Informácie

Plazmidy DNA sa zriedia destilovanou vodou

Plazmidy DNA sa zriedia destilovanou vodou


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Práve som extrahoval DNA plazmid z E.Coli a zrieďte ich v EB pufri. Práve som však prišiel na to, že ďalší krok, ktorým je elektroporácia, vyžadoval, aby sa plazmid DNA zriedil v destilovanom H2O. Môže mi niekto pomôcť vedieť, ako preniesť DNA plazmid z EB pufra do Destilovaného H2O? Aby bolo jasné, EB pufer, ktorý som použil, je od spoločnosti Qiagen. Obsahuje 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. https://www.qiagen.com/sg/resources/faq?id=d8ef773f-6a37-4993-908b-8bbc7bc5c8d6&lang=sk


Pufer EB je jednoducho 10 mM Tris pufor, pH 8,5. Myslím, že sa obávate o ióny prítomné vo vašej elektroporácii. Je potrebné zvážiť dve veci:

  1. Aká je koncentrácia vašej DNA a koľko potrebujete na elektroporáciu?
  2. V ktorom konečnom objeme prebieha elektroporácia?

Podľa mojich skúseností zvyčajne pridáte veľmi malé množstvo DNA (niekoľko mikrolitrov) do konečného objemu 100, 250 alebo 400 µl (v závislosti od použitých kyviet). Tu malé množstvo Tris neruší a nespôsobuje skrat.


B1- Bunková biológia

V druhej fáze prebieha mitóza. Na každý koniec bunky sa natiahne jedna sada chromozómov. Jadro sa tiež delí.

Teplota
Čím vyššia je teplota, tým väčšia je rýchlosť difúzie. Je to preto, že molekuly majú viac kinetickej energie, a preto sa pohybujú rýchlejšie

na výrobu 3 valcov zemiakov použite korkovár- Použitím korkovrtu sa zabezpečí, že valce budú mať rovnaký priemer

Skalpelom orežte valce na rovnakú dĺžku (asi 3 cm)

Zmerajte dĺžku každého valca pomocou pravítka a hmotnosť každého valca

Teraz vložte každý valec do skúmavky a pridajte nasledujúce:
- 0,5 molárny roztok cukru
- 0,25 molárneho roztoku cukru
- destilovaná voda

Zemiakové valce nechajte cez noc, aby mohla prebiehať osmóza

Odstráňte valce so zemiakmi a naviňte ich na papierovú utierku, aby ste odstránili všetku povrchovú vlhkosť


B. Koncentrácia nukleových kyselín vyzrážaním

Koncentrácia DNA zrážaním izopropanolom

Pokiaľ je purifikovaná genómová alebo plazmidová DNA príliš zriedená pre zvolenú následnú aplikáciu, DNA môže byť koncentrovaná zrážaním izopropanolom.

  1. K vyčistenej vzorke sa pridá 0,7 objemu izopropanolu pri izbovej teplote.
  2. Vortexujte a potom rotujte 15 minút pri 5 000 × g pri 4 ° C.
  3. Odstráňte supernatant dekantáciou a dávajte pozor, aby ste neporušili peletu.
  4. Pridajte 2 ml 70% etanolu, ktorý bol predchladený na 4 ° C. Krátko premiešajte vortexovaním a otáčajte 10 minút pri 5 000 × g pri 4 ° C.
  5. Opatrne odstráňte supernatant bez narušenia pelety. Sušte na vzduchu 5 - 10 min. Pelety nepresušte, pretože by to sťažilo opätovné rozpustenie DNA.
  6. Resuspendujte DNA v požadovanom objeme vhodného pufra (naprTE pH 8,0 alebo 10 mM Tris-HCI pH 8,5). Aby sa zabezpečilo úplné rozpustenie pelety, inkubujte 1 hodinu pri 55 ° C.

Koncentrácia mRNA vyzrážaním

(Upravené z protokolu v súprave QuickPrep mRNA Kit.)

Roztok glykogénu: 5-10 mg/ml glykogénu vo vode bez RNázy alebo ošetrenej DEPC*

Octan draselný: 2,5 M roztok octanu draselného (pH 5,0) (pripravený s použitím vody bez RNázy alebo upravenej DEPC)

Voda upravená DEPC: Pripravte 0,1 % (v/v) roztok dietylpyrokarbonátu v destilovanej vode, dôkladne pretrepte a nechajte stáť cez noc pri teplote miestnosti. Autoklávujte roztok nasledujúci deň s uvoľneným uzáverom. Namiesto vody upravenej DEPC sa v tomto protokole môže použiť komerčne dostupná voda bez RNázy.

* 0,1 % vody upravenej DEPC.

1. Pridajte 75 µl (1/10 objemu) roztoku octanu draselného a 10 µl roztoku glykogénu do 0,75 ml mRNA vo vode bez RNázy. Pridajte 1,5 ml chladeného 95% etanolu (2 až 2,5 objemu) a inkubujte vzorku pri -20 ° C minimálne 15 minút. Množstvo glykogénu by malo zostať konštantné bez ohľadu na objem vzorky.

2. Odoberte mRNA odstredením pri max. rýchlosti v mikrocentrifúge pri 4 °C počas 10 min. Ak sa RNA nepoužije ihneď, skladujte ju v tomto vyzrážanom stave (v etanole) pri -80 °C.

3. Supernatant sa dekantuje a skúmavka sa prevráti cez čistý papierový uterák. Jemne poklepte hadičkou na uterák, aby ste uľahčili odstránenie prebytočnej tekutiny. Peletu opatrne premyte napipetovaním 1 ml vopred vychladeného 80 % etanolu do skúmavky a niekoľkokrát jemne prevráťte. Odstreďujte pri plnej rýchlosti pri 4 ° C počas 10 minút. Dekantujte etanol a nechajte uschnúť na vzduchu. Keď sú všetky stopy etanolu preč, rozpustite vyzrážanú RNA vo vhodnom objeme vody bez RNázy. Na stanovenie vhodného resuspendačného objemu zvážte požadovanú koncentráciu RNA, koncentráciu pred zrážaním a objem vzorky podrobenej zrážaniu. Percento RNA izolovanej po vyzrážaní však bude závisieť od celkového prítomného množstva. Napríklad s 10 μg RNA sa získa približne 70 %. Preto by ste mohli chcieť rozpustiť peletu v objeme o 25 až 50% menšom, ako by bolo potrebné, ak by sa získala všetka RNA.


Strategické plánovanie

Multiplexné luciferázové reportérové ​​vektory generované pre tento protokol sú zostavené pomocou metódy platformy pre zostavenie DNA založenej na klonovacom systéme GoldenBraid 2.0 (Sarrion-Perdigones et al., 2011, 2013 pozri článok Current Protocols in Molecular Biology od Vazquez-Vilar, et al. , 2020). Tento systém zahŕňa jednostupňovú reakciu v jednej nádobe, zmiešanie viacerých zostavených častí DNA, ktoré sa uvoľnia a spoja dohromady, aby sa v cieľovom plazmide vytvorili definované montážne produkty. Pomocou tejto montážnej platformy je možné skombinovať viacero genetických prvkov do jednoduchých transkripčných reportérových jednotiek, ktoré je potom možné ďalej kombinovať, aby sa získalo viac transkripčných reportérových jednotiek v jednom plazmide. Kombinácia všetkých reportérov do jedného vektora znižuje vyššiu variabilitu medzi experimentmi pre reportérové ​​aj kontrolné transkripčné jednotky v porovnaní s tým, keď sú všetky reportérové ​​jednotky, každá zostavená v individuálnom plazmide, kotransfekované.

