazujú brušnú aortu potkanov liečených warfarínom každých 12 hodín a vitamínom K každých 24 hodín počas 2, 3, 4 a 5 týždňov. Segment brušnej aorty medzi obličkovou vetvou a bifurkáciou iliaca bol odstránený pri pitve a fixovaný v 10% pufrovanom formalíne a pozdĺžne rezy boli zafarbené von Kossovým farbením, aby sa zistili oblasti mineralizácie.

Obrázok 3. Fotografia krčnej tepny (in situ) po 4 týždňoch liečby warfarínom (odobratá pomocou pitevného mikroskopu). Všimnite si biele pásy obvodovej kalcifikácie. (Čiary v blízkosti tepny sú srsťou z počiatočného pitvy zvieraťa.)

Obrázok 4. Rádiografia aorty a krčných tepien od potkana ošetreného warfarínom počas 5 týždňov. Abdominálna aorta a obe krčné tepny boli odobraté pri pitve a röntgenovo snímkované. Všimnite si bodkované oblasti mineralizácie v každej tepne.

Obrázok 5. Northern blot analýza hladín MGP mRNA v aorte potkanov, ktorým sa 4 týždne podával warfarín a samotný vitamín K alebo K. RNA sa extrahovala z hrudnej aorty a 40 μg celkovej RNA z každej aorty sa nechalo bežať na 1,4% formaldehyd-agarózovom géli, blotovalo sa na membránu Nytran a hybridizovalo sa s 32 P-značenou MGP cDNA a 32P-značenou cDNA pre GAPDH. Dráha 1, Celková RNA z normálnych potkaních obličkových buniek, výdatný zdroj MGP mRNA. 3 46 dráh 2 až 5, celková RNA z hrudnej aorty 2 warfarínom ošetrených a 2 kontrolných potkanov.

Obrázok 6. Účinok liečby warfarínom na kalcifikáciu srdcovej chlopne aorty. Potkanom ošetrovaným počas 4 týždňov warfarínom a vitamínom K alebo samotným vitamínom K sa pitve odobrali srdcia. Potom boli rezy narezané v každom srdci a zafarbené von Kossovým farbivom na detekciu oblastí mineralizácie. Jediné oblasti kalcifikácie boli nájdené v aortálnej srdcovej chlopni (tento obrázok) a koronárnych artériách (nezobrazené) potkanov ošetrených warfarínom.

Stôl 1. Účinok upraveného protokolu o liečbe warfarínom na hladinu vápnika a MGP v tkanivách potkanov

ND znamená neurčené. Potkany boli liečené 4 týždne warfarínom plus vitamínom K alebo samotným vitamínom K. Pri pitve sa každému potkanovi odobrala hrudná aorta, obličky, pľúca a metafýza a epifýza proximálnej holennej kosti, vysušila sa a odvážila. Každé tkanivo bolo demineralizované s 10-násobným prebytkom (hmotn./obj.) 10% kyseliny mravčej a kyslé extrakty boli analyzované na obsah vápnika a MGP (pozri metódy). Výsledky sú priemerné hodnoty pre 2 zvieratá z každej skupiny.

Tabuľka 2 Účinok modifikovaného protokolu liečby warfarínom na hladinu MGP v sére

Hodnoty sú priemer ± SD. Úroveň MGP sa stanovila rádioimunologickým testom séra potkanov ošetrených počas 1 až 5 týždňov warfarínom plus vitamínom K alebo samotným vitamínom K.

Túto prácu čiastočne podporila služba verejného zdravotníctva USA (grant AR27029). Ďakujeme Kien Trinh za pomoc s postupmi Northern blot a Amande Wallace za pomoc pri ošetrení zvierat.