Predtým sme navrhli prvý šesťnásobný multiplexný luciferázový test na skúmanie transkripčnej signalizácie prostredníctvom reakčných prvkov c-Myc, NF-κ β, TGF-β, p53 a MAPK/JNK proti konštitučne kontrolnému promótoru (promótor CMV ). Luciferázu ELuc sme umiestnili pod kontrolu CMV promótora a ďalších päť luciferáz pod kontrolu regulačných prvkov DNA aktivovaných jednou z piatich špecifických bunkových dráh. Riadiaci signál z promótora CMV sa používa na normalizáciu odčítania z každej dráhy. Multiplexný šesťnásobný luciferázový vektor a všetky požadované časti sme uložili do verejného plazmidového úložiska Addgene. V tomto protokole podrobne popisujeme rôzne kroky vykonávané počas multiplexného testovania luciferázy s použitím rovnakého multiplexného hextuple luciferázového vektora, ale aplikovaného na sondovanie zmien v piatich bunkových signálnych dráhach v bunkovej línii rakoviny pľúc A549, čo demonštruje použiteľnosť rovnakého multiplexného testu. naprieč rôznymi systémami bunkových modelov. Je však dôležité, aby vedci poznamenali, že opísaný multiplexný prístup môže byť tiež prispôsobený individuálnym potrebám začlenením iných signálnych dráh do opísaného testu, ako je vysvetlené v súčasných protokoloch v molekulárnej biológii (Sarrion-Perdigones et al., V tlači) .


Extrakcia kvasinkovej genómovej DNA - (13. marca 2007)

Mám nejaké problémy s extrahovaním gDNA z S. cerevisiae a môj kolega má rovnaký problém s C. albicans. Obaja používame súpravu a riadime sa všetkými pokynmi, ale potom, keď vzorky spustíme na agaróze, pás DNA nezodpovedá nášmu očakávaniu podľa kvantifikácií spektofotometra.

Naše výnosy sú skvelé a pomery 260/280 sú medzi 1,8-2,0. Už sme skontrolovali spektofotometer s lososovými spermiami so stálou koncentráciou, ale s vybavením je všetko v poriadku. Na extrakcii musí niečo byť.

a ak budeme pokračovať s PCR, štiepením enzýmami alebo dokonca náhodným značením primovaním, tieto postupy nefungujú/majú veľmi nízke výťažky.

je vaša DNA bez RNA?

-Agarózový pás DNA nezodpovedá našim očakávaniam podľa kvantifikácie spektofotometra.

častou príčinou je kontaminácia RNA.. čo môže spôsobiť, že údaje spektofotometra sa trochu líšia. Agarózový pás je skutočné množstvo DNA.

Pokiaľ ide o DNA, ktorá nie je rezaná reštrikčnými enzýmami. príčinou je, že DNA nie je dostatočne čistá. Vykonajte 2 - 3 extrakty fenol -chloroformu. (keď je to vhodné resuspendujte DNA v objeme 500 ul, pretože počas extrakcie môžete stratiť veľa objemu) Po vyčistení skúste rezať pomocou EcoRI. Ak sa nedá rezať pomocou EcoRI, vykonajte viac extrakcií fenol/chlorofom. EcoRI, možno považovať za jeden z najlepších enzýmov v okolí. Ak to nedokáže prerezať vašu DNA, nedokáže to nič.

Keďže gDNA nie je ani zďaleka taká čistá ako plazmidová DNA, dajte jej viac času na strávenie. Pozor aj na degradáciu DNA nukleázami. (tj. natrávený náter sa začína sústreďovať na veľmi malé fragmenty okolo 500 bp.) Pretože sa stretávate s vyššie uvedenými problémami, je strata DNA reaktiváciou nukleázy v tráviacom pufri skutočným nebezpečenstvom.

Čo sa týka PCR, DNA opäť nie je dostatočne čistá. A v mojich rukách to nie je dosť dobré, aj keď je vyčistený. Vzorku genómovej DNA zriedim najmenej 1: 5 až 1:50 sterilnou destilovanou vodou, aby slúžila ako templát. Riedenie pomôže zriediť všetky zvyšky kontaminantov. A PCR zosilňuje slabý signál. Všimnite si toho, že genomická DNA uchovávaná v SD vode žije dlho. asi 5-6 mesiacov v mojich rukach. Na dlhodobé skladovanie vždy uchovávajte DNA v TE.

Ale so všetkým povedané, chce to trochu praxe, aby ste získali peknú čistú DNA. Buďte odvážni a pokecajte so svojim protokolom, zistite, či ho je možné zlepšiť. Ak to nedokáže, zistite, aké ďalšie veci môžete urobiť s DNA, keď ju už máte.

O kontaminácii RNA. Môže to byť, aj keď vždy kontrolujem pH Ph: Ch pred začatím extrakcie DNA, aby som namiesto RNA mal DNA.

Enzým, ktorý používam, rezá DNA, v géli vidím očakávaný náter, ale opäť s nižšou intenzitou, ako som očakával. Už som to skúšal stráviť cez noc, ale výsledky sú rovnaké.


Fanos Tadesse 1,2 *, Demasa Negessu 2 , Tsion Bilata 2 , Ayelech Muluneh 2 a Dereje Shegu 2

1 Vysoká škola veterinárneho lekárstva Univerzity Addis Abeby, Etiópia

2 Národné diagnostické a vyšetrovacie centrum pre zdravie zvierat, Etiópia

Prijaté: 13. december 2019 | Publikovaný: 06. januára 2020

Zodpovedajúci Autor: Fanos Tadesse, Vysoká škola veterinárskeho lekárstva Univerzity v Addis Abebe, Etiópia [email protected] ->

Abstrakt

Génové klonovanie je spôsob, ako odobrať kúsok DNA z tela, kde sa prirodzene vyskytuje, a vložiť ho do klonovacieho hostiteľa, akým je baktéria Escherichia coli. Bakteriálna bunka, ktorá obsahuje cudziu DNA, môže vyjadrovať genetické informácie a vytvárať génové produkty. Aby bolo možné uskutočniť klonovanie v E. coli, plazmidový vektor pHEN6c sa použil na klonovanie cDNA fragmentu mRNA kódujúcej nanoprotilátku. Plazmid E. coli bol extrahovaný, purifikovaný a potom štiepený použitím reštrikčných enzýmov Pstl a Eco91I. Čistota a koncentrácia plazmidu boli 1,84, respektíve 39,2 ng/ul. Vektor pHEN6c, ako aj nanodielna cDNA, sa digerovali s PstI a Eco91I reštrikčným enzýmom a potom sa ligovali za vzniku rekombinantného plazmidu. Konštrukty boli transformované do kmeňa Escherichia coli metódou tepelného šoku. Bunky sa kultivovali cez noc a účinnosť transformácie sa stanovila ako 7867,22 transformantov/ug. V tomto experimente sa cieľová sekvencia amplifikovala a pásy sa získali po elektroforéze 1% agarózového gélu na kolóniových produktoch PCR. Na stanovenie veľkosti klonovanej cDNA a vektora pHEN6c sa použili grafy relatívnej morbidity voči molekulovej veľkosti (log bp) a veľkosť bola 573 bp a 3842 bp pre cDNA a vektor. Klonovacie techniky prinášajú mnoho sľubných budúcich výskumov v oblasti genetického inžinierstva a biotechnológie. Preto je dôležité naučiť sa praktickým experimentom a výskumom klonovania využívať to najlepšie z prírody (živý organizmus) v náš prospech.

Kľúčové slová: Plazmidový klonovací gén pre nanočastice

Úvod

Objav štruktúry a úlohy DNA a vytriedenie genetického kódu viedlo za posledných 50 rokov k výbuchu v našom chápaní organizmov a ich fungovania. Do popredia tejto revolúcie sa dostalo klonovanie génov. Pojem „klonovanie génov“ zahŕňa širokú škálu techník, ktoré umožňujú manipulovať s DNA v skúmavke a vrátiť ju do živých organizmov, kde normálne funguje. Význam tejto technológie je, že nám umožňuje izolovať akýkoľvek kúsok DNA medzi miliónmi párov báz, ktoré tvoria genóm organizmu. Tento prvý krok je zásadný pre celý rad vedeckých a technologických štúdií, od štúdia génu, ktorý je nápomocný pri vzniku dedičnej choroby, až po bioinžinierstvo kmeňa kvasiniek, ktorý produkuje užitočný farmaceutický produkt [1]. Génové klonovanie zahŕňa odobratie časti DNA z organizmu, kde sa prirodzene vyskytuje, a jej vloženie do klonovacieho hostiteľa, akým je napríklad baktéria Escherichia coli. Potom je možné študovať klonovanú DNA alebo produkovať proteín kódovaný génom. Pri mnohých aplikáciách možno budete chcieť následne preniesť klonovanú DNA do iného organizmu, ale počiatočné klonovacie kroky sa takmer vždy vykonávajú v E. coli [2].

Pomocou reštrikčných endonukleáz môže byť cudzia DNA vložená do bakteriálnych plazmidov a môže byť replikovaná). Bakteriálne bunky, ktoré obsahujú cudziu DNA, môžu vyjadrovať genetické informácie a vytvárať génové produkty. Klonovaním týchto buniek sa teda môžeme dozvedieť o štruktúre a fungovaní špecifických génov a génových produktov, ako aj o expresii vzácnych proteínov. Transformácia plazmidu na bakteriálne kompetentné bunky je kľúčovou technikou pri molekulárnom klonovaní na transformáciu genetickej konštitúcie iných organizmov [3].

Plazmidy, najčastejšie používané vektory na klonovanie génov, sú malé kruhové molekuly DNA nachádzajúce sa v mnohých druhoch baktérií s „počiatkom replikácie“, ktoré usmerňujú replikáciu plazmidu a zaisťujú, že klonovaná bunka obsahuje mnoho kópií plazmidu, ktoré sú distribuované keď sa bunka rozdelí medzi dcérske bunky [4]. Presný počet kópií sa líši v závislosti od plazmidu. Ak je klonovaný gén súčasťou molekuly DNA s počiatkom replikácie, to znamená klonovaný do plazmidu, skopíruje sa aj pri kopírovaní plazmidu. Plazmidy bežne používané pri klonovaní obsahujú selektovateľný marker, zvyčajne gén rezistencie na antibiotiká. To znamená, že môžeme zistiť, ktoré baktérie obsahujú plazmid, jednoducho ich nanesením na agarovú platňu obsahujúcu antibiotikum, kde je rast ocenený v organizme obsahujúcom plazmid [5].

Plazmidy sú považované za prenosné genetické prvky alebo „replikóny“, schopné autonómnej replikácie vo vhodnom hostiteľovi. Napriek tomu, že je schopný vlastnej replikácie, na vykonávanie tejto funkcie stále používa mechanizmus hostiteľskej bunky. Plazmidy poskytujú mechanizmus pre horizontálny prenos génov v populácii mikróbov a spravidla poskytujú selektívnu výhodu za daného stavu prostredia. Plazmidy môžu niesť gény, ktoré poskytujú odolnosť voči prirodzene sa vyskytujúcim antibiotikám v konkurenčnom prostredí, alebo alternatívne môžu produkované proteíny za podobných okolností pôsobiť ako toxíny. Plazmidy môžu tiež poskytnúť baktériám schopnosť fixovať elementárny dusík alebo degradovať odolné organické zlúčeniny, ktoré poskytujú výhodu v podmienkach nedostatku živín [6].

V tomto experimente boli použité základné princípy genetického inžinierstva na riešenie vedeckých výziev, výskumu a vývoja produktov. Aby sa dosiahol náš cieľ, plazmidy sa izolovali z bakteriálnej kultúry E. coli a rekombinantný plazmid obsahujúci špecifické fragmenty génových konštruktov nanočastice sa potom transformoval do buniek E. coli, čím sa hostiteľským bunkám udelila rezistencia na ampicilín. Použili sa aj ďalšie základné techniky analýzy výsledkov pomocou PCR a elektroforézy na agarózovom géli.

Metodika

Izolácia plazmidu pHEN6c

Izolácia plazmidu pHEN6c sa uskutočnila v 7 po sebe nasledujúcich krokoch: zber buniek, resuspendácia buniek, lýza buniek, neutralizácia, príprava kolóny, naplnenie vyčisteného lyzátu, premytie kolóny a elúcia DNA. Zozbierali sme cez noc kultúru E. coli a dali sme jej 1 ml do Eppendorfovej skúmavky. Odstredili sme ho v mikrocentrifúge pri vysokej rýchlosti 10600 RPM (12 000×g) za 1 minútu. Po dekantácii supernatantu sa do pelety pridal ďalší 1 ml kultúry E. coli a znova sa centrifugovala pri vysokej rýchlosti v priebehu jednej minúty. Výsledný supernatant sa nalial do odpadovej kadičky, zatiaľ čo peleta sa okamžite resuspendovala v 2 ul resuspendačného roztoku. Zmes bola pretrepaná na vortexe, aby sa zabezpečila vhodná a úplná resuspendácia. Na lýzu resuspendovaného peletu E. coli sa pridali 2 ul lyzačného roztoku. Obsah bol jemne obrátený asi 6 až 8 krát (namiesto použitia víru, pretože to môže spôsobiť strih genómovej DNA a následne kontamináciu plazmidovou DNA). Po neutralizácii ihneď nasledovalo pridanie 350 ul neutralizačného roztoku, aby sa vyzrážali zvyšky buniek. Obsah zmesi sa potom jemne prevrátil 4 až 6 krát. Rovnaký obsah sa centrifugoval vysokou rýchlosťou (12 000 x g) za 10 minút. Pretože náš supernatant neobsahoval veľa plávajúcich častíc, druhé odstreďovanie nebolo potrebné.

Kolóna sa pripravila vložením kolóny GenEute Miniprep Binding do mikrocentrifugačnej skúmavky. Do minipreparatívnej kolóny sa pridalo 500 ul roztoku na prípravu kolóny a centrifugovalo sa pri vysokej rýchlosti (12 000 x g) za 30 sekúnd až 1 minútu. Pretekajúca kvapalina sa vyhodila. Pripravená kolóna slúžila na naplnenie vyčisteného lyzátu (vzniknutého neutralizáciou). Vyčistený lyzát sa pridal do už pripravenej kolóny a centrifugoval sa vysokou rýchlosťou 12 000 x g v priebehu 30 sekúnd až 1 minúty. Premytie kolóny sa potom uskutočnilo pridaním 750 ul zriedeného premývacieho roztoku do kolóny centrifugovanej pri rýchlosti 12 000 x g počas 30 sekúnd až 1 minúty.

Pretekajúca kvapalina sa vyhodila do odpadovej kadičky a kolóna sa znova centrifugovala vysokou rýchlosťou ≥ 12 000 x g v priebehu 1 až 2 minút, aby sa odstránil prebytok etanolu. Nakoniec sme eluovali DNA prenesením kolóny do čerstvej zbernej skúmavky a potom sme pridali 50 μl elučného roztoku a odstredili.