Enzýmy sú proteíny, ktoré pôsobia ako katalyzátory v biochemickej reakcii na zvýšenie rýchlosti reakcie bez toho, aby sa pri reakcii spotrebovali. Vo vašom tele pôsobia tisíce typov enzýmov, ktoré vykonávajú životne dôležité funkcie, ako je trávenie a produkcia energie. Biologické a chemické reakcie môžu prebiehať veľmi pomaly a živé organizmy používajú enzýmy na zvýšenie reakčných rýchlostí až na priaznivejšiu rýchlosť. Enzýmy majú niekoľko oblastí, ktoré je možné aktivovať kofaktormi na ich zapnutie a vypnutie. Kofaktormi sú zvyčajne vitamíny spotrebované prostredníctvom rôznych zdrojov potravy a otvárajúce aktívne miesto enzýmu. Aktívne miesta sú miesta, kde prebiehajú reakcie na enzýme a môžu pôsobiť iba na jeden substrát, ktorým môžu byť iné proteíny alebo cukry. Dobrým spôsobom, ako o tom premýšľať, je model zámku a kľúča. Len jeden kľúč môže správne otvoriť zámok. Podobne sa na substrát môže prichytiť iba jeden enzým a urýchliť tak reakciu.

Vaše telo obsahuje asi 3 000 jedinečných enzýmov, z ktorých každý urýchľuje reakciu na jeden konkrétny proteínový produkt. Enzýmy môžu spôsobiť, že vaše mozgové bunky budú pracovať rýchlejšie a pomôžu vám vytvoriť energiu na pohyb svalov. Hrajú tiež veľkú úlohu v tráviacom systéme, vrátane amyláz, ktoré štiepia cukor, proteáz, ktoré rozkladajú bielkoviny, a lipáz, ktoré rozkladajú tuk. Všetky enzýmy pôsobia na kontakt, takže keď jeden z týchto enzýmov príde do kontaktu so správnym substrátom, začne okamžite fungovať.


Western blotting

Protilátky sa môžu použiť v metóde nazývanej Western blotting, ktorá je užitočná na stanovenie hladín expresie proteínov a na testovanie proteínov počas purifikácie. Táto metóda zvyčajne zahŕňa nasledujúce kroky:

  1. Vzorka proteínu sa podrobí polyakrylamidovej gélovej elektroforéze.
  2. Potom sa gél umiestni na vrstvu nitrocelulózy a proteín v géli sa elektroforeticky prenesie na nitrocelulózu.
  3. Nitrocelulóza sa potom namočí do želatíny, aby sa "zablokovala" jej schopnosť nešpecificky viazať proteíny.
  4. Nitrocelulóza sa potom inkubuje so špecifickou protilátkou na požadovaný proteín.
  5. Nitrocelulóza sa potom inkubuje s druhou protilátkou, ktorá je špecifická pre prvú protilátku. Napríklad, ak bola prvá protilátka vypestovaná u králikov, druhá protilátka by sa mohla nazývať "vtáčie anti-králičie imunoglobulíny". Čo to znamená, že králičie imunoglobulíny boli použité na vyvolanie protilátkovej odpovede u kôz. Kozie protilátky (polyklonálne) budú zahŕňať tie, ktoré rozpoznávajú konzervovanú oblasť v králičích protilátkach. Pretože je oblasť Fc konzervovaná, bude sa viazať na všetky a všetky králičie protilátky, vrátane protilátok na nitrocelulózovom papieri.
  6. Druhá protilátka bude mať typicky kovalentne naviazaný enzým, ktorý, keď je poskytnutý s chromogénnym substrátom, spôsobí farebnú reakciu.
  7. Molekulová hmotnosť a množstvo požadovaného proteínu sa teda dajú charakterizovať z komplexnej zmesi (napríklad zo surového bunkového extraktu) iných proteínov.

Vo variante vyššie uvedeného môže byť vzorka proteínu nanesená priamo na nitrocelulózový papier (nazývaný a dot blot ) bez toho, aby ste najskôr spustili gél. To môže byť žiaduce, ak je napríklad protilátka monoklonálna a rozpoznáva epitop, ktorý závisí od natívnej štruktúry (ktorá by bola zničená pri spustení stránky SDS PAGE).

Okrem ich rôzneho použitia je možné protilátky použiť aj na čistenie proteínov.