Stanovenie čistoty plazmidovej DNA, koncentrácia

Stanovenie čistoty (OD 260/OD 280) a koncentrácie (ƞg/µl) izolovanej plazmidovej DNA z E.coli sa uskutočnilo pomocou spektrofotometra (Nanodrop ™) s pomocou pripojeného počítačového softvéru hodnoty pre obidve bola vypočítaná a vygenerovaná čistota a koncentrácia.

Reštrikčné štiepenie endonukleázou génu pre nanočastice a plazmidu pHEN6c

Trávenie DNA (plazmid pHEN6c): Stanovená koncentrácia plazmidu DNA pre našu podskupinu bola nízka (279,6 µg/ µl), preto sme použili priemernú koncentráciu plazmidu 317,57 µg/ µl, ktorá je výsledkom kombinácie štyroch najvyšších koncentrácií plazmidu DNA (335,6, 353,6, 299,1 a 282 µg/µl) získanú inými podskupinami. K 11,75 µl destilovanej vody sa pridal objem 31,25 µl (DNA plazmidu s 317,57 µg/µl), potom sa pridalo 5 µl 10x pufra-o (Fermantas) a 1 µl reštrikčného enzýmu Eco91I (10 jednotiek/µl ) a reštrikčný enzým PstI (10 jednotiek/μl). Celá zmes (50 μl) sa potom inkubovala cez noc pri 37 °C.

Štiepenie a purifikácia PCR amplifikovanej cDNA: cDNA (fragmenty PCR génu pre nanobody) už pripravené a purifikované boli podrobené štiepeniu špecifickými reštrikčnými enzýmami. Do 29,41 μl destilovanej vody sa pridal objem 13,59 μl (fragmentov PCR), nasledovalo pridanie 5 μl 10x Buffer-o (Fermantas) a 1 μl reštrikčného enzýmu Eco91I (10 jednotiek/μl) a reštrikčného enzýmu PstI ( 10 jednotiek/μl). Celá zmes (50 μl) sa potom inkubovala cez noc pri 37 °C. Na čistenie (čistenie) cDNA amplifikovanej pomocou PCR prišla hra GenElute TM PCR Clean-UP Kit. Začali sme prípravou kolóny (aby sa maximalizovala väzba DNA na membránu). Objem 0,5 ml roztoku na prípravu kolóny sa pridal do väzbovej kolóny GenElute Miniprep, ktorá už bola vložená do zbernej skúmavky.

Zberná skúmavka sa potom centrifugovala pri 12 000 rcf po dobu 30 sekúnd až jednu minútu. Vyradenie bolo zahodené. Bol pridaný objem 500 µl väzbového roztoku a premiešaný s 50 µl reakcie PCR. Roztok zmesi sa preniesol do väzobnej kolóny. Kolóna (do zbernej skúmavky) sa jednu minútu centrifugovala pri 12 000 až 16 000 rcf. Elučná kvapalina sa vyhodila. Zriedený premývací roztok, 0,5 ml, sa pridal do kolóny a centrifugoval sa pri 12 000 až 16 000 rcf jednu minútu. Eluát bol zahodený. Aby sa odstránil prebytok etanolu, zberná skúmavka (s kolónou do) sa potom centrifugovala pri 12 000 až 16 000 rcf po dobu 2 minút. Zberná skúmavka s eluátom bola zlikvidovaná, zatiaľ čo kolóna bola následne prenesená do čerstvej 2 ml odberovej skúmavky. Elúcia sa uskutočnila pridaním 50 ul elučného roztoku do kolóny. Na elúciu DNA bola kolóna centrifugovaná pri 12 000-16 000 rcf počas jednej minúty. Výsledný eluát obsahoval purifikovaný produkt PCR a bol ihneď použitý (alebo skladovaný pri -20 ° C).

Ligácia

Na 13,9 μl destilovanej vody, 2,28 μl fragmentov PCR, 0,82 plazmidového vektora, 2 μl ligačného pufra (0,2 M Tris pH = 7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 500 ug/ml BSA, 5 mM ATP) a 1 μl T4 DNA sa pridala do jednej skúmavky, aby sa dosiahol celkový objem 20 μl. Roztok bol 2 hodiny pri teplote miestnosti.

Transformácia

Generácia kompetentných buniek Cacl2: Na prípravu kompetentných buniek „tepelného šoku“ bolo naočkovaných 5 ml LB (bez antibiotík) pridaných do jednej s jednou kolóniou z čerstvej platne, do jednej sterilnej 50 ml skúmavky. Inokulované médium sa potom inkubovalo pri 37 °C cez noc (za intenzívneho trepania pri 230 ot./min.). Nasledujúce ráno sa 20 ml LB naočkovalo 0,2 ml nočnej kultúry. Skúmavka sa umiestnila do inkubátora na 90 až 180 minút, aby sa pestovali naočkované baktérie do ich ranej logickej fázy. Neskôr bol prenesený na 10 minút na ľad. Bunky sa potom zozbierali centrifugáciou pri 3000 ot./min v Eppendorfovej skúmavke, supernatant sa odstránil a potom sa peleta resuspendovala s 10 ml sterilného ľadovo studeného 0,1 M MgCl2. Peleta sa opäť resuspendovala s iným 10 ml sterilného ľadovo chladného 0,1 M CaCl2, nasledovala inkubácia v ľade počas 1 hodiny a potom sa centrifugovala pri 7 min. 3000 ot / min v eppendorfovej centrifúge pri 4 ° C. Supernatant sa nalial a pridal sa sterilný ľadovo chladný 0,1 M CaCl2 plus 0,3 ml sterilného ľadovo chladného 100 % -glycerolu. Zmes sa potom inkubovala 30 minút na ľade.

Transformácia tepelného šoku: Pripravili sa tri 1,5 ml skúmavky eppendorf, každá obsahujúca 100 ul bunkovej suspenzie, a označené ako T1, T2 a T3. Spomedzi troch skúmaviek boli T1, T2 a T2 pripravené ako pozitívna kontrola, skúmavka, skúmavka a skúmavka s negatívnou kontrolou. Alikvotná časť 0,05 μg purifikovanej intaktnej plazmidovej DNA sa pridala do T1, 10 μl nečistenej ligácie do T2 a T3 sa nechalo s pôvodnými 100 μl Cacl2. Tri skúmavky sa inkubovali na ľade 30 minút. Po inkubácii boli tri skúmavky následne prenesené do teplého kúpeľa pri 42 ° C na presne 90 sekúnd a potom vložené späť na ľad na 2 minúty. Po inkubácii sa bunky kultivovali na LB agare obsahujúcom ampicilín nanesením (sterilným lenivým rozmetadlom) 100 ul transformačného prípravku z každej skúmavky na agarové platne LB-AMP (označené T1, T2 a T3). Kultivované platne sa inkubovali pri 37 ° C hore dnom cez noc. Nasledujúce ráno (po 16 až 20 hodinách) bol na každej doštičke určený počet kolónií.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Najprv sa pripravila PCR master mix. Do každej skúmavky PCR z piatich sa pridalo 50 μl master mixu (5 μl 10x PCR pufra, 1 μl dNTP, 1 μl FP, 1 μl RP, 0,25 μl Taq DNA polymerázy, 41,75 μl dH2O). Pomocou sterilných pipetovacích špičiek bola jedna kolónia odobratá z pozitívneho testu (T1) a zmiešaná v jednej skúmavke s PCR, ďalšia jedna kolónia bola odobratá zo skúmavky, pretože na testovacej doštičke T2 nenastal žiadny rast kolónií a bol ponorený do samostatnej PCR skúmavka tiež. Tretia skúmavka, do ktorej nebola pridaná žiadna kolónia, slúžila ako negatívna kontrola. Skúmavky boli všetky uzavreté a potom prenesené do termocykléru, ktorý cykloval medzi tavením (pri 94 ° C počas 30 sekúnd), žíhaním (pri 57 ° C počas 30 sekúnd) a polymerizačnými teplotami (72 ° C počas 45 sekúnd). Génové fragmenty kódujúce nanoprotilátku (inzert cDNA nanoprotilátky), ak boli prítomné vo vzorke, sa amplifikovali so špecifickými primérmi: priamy primér (FP 5'-TTCCCAGTCACGAC-3') a reverzný primér (RP 5'-CACACAGGAAACAGCTATGAC-3') Arbabi Ghahroudi, 1997.