  • Ak je možné získať relatívne veľké množstvá protilátky, môžu byť kovalentne pripojené k chromatografickej živici (napr. sephadexové guľôčky).
  • Ak sa cez takú kolónu nechá prejsť surový bunkový extrakt, mal by sa viazať iba požadovaný proteín a všetko ostatné ním pretečie.
  • Naviazaný proteín sa potom môže eluovať. To sa zvyčajne dosahuje pri podmienkach mierne nízkeho pH (použitím kyseliny octovej). Pokiaľ požadovaný proteín nie je za týchto podmienok nevratne denaturovaný, bude metóda fungovať celkom dobre.
  • Jedno potenciálne úskalia zahŕňa monoklonálne protilátky, ktoré sa používajú na čistenie mutantných proteínov. Oblasti proteínu obsahujúce epitop nemožno modifikovať bez toho, aby sa zničila schopnosť protilátky viazať sa. Takže použitie monoklonálnych protilátok v purifikačnej schéme môže zabrániť ich použitiu pri purifikácii určitých mutantov.

Proteínovú purifikáciu možno považovať za sériu frakcionačné kroky navrhnuté tak, aby:

  • Požadovaný proteín sa nachádza takmer výlučne v jednej frakcii (a s dobrým výťažkom)
  • Významné množstvo kontaminantov možno nájsť v inej frakcii

Počas čistenia budete musieť sledovať niekoľko parametrov, vrátane:

  1. Celkový objem vzorky
  2. Celková vzorka bielkovín (možno odhadnúť podľa A.280 1.4

Tieto základné informácie vám umožnia sledovať nasledujúce informácie počas každého kroku čistenia:

  1. % výťažok pre každý krok čistenia
  2. Špecifická činnosť požadovaného proteínu (jednotky/mg celkového proteínu)
  3. Zlepšenie čistenia každého kroku (napr. "3,5x čistenie)

Pri navrhovaní schémy čistenia musíte spravidla vyvážiť čistenie s výťažok .

  • Napríklad môže byť relatívne jednoduché získať 90% čistý materiál s dobrým výťažkom.
  • Avšak môže byť ťažké zlepšiť túto čistotu o niekoľko percentilov s dobrým výťažkom.
  • Plánovaná aplikácia purifikovaného proteínu určuje cieľovú čistotu .
  • Ak sa má proteín použiť na stanovenie informácií o sekvencii aminokyselín, je prijateľných 90%. Ak sa však materiál má použiť v klinických skúškach, cieľová čistota môže byť 99,99+%.

Počiatočné kroky čistenia

Obrázok 4.1.1:Kroky čistenia

  • Je mimoriadne užitočné mať nejaké informácie nielen o všeobecných fyzikálnych a chemických vlastnostiach proteínu, ktorý sa pokúšate vyčistiť, ale aj o kontaminujúce komponentov.
  • Napríklad veľa E. coli proteíny sú spravidla nízka molekulová hmotnosť (& lt50,000 Da) a trochu kyslý v izoelektrickom bode

Počiatočné kroky purifikácie obvykle využívajú všeobecné fyzikálne a/alebo chemické rozdiely medzi rozpustnými proteínmi a inými bunkovými zložkami.

  • Rozpustné proteíny môžu byť napríklad oddelené od všeobecných bunkových zvyškov a neporušených buniek pomocou odstreďovanie.
  • Bunky sú teda fyzicky narušené (homogenizáciou alebo bunkovým lisom), aby sa umožnilo uvoľnenie obsahu buniek. Potom nasleduje centrifugácia, aby sa oddelili všeobecne rozpustné zložky od tých, ktoré sú nerozpustné.
  • V tomto bode sa začína zber údajov s cieľom monitorovať čistenie.

Nukleové kyseliny môžu byť niekedy ľahko odstránené zo vzorky pridaním veľkých katiónových zlúčenín, ako je napr polyetylénimín , alebo streptomycín sulfát .

  • Nukleové kyseliny sa na tieto zlúčeniny viažu elektrostatickými interakciami a komplexom zrazeniny a môžu sa odstrániť odstredením.
  • Rovnaký všeobecný výsledok je možné získať zmiešaním iónovýmenných živíc, ktoré sú aniónomeniče (t. j. živice obsahujú katiónové skupiny) a potom sa filtráciou alebo odstredením odstránia. Ako pri každej metóde, malo by sa potvrdiť, že požadovaný proteín je nie tiež viazaný.

Hrubé frakcionácie proteínov je možné dosiahnuť pridaním rôznych množstiev precipitantov ako napr síran amónny , alebo polyetylénglykol (PEG).