Analýza produktu PCR pomocou agarózového gélu, elektroforéza

1 % (hmotn./obj.) roztavený agarózový gél sa najskôr nalial do 1x TBE na tácku. Potom sme do roztaveného gélu pridali 30 μl etídiumbromidu v koncentrácii 10 mg/ml a následne premiešali miešaním so sterilnou špičkou pipety. Potom sa na držiak gélu naniesol hrebeň a pomocou vyčistenej špičky pipety sa odstránili všetky možné vzduchové bubliny. Gél necháme 20 minút stuhnúť. Tuhý gél s podnosom bol vložený do elektroforetického pufra a potom bol pridaný 1xTBE elektroforézny pufor, aby sa gél úplne pokryl. Do každých 5 μl vzorky produktu PCR sa pridali 2 μl plniaceho pufra, zatiaľ čo pokiaľ ide o negatívnu kontrolu, iba 1 μl produktu PCR sa zmiešal s 1 μl plniaceho pufra. Negatívna aj pozitívna kontrola sa zmiešali so 4 μl nanášacieho farbiva a potom sa naniesli na gél. Pozitívna zmes sa naplnila od druhej štrbiny ďalej a negatívna kontrolná zmes sa vložila do poslednej štrbiny. Do prvého slotu sme vložili 10 μl inteligentný rebrík.

Na vyrovnávaciu nádrž sme nasadili veko a potom 1 hodinu zapojili kladné a záporné elektródy s napätím 125 V. Gél sa potom pozoroval pod ultrafialovým svetlom na oddelenie pásov a porovnal sa s markerom (Hyladder ™ 10 kb) naloženým do dráhy 1. Veľkosť vektora DNA sa vypočítala pomocou lineárneho vzťahu logaritmu páru báz a relatívnej pohyblivosti pozdĺž elektrického prúdu. lúka.

Stanovenie molekulovej hmotnosti DNA po rozlíšení gélovou elektroforézou

Molekulová hmotnosť cDNA pre nanočastice a plazmidu (vektor) bola stanovená elektroforézou na 1% agarózovom géli.

Výsledky

Koncentrácia a čistota plazmidovej DNA

Po izolácii a purifikácii plazmidovej DNA pHEN6c sa jej koncentrácia a čistota stanovili pomocou Nano Drop™. Vzorky sa potom analyzovali s použitím slepého pokusu pozostávajúceho z vody, ktorá sa použila ako elučný pufer. Čo sa týka čistej DNA, hodnota A260/A280 by mala byť medzi 1,7-1,9, teda plazmidová DNA bola izolovaná vo svojej čistej forme. Naša zlúčená koncentrácia DNA bola 317 ng/ µl, čo je a súhrnná čistota 1,84, a výťažok našej DNA v 50 µl bol 371 µg/ µl vynásobený 50 µl, čo je 18,5 µg.

Koncentrácia štiepenej cDNA

Koncentrácia natrávenej cDNA bola 110,3 ng/ µl, čo bolo 0,1103 a výťažok našej DNA v 50 µl bol 50 µl vynásobený 0,1103 µg/ µl, čo je 5,5 µg.

Stanovenie molekulovej hmotnosti cDNA

Na stanovenie molekulovej hmotnosti cDNA sa uskutočnila na 1 % agarózovom géli a získali sa nasledujúce pásy a molekulová hmotnosť cDNA má byť 573 bp (obrázok 1).

Stanovenie molekulovej hmotnosti plazmidovej DNA (vektor)

Na stanovenie molekulovej hmotnosti cDNA sa uskutočnila na 1 % agarózovom géli a získali sa nasledujúce pásy a molekulová hmotnosť cDNA má byť 3842 bp (obrázok 2).

Postava 1: Pásy získané pre cDNA na 1% agarózovom géli elektroforézou.

KĽÚČ: L-rebrík, vzorka S1 1, s2 vzorka 2, s3 vzorka 3, vzorka S4 4, vzorka S5 5, vzorka S6 6

Obrázok 2: Pásy získané pre vektorovú DNA na 1% elektroforéze na agarózovom géli.

Stanovenie účinnosti transformácie

Účinnosť transformácie je mierou množstva buniek v bakteriálnej kultúre, ktoré sú schopné prijať molekuly DNA. Výpočet sa začal s množstvom intaktnej plazmidovej DNA nanesenej na platňu: Počet kolónií bol 349 cfu (obrázok 3) v 50 ng (0,05 μg) DNA v 1 ul bol pridaný k 100 ul buniek. Koncentrácia DNA v roztoku = (0,05 μg /101μl) ≈ 0,00049 μg /μl. Potom sa na každú z platní pridalo 100 μl kultúry, preto sa množstvo intaktnej plazmidovej DNA nanesenej na každú platňu vypočítalo ako: 0,05/1101 = 4,54 x 10-5 μg/μl x 100 μl = 4,54 x 10-3 μg.

Množstvo nanesenej DNA (μg /ml): 4,54x10-3 μg /100μl=4,54x10-3 μg /0,1 ml = 4,54x10-2 μg /ml. Pomocou vzorca (Účinnosť transformácie = počet kolónií na LB-AMP doštičke vydelený množstvom nanesenej DNA) sa vypočítala ako 349 cfu/4,54 x 10-2 ug/ml = 7687,22 cfu/1 ug/ml.

Obrázok 3: Rast kolónií na T2.

Stanovenie percenta transformantov s vložkou

Po vykonaní kolóniovej PCR sa amplifikované vzorky z jednej náhodne vybranej kolónie spolu so spoločnou pozitívnou a negatívnou kontrolou nechali bežať na 1% agarózovom géli a neboli alebo boli slabé, a boli získané vystavením UV žiareniu.

Meranie optickej hustoty (OD) bunky

Optická hustota (OD) sa merala pre bunky pestované v log fáze spektrofotometrom pri OD 600 a výsledok je 0,213, kde štandard leží medzi 0,2 až 0,4.

Rast pri LB+ampicilíne

Rast kolónií bol pozorovaný na pozitívnych a testovacích doštičkách, ale žiadny rast jednotlivých kolónií sa nezistil v tretej vzorke, ktorá je negatívnou kontrolou (obrázky 4 a 5).

Obrázok 4: Žiadny rast kolónií na T2.

Obrázok 5: Rast kolónií na T1 (pozitívna kontrola) a absencia rastu kolónií na T3.

Diskusia

Koncentrácia získaná zo spektrofotometra Nanodrop (18,5 μg/50 μl) z 2 ml kultúry E. coli obsahujúcej pHEN6c naznačuje, že izolácia plazmidovej DNA prostredníctvom alkalickej denaturácie je efektívna metóda. Náš výsledok súhlasí so zisteniami Sabine (2003) [7], použitím postupu alkalickej denaturácie a výťažku 2-5 μg DNA z 1,5 ml kultúry E.coli obsahujúcej plazmid odvodený od pBR322 a tri až päť od pUC odvodených plazmidov možno očakávať násobne vyššie výťažky. Účinnosť transformácie predstavuje celkový počet bakteriálnych buniek, ktoré obsahujú vloženú DNA. V našom experimente bola transformačná účinnosť vysoká pri 7687,22 cfu/ 1 μg/ ml transformantov/ μg v porovnaní s Barakom [8], ktorý získal 1,107 x 102 transformantov/ μg. Táto účinnosť znamená, že naše plazmidy boli úspešne absorbované hostiteľskými baktériami, ktoré umožnili rast na médiu doplnenom ampicilínom. Proteín β-laktamázy je produkovaný a vylučovaný baktériami, ktoré nesú vložený plazmidový konštrukt inaktivujúci ampicilín prítomný v LB agare, čo umožňuje bakteriálny rast [9]. Iba transformované baktérie, ktoré obsahujú plazmid a exprimujú β-laktamázu, rástli na platniach, ktoré obsahujú ampicilín [10].

Netransformované bunky, ako napríklad platňa číslo dva v našej vzorke, nemohli rásť na ampicilínových selekčných doštičkách, a tak umožnili selekciu iba pozitívnych transformantov. Niektoré faktory, ktoré mohli ovplyvniť účinnosť transformácie, sú pridanie chloridu vápenatého, ktoré prinútilo bakteriálnu bunku absorbovať DNA zvýšením jej priepustnosti pre membrány. Úlohu môže hrať aj množstvo nahej DNA umiestnenej do prostredia baktérie, čím viac DNA, tým účinnejšia by bola transformácia [11]. Produkt PCR sa rozpustil na 1% agarózovom géli a slabé pásy sa dali detegovať vo vzorkách aj v pozitívnej kontrole. Zlyhanie amplifikácie môže byť dôsledkom zlyhania PCR priméru alebo zlej enzýmovej aktivity polymerázy, problému s pufrom. Toto podporuje aj Roux [12], ktorý uvádza, že sekvencia primérov mohla byť syntetizovaná alebo nariedená správne, pufre a inhibítory boli inkriminované, aby ovplyvnili amplifikáciu, na vyriešenie tohto problému je potrebný nový dizajn optimálneho páru primérov na dosiahnutie požadovanej amplifikácie. Zlyhanie PCR kolónie môže byť tiež spôsobené príliš veľkým množstvom buniek v reakcii PCR, aby sa tomu zabránilo, kolónie sa môžu pred spustením PCR zriediť v sterilnej destilovanej vode [13].

Záver

Keďže nanobody majú dobrú expresiu v mikrobiálnych systémoch a prospešné biochemické vlastnosti (dobrá rozpustnosť, dobrá stabilita v drsných podmienkach, vysoká afinita a špecifickosť pre antigén, malá veľkosť a prísne monomérne správanie), sú ideálnym nástrojom na výskumné účely alebo diagnostické alebo terapeutické účely. aplikácií. Aj keď kolónia PCR v našom experimente nebola úspešná (kvôli defektu pufra a enzýmu), klonovací postup plne pomohol vložiť cDNA génu Nanobody do bakteriálneho genómu, kmeň E.Coli WK6. Klonovacie techniky prinášajú mnoho sľubných budúcich výskumov v oblasti genetického inžinierstva a biotechnológie. Preto je dôležité naučiť sa praktickým experimentom a výskumom klonovania využívať to najlepšie z prírody (živý organizmus) v náš prospech.

Vyhlásenie

Táto práca nebola nikdy odoslaná a je svojím typom originálna a dávam plné povolenie akademickému časopisu iiste.org na jej publikovanie.

Referencie

  • Lodge J, Lund PA, Minchin S (2007) Klonovanie génov: princípy a aplikácie. Skupina Taylor a Francis.
  • Carson S, Robertson D (2005) Manipulácia a expresia rekombinantnej DNA. San Diego: Elsevier akademická tlač.
  • Lipps G (2008) Plasmids: Current Research and Futend Trends. Caister Academic Press.
  • Hanahan D (1985) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach. In: DM Glover (ed,). (IRL Press, Oxford) 1: 109.
  • Campbell, Neil A (2005) Biology. In: Neil A Campbell, Jane B Reece (Eds.), 7. (edn.). CA: Pearson Education. Inc, San Francisco, USA, s. 384-388.
  • Kenneth H Roux (2001) Optimalizácia a riešenie problémov v genóme PCR. Res 1995 4: S185-S194.
  • Lee AB, TA Cooper (1995) Vylepšený priamy PCR skríning pre bakteriálne kolónie. Bio Techniques 18: 225-226.
  • Barakat (2011) praktická správa o IPMB.
  • Primrose SB, Twyman RM, Old RW (2006) Principles of Gene Manipulation. Blackwell Science, Inc: Malden.
  • Steven Odongo (2013) Študentský školiaci manuál pre IPMB.

Dekontaminačný roztok (v1.4)

10% bielidlo kúpené v obchode (2 l na 20 l)
1% NaOH (200 g na 20 l)
1 % Sparkleen alebo podobný práškový prací prostriedok (200 g na 20 l)

Inštrukcie na používanie:

  • Pre väčšinu aplikácií (utieranie dosiek, vybavenia, pipiet) je možné roztok deconu 2-3x zriediť, utrieť, nechať niekoľko minút vsiaknuť a potom opláchnuť destilovanou vodou a uterákmi. Tvrdohlavejšie neporiadky môžete zasiahnuť neriedenou zmesou.
  • Sklo a diely je možné nastaviť tak, aby nasiakli v priamej alebo zriedenej (2–3X) dekonzistentnej zmesi, potom sa umyjú ako obvykle a opláchnu destilovanou vodou.
  • Nedovoľte, aby sa zmes dekonu dostala do kontaktu s eloxovaným hliníkom, hneď to naberie farbu!
  • Najnovší a najľahší dekon mix. Zrušilo sa pridávanie hydrogénuhličitanu sodného, ​​pretože iskra ho obsahuje veľa a poskytuje detergent na zmáčanie. Ďakujem čitateľovi, ktorý to navrhol!

Dekontaminačný roztok (v1.3) (stará, staršia verzia)
10-15% bielidlo kúpené v obchode (100-150 ml/l)
1% NaOH (10 g/l)
1% Alconox/Sparkleen/mydlo na riad (10 g/L) *
90 mM hydrogenuhličitan sodný (7,5 g/l) **

* Komerčné verzie používajú KBÚ, ale pri vyšších koncentráciách (=>1%) KBÚ majú tendenciu vypadnúť. Ak nemáte vôňu/emulgátor 2141-BG, použite nižšiu koncentráciu SDS (<0,1 %) alebo použite vyššie uvedené čistiace prostriedky *

** Sparkleen a Alconox už majú v sebe hydrogenuhličitan sodný vo vysokých koncentráciách až

40% pre Alconox, takže pridanie bikarbonátu nemusí byť potrebné.