  • Pre tento typ purifikačného kroku sa vykoná počiatočný experiment na monitorovanie frakcie celkového proteínu, ako aj požadovaného proteínu, ktorý zostáva v roztoku (a pelete) ako funkcia koncentrácie zrážacieho činidla.

Síran amónny (% nasýtený)

Obrázok 4.1.2:Proteínová aktivita ako funkcia zrážacej koncentrácie

  • V tomto konkrétnom prípade máme šťastie: pri približne 30% síranu amónneho môžeme vyzrážať asi 80% celkovej koncentrácie proteínu v našej vzorke, ale náš test aktivity na požadovaný proteín naznačuje, že asi 95% požadovaného proteínu je stále rozpustných. .
  • Pri 80% síranu amónnom sa vyzráža všetok požadovaný proteín. Z týchto výsledkov by sme teda urobili nasledovné:
  1. Pridajte síran amónny do našej vzorky na koncentráciu 30% nasýtenia
  2. Odstreďte a zlikvidujte peletu
  3. Pridajte síran amónny do 80% nasýtenia
  4. Odstreďte a uschovajte peletu. Peleta sa resuspenduje v pufri, aby sa proteín rozpustil.
  • Očakávali by sme asi 5-násobné čistenie s asi 95% výťažkom.

Rozvinutá proteínová odpoveď

Endoplazmatické retikulum (ER) je hlavným miestom pre skladanie a dozrievanie transmembránových, sekrečných a ER-rezidentných proteínov. Poruchy, ktoré menia homeostázu ER, môžu viesť k akumulácii rozložených proteínov (UP), ktoré sú hrozbou pre všetky živé bunky. Bunky, aby sa vyrovnali so stresom, aktivujú intracelulárnu signálnu dráhu - rozvinutú proteínovú odpoveď (UPR). UPR je integrovaná intracelulárna signálna dráha, ktorá prenáša informácie o stave skladania proteínu v lúmene ER do cytoplazmy a jadra. UPR zahŕňa transkripčnú indukciu génov UPR (červené šípky), translačný útlm globálnej syntézy proteínov (čierne šípky) a degradáciu spojenú s ER (ERAD) (zelené šípky). Tieto rozdielne výstupy poskytujú adaptívne reakcie na prežitie. Ak sa chyba skladania proteínu neopraví, bunky sa podrobia apoptóze (svetlo modré šípky). Tri hlavné prevodníky UPR sú PERK, IRE1 a ATF6. Obr

PERK je ER transmembránová proteínkináza, ktorá fosforyluje apodjednotku translačného iniciačného faktora 2 (eIF2a) v reakcii na stres ER. Fosforylácia eIF2α znižuje tvorbu komplexov inicializácie translácie, čo vedie k zníženému rozpoznávaniu iniciačných kodónov AUG, a teda k všeobecnému translačnému útlmu. Táto translačná kontrola poskytuje účinný mechanizmus na zníženie počtu nezložených proteínov v ER. Paradoxne je zvýšená translácia selektívnych mRNA, ktoré majú nižšiu požiadavku na eIF2 a komplex iniciácie translácie, ako je mRNA kódujúca aktivačný transkripčný faktor ATF4. Transkripcia GADD34 je indukovaná UPR prostredníctvom ATF4 a proteínový produkt rekrutuje proteínovú fosfatázu 1 (PP1), aby defosforyloval eIF2a-P a zvrátil translačný útlm.

ATF6 je ER transmembránový aktivačný transkripčný faktor. Po ER strese prechádzajú ATF6a a ATF6p do Golgiho kompartmentu, kde sú štiepené proteázami S1P a S2P, čím sa získa cytosolický fragment. Voľný fragment ATF6 migruje do jadra, aby aktivoval transkripciu.

IRE1 je ER transmembránový glykoproteín a obsahuje aktivity kinázy aj RNázy v cytoplazmatickej doméne. ER stres vedie k jeho autofosforylácii a následnej aktivácii aktivity RNázy. Substrát IRE1a a IRE1p u cicavcov, XBP1 mRNA, kóduje transkripčný faktor obsahujúci bázický leucínový zips. Zostrih mRNA XBP1 je iniciovaný aktivitou RNázy IRE1 za vzniku zrelej mRNA XBP1. Zatiaľ čo dráhy ATF6 a PERK nie sú konzervované v nižších eukaryotoch, signálna dráha IRE1 je konzervovaná vo všetkých známych eukaryotických bunkách.