Za predpokladu, že Sparkleen má 30% hydrogenuhličitanu, 10 gramov iskry má 3 gramy hydrogenuhličitanu, čo by znamenalo konečné riešenie s 36 mM bikarbonátom, ktoré by stále mohlo poskytovať inhibíciu korózie, závisí od toho, ako silne chcete veriť 90 mM z patentu DNAzap. **

*** Tento decon mix koroduje hliník a železo/lacnú nehrdzavejúcu oceľ pri vysokých koncentráciách a pri dlhodobom ošetrovaní. Kvalitné nerezové prevedenie dobre drží. ***

**** Táto zmes je skvelá na čistenie skleneného riadu, nechajte kadičku chvíľu odležať v 0,5X alebo 1X dekonickej zmesi, čím dlhšie, tým lepšie. Po opláchnutí sa bude trblietať! Vysoký obsah NaOH pripomína zásadité kúpele, ktorými chemici leptali peknú čistú vrstvu na svojom skle. ****

Ak chcete získať ďalšie informácie o tom, ako som k tomuto receptu dospel, pozrite sa na môj druhý príspevok na túto tému, stačí ho odfarbiť


VÝSLEDKY

Po dokončení tohto laboratórneho projektu študenti vypracujú správu v rukopisnej forme, ktorá sumarizuje ich údaje. Musia obsahovať gély, ktoré obsahujú dvojité štiepenie, jednu štandardnú krivku, tabuľku všetkých videných a odvodených veľkostí fragmentov DNA a kruhovú plazmidovú reštrikčnú mapu. Pretože je známa reštrikčná mapa pBR322, študentom nie je daná identita plazmidu. Pretože sa tento kurz vyučuje každý rok, identita plazmidu sa nikdy neprezradí a súbor použitých reštrikčných enzýmov sa však každý rok mení, pretože študenti musia produkovať reprezentatívne gély a byť schopní vysvetliť logiku použitú na zostavenie mapy, poznajúc identitu plazmid by bol málo využiteľný.

Každá sada štyroch reštrikčných enzýmov použitých v jednom roku obsahuje dva enzýmy, ktoré raz rozrežú plazmid a dva, ktoré sa rozrežú buď dvakrát alebo trikrát. Jeden z jednotlivých rezných enzýmov sa ľubovoľne umiestni do nulového páru báz plazmidu a študentom sa povie, aby zmapovali ďalšie reštrikčné miesta relatívne k tomuto enzýmovému miestu.Ďalej je uvedených päť rôznych súborov enzýmov použitých na rezanie pBR322 (pozri tabuľku II), tieto sady fungujú dobre a vždy poskytli interpretovateľné výsledky.

Set 1 Súprava 2 Súprava 3 Sada 4 Súprava 5
Bam HI (1) Eco RI (1) Eco RI (1) Eco RI (1) Bam HI (1)
Ava I (1) Ava I (1) Hinc II (2) Ava I (1) Ava I (1)
Hinc II (2) Hinc II (2) Rsa I (3) Bsr BI (2) Bsr BI (2)
Rsa I (3) Rsa I (3) Sf I (1) Rsa I (3) Hinc II (2)
  • Každá sada obsahuje buď Bam HI alebo Eco RI ako referenčné miesto uvedené v nulovom páre báz plazmidu. Číslo uvedené v zátvorkách označuje počet endonukleázových miest v pBR322.

Ako je zrejmé z reprezentatívnych gélov, niekoľko bitov údajov bežne predstavuje pre študentov výzvy, ktoré poskytujú vynikajúce príklady nejednoznačnosti prítomnej v akomkoľvek type analýzy údajov, ako aj potrebu starostlivého pozorovania a predpovedania očakávaných výsledkov. V sade 2 dvojité štiepenia Hinc/Rsa produkujú fragment s 60 pármi báz, ktorý nie je takmer nikdy viditeľný, navyše tento digest vytvára dva fragmenty DNA podobnej veľkosti (1 629 a 1 565), takže študenti si musia všimnúť silné zafarbenie EtBr alebo byť schopní vyriešiť dva fragmenty. To isté platí pre fragmenty párov báz 931 a 879 produkované dvojitým štiepením BglI/Eco RI. V tomto prípade je dublet očividnejší, pretože farbí jasnejšie ako fragment väčšej veľkosti DNA nad ním na géli. Niekoľko sád enzýmov produkuje fragmenty s dĺžkou 124 až 160 párov báz, ale ich prítomnosť je zvyčajne ľahšie odvodiť. Legendy obrázkov označujú tieto a ďalšie výzvy v údajoch.

Aj keď akákoľvek endonukleáza, ktorá iba raz rozreže plazmid, môže byť použitá ako „nula párov báz“, je potrebné zvoliť enzým, ktorý delí veľmi spoľahlivo. Eco RI aj Bam HI na tento účel dobre slúžia.

Hodnotenie vzdelávania študentov

Učenie sa študentov bolo hodnotené pozorovaním školiteľských laboratórnych prác a písomných správ zo strany inštruktora, hodnotením ročných kurzov a webovým prieskumom študentov, ktorí v posledných troch rokoch absolvovali molekulárnu biológiu na Lawrence University.

Zvýšené vnímanie svojich zručností študentmi a pochopenie laboratórnych techník a konceptov prezentovaných týmto laboratórnym projektom bolo hodnotené priamo prostredníctvom webového prieskumu medzi 33 nedávnymi študentmi kurzu molekulárnej biológie na Lawrence University. Dotazovaní boli všetci študenti, ktorí sa v posledných dvoch rokoch venovali molekulárnej biológii a ktorí boli stále v areáli (21 študentov), ​​a 12 čerstvých absolventov, pre ktorých boli k dispozícii e-mailové adresy. Celková miera odpovede bola 69%. Respondenti boli požiadaní, aby ohodnotili svoje schopnosti a sebadôveru pri vykonávaní konkrétnych laboratórnych zručností, ako aj ich koncepčné chápanie techník na stupnici od 0 do 6, retrospektívne, pred a po absolvovaní molekulárnej biológie (Otázky sú uvedené v tabuľke III ). Študenti boli tiež požiadaní, aby poskytli písomné pripomienky k pozitívnym a negatívnym aspektom laboratórnych skúseností. Šestnásť z 22 respondentov sa rozhodlo napísať dlhé reakcie, všetky boli veľmi pozitívne.

Q3: Pochopenie správneho používania mikropipetí
Q4: Príprava agarózového gélu
Q5: Použitie agarózového gélu na separáciu fragmentov DNA (vkladanie, beh, farbenie gélu)
Q6: Výpočet a riedenie zásobných roztokov (ako pre dvojité digesty)
Q7: Interpretácia údajov z agarózového gélu (vrátane určenia veľkosti fragmentov DNA)
Otázka 8: Pochopenie fungovania reštrikčných digestov
Otázka 9: Pochopenie princípov gélovej elektroforézy
Q10: Pochopenie mapovania obmedzení
  • Respondenti boli požiadaní, aby zoradili svoje zručnosti (Q3-7) alebo porozumenie (Q8-10) pred a po absolvovaní molekulárnej biológie na stupnici od 0 do 6, v ktorej 0 = žiadna schopnosť alebo žiadne porozumenie a 6 = úplná schopnosť tejto zručnosti alebo úplné pochopenie pojmu.

Po dokončení projektu reštrikčného mapovania sa celkovo lepšie zhodnotilo porozumenie bežných laboratórnych techník molekulárnej biológie študentom. To je zrejmé z porovnania poradia študentov v jednotlivých technikách pred zápisom do kurzu a po dokončení projektu. Zvýšenie úrovne spoľahlivosti sa pohybovalo od 2,31 do 3,48 bodu, čo zodpovedá 39 - 58% zvýšeniu porozumenia. V priemere študenti hodnotili svoje porozumenie každej technike po ukončení laboratórneho cvičenia o 2,9 bodu vyššie ako poradie techniky pred zápisom do kurzu.

Oddelené hodnotenie hodnotenia úrovne spoľahlivosti absolventa a vysokoškolského štúdia odzrkadľovalo celkový vzor odpovede (údaje nie sú uvedené). Študenti, ktorí sú v súčasnosti zapísaní na Lawrence University, a študenti, ktorí odvtedy splnili svoje vysokoškolské požiadavky, uviedli celkový nárast úrovne sebadôvery v každej technike. Odpovede vysokoškolákov ukazujú zvýšenie úrovne spoľahlivosti v rozmedzí od 2,64 do 4,09 bodu alebo 44 až 68 % zvýšenie porozumenia. Hodnotenia čerstvých absolventov vykazujú miernejší nárast o 23 – 44 %, predovšetkým preto, že títo študenti hodnotili svoje schopnosti a porozumenie pred začatím molekulárnej biológie ako vyššie ako súčasní vysokoškoláci.

Keď boli respondenti požiadaní o pripomienky k projektu, odpovedali mimoriadne kladne. Desať zo 16 dobrovoľných odpovedí prišlo od študentov, ktorí ešte navštevujú univerzitu, zatiaľ čo zvyšných šesť bolo od čerstvých absolventov. Celkovo sa reakcie medzi týmito dvoma skupinami výrazne nelíšili, aj keď väčšinou študenti nemohli svoje schopnosti, ktoré sa naučili, uplatniť v iných štúdiách alebo aspektoch svojej kariéry. Z tohto dôvodu vysokoškoláci neustále komentovali užitočnosť opakovania techník a dôležitosť písania koherentnej laboratórnej správy. Jeden študent veľkoryso povedal „ak existuje jedna trieda, v ktorej som sa cítil kompetentným biológom ... bola to molekulárna, hlavne kvôli praktickým skúsenostiam potrebným pri vykonávaní reštrikčného laboratória“, ďalší uviedol, že „opakovanie bolo veľmi cenné ... a ja Zistili sme, že techniky a koncepty mi zostali vo väčšej miere, ako som zažil na iných hodinách.“ Absolventi tiež ocenili opakovanie laboratórnych techník a vystavenie vedeckému písaniu, ale väčšina sa vyjadrila aj k hodnote nezávislej laboratórnej práce ako prípravy na to, že sa stanete vedcom. Jeden respondent nadšene poznamenal, že „zručnosti, ktoré som sa naučil v molekulárnej oblasti, najmä tie z laboratória na mapovanie reštrikcií, ma v súčasnej pozícii veľmi uspeli. V skutočnosti mi hĺbka porozumenia, ktorú som získal opakovaním laboratória, umožnila prevziať prácu pri výučbe nových postgraduálnych študentov tých istých schopností ... “Ďalší uznanlivo uviedol:„ Teraz som postgraduálnym študentom, ktorý každodenne používa molekulárne techniky. základ. Zistil som, že som OVEĽA šikovnejší ako moji kolegovia z iných univerzít. Ostatní študenti robili podobné techniky, ale v skutočnosti im nerozumeli a rozhodne neboli pripravení pracovať samostatne v laboratóriu - ja som bol. “ Tieto typické komentáre podčiarkujú dôležitosť opakovania pre praktické vzdelávanie a rozvoj zručností pri riešení problémov.

Každý rok boli vyžiadané písomné pripomienky pomocou štandardného formulára na hodnotenie univerzitného kurzu. Aj keď nebola navrhnutá žiadna jediná otázka na posúdenie účinku tohto jedného laboratória, niekoľko otázok si vyžiadalo pripomienky k laboratórnej práci. Odpovede zo 45 hodnotení v rokoch 2001 - 2004 sú zhrnuté nižšie. Ako odpoveď na otázku "Skúsili ste v laboratóriu lepšie porozumieť zásadám a metódam v predmete?" Väčšina študentov jednoducho odpovedala „áno“, ale nasledujúce odpovede sú typické pre tých, ktorí napísali ďalšie komentáre:

"Laboratórium mapovania reštrikčných enzýmov bolo skutočne úhľadné a nápomocné pri učení sa, ako používať gély a čítať ich."

"Bol som veľmi nadšený, že môžem robiť mnohé z protokolov, o ktorých som predtým len čítal."

"Pravá skúsenosť s hlavnými technikami vo vás vyvolala pocit posilnenia nejakým zvláštnym spôsobom."

Ako odpoveď na otázku "Aké úlohy ste podľa vás najviac prispeli k splneniu cieľov kurzu a prečo?" Nasledujúce reakcie boli typické:

„Prvá laboratórna správa [mapovanie obmedzení] bola náročná. Pravdepodobne som nebol pripravený, ale myslím si, že je to skôr výsledkom mojej neskúsenosti ako kurzu. Laboratórne správy nám pomohli analyzovať to, čo sme sa naučili v laboratóriu. “

"Naše mapovacie laboratórium veľmi pomohlo pri chápaní tejto témy."

"Štruktúra laboratórnych správ nás prinútila premýšľať ako molekulárny biológ."

Pozorovania inštruktora potvrdzujú, ako študenti vnímajú zvýšené schopnosti a porozumenie. Prakticky všetci študenti sú spočiatku zmätení, keď sú konfrontovaní so svojimi prvými výsledkami elektroforézy, a všetci študenti majú otázky, ako upraviť podmienky pufra pri pridávaní druhého reštrikčného enzýmu do reakcie. Je zrejmé, že študenti tieto zručnosti ovládajú, pretože všetci študenti sú nakoniec schopní vytvárať a interpretovať komplexné vzory obmedzujúcich fragmentov v agarózových géloch pre svoje písomné správy.


Pokračujte a vykonávajte svoje extrakcie RNA a DNA s istotou

Ako vedci, samozrejme, chceme presne vedieť, čo sa deje s našimi experimentmi, a byť schopní riešiť problémy bez toho, aby sme museli najprv zavolať technický servis.

Dúfam, že tento článok pomôže objasniť niektoré vedy týkajúce sa metódy spinového filtra oxidu kremičitého na extrakciu RNA a DNA, aby ste si mohli urobiť vlastnú diagnózu a opravy. Takže, keď zavoláte technickú službu, najskôr dvakrát skontrolujete niekoľko najpravdepodobnejších príčin problémov a namiesto toho, aby ste prešli veľa rigmarol, môžete sa k riešeniu dostať oveľa rýchlejšie. Aj keď je to bezplatná náhradná súprava na extrakciu DNA!

Nejaké otázky? Akékoľvek ďalšie problémy s prípravkami na rotáciu oxidu kremičitého, ktorým nerozumiete? Dajte nám vedieť alebo položte otázku v sekcii „Otázky“ a budeme diskutovať!

Pôvodne publikované 28. júna 2010. Aktualizované a prepracované 11. júla 2015.


Plazmidy DNA sa zriedia destilovanou vodou - biológia

Projekt 1: Skríning P-transponovateľných prvkov divokého typu
Kmeň Drosophila melanogaster

Projekt 2: Izolácia a charakterizácia mutácií
V Drosophila melanogaster

Projekt 1: Skríning P-transponovateľných prvkov v divokom kmeni Drosophila melanogaster

Zhrnutie projektu
Genomy mnohých divokých kmeňov ovocnej mušky Drosophila melanogaster obsahujú P-prvky. P-elementy, podobne ako iné transponovateľné prvky, sú hlavnou príčinou mutácií a hrajú dôležitú úlohu v evolúcii. P-elementy sú krátke úseky DNA, ktoré sa môžu pohybovať v genóme. Ako prevládajú prvky P v populáciách voľne žijúcich ovocných mušiek? Má každý kmeň D. melanogaster izolovaný vo voľnej prírode transpozóny? Sú všetky P-elementy nachádzajúce sa vo voľne žijúcich ovocných muškách rovnaké? V snahe odpovedať na tieto