Signalizácia od downstream efektorov IRE1, PERK a ATF6 sa zlučuje v jadre, aby sa aktivovala transkripcia cieľových génov UPR. Cicavčí ER stresový prvok (ERSE) je prítomný v promótorových oblastiach mnohých, ale nie všetkých, UPR cieľových génov. XBP1, ATF6 a CAAT-väzbový faktor (CBF), ktoré sa všetky viažu na ERSE, spolu s ATF4, aktivujú transkripčnú indukciu cieľových génov. ATF6 tiež indukuje transkripciu XBP1, čím poskytuje pozitívnu spätnú väzbu pre UPR. Najmä upregulácia molekulárnych chaperónov a skladanie katalyzátorov zvyšuje kapacitu skladania ER, čím poskytuje ochranný účinok na prežitie buniek. Aktivovaný Ire1p v kvasinkách navyše indukuje transkripciu génov, ako napr INO1, ktoré sprostredkovávajú biosyntézu fosfolipidov na zvýšenie objemu ER.

UPR tiež indukuje transkripciu génov kódujúcich proteíny, ktoré sprostredkovávajú ERAD. Táto dôležitá zložka UPR stimuluje degradáciu a odstraňovanie rozložených proteínov v lúmene ER. Zdá sa, že niekoľko cieľových génov kóduje proteíny, ktoré remodelujú sekrečnú dráhu, aby sa znížila koncentrácia UP.

BiP, ER chaperón, je hlavným regulátorom aktivácie troch proximálnych ER snímačov stresu – IRE1, PERK a ATF6. Všetky prevodníky obsahujú lumenálnu doménu, ktorá interaguje s BiP. Za normálnych podmienok slúži BiP ako negatívny regulátor aktivácie IRE1, PERK a ATF6. Po strese ER sa BiP viaže na UP, čím umožňuje uvoľnenie BIP z meničov. Uvoľňovanie BiP z IRE1 a PERK umožňuje ich homodimerizáciu a aktiváciu. Uvoľnenie BiP z ATF6 umožňuje jeho transport do Golgiho priestoru na regulovanú intramembránovú proteolýzu. Táto aktivácia regulovaná BiP poskytuje priamy mechanizmus na snímanie skladacej kapacity ER.

Predĺžená aktivácia UPR vedie k apoptotickej bunkovej smrti, v ktorej IRE1 slúži proapoptotickej funkcii. Aktivovaný IRE1 rekrutuje júnovú N-koncovú inhibičnú kinázu (JIK) a TRAF2 na aktiváciu apoptózy signalizujúcej kinázy 1 (ASK1), ktorá zase aktivuje kaspázy závislé od JNK a mitochondrií/Apaf1. Prokaspáza-12 (pCSP-12) je ER-asociovaný proximálny efektor apoptózy. Uvoľnenie TRAF2 z pCSP-12 umožňuje klastrovanie a aktiváciu CSP-12. Aktivovaný CSP-12 aktivuje CSP-9, ktorý následne aktivuje CSP-3, čo vedie k apoptóze. Pri strese ER môže aktivovaný CSP-7 štiepiť pCSP-12 za vzniku aktívneho CSP-12. Okrem toho aktivácia UPR indukuje expresiu CHOP/GADD153 prostredníctvom dráh PERK a ATF4. CHOP je proapoptotický transkripčný faktor, ktorý potencuje apoptózu. Nakoniec, v reakcii na predĺžený stres ER, útlm translácie cyklínu D1 prostredníctvom PERK vedie k zastaveniu bunkového cyklu počas fázy G1. To poskytuje kontrolný bod ER, aby sa zabránilo postupu buniek cez bunkový cyklus.

V posledných rokoch sa dosiahol obrovský pokrok v chápaní zložiek a mechanizmov UPR. Súčasné štúdie sa zameriavajú na aspekty patologických a fyziologických úloh UPR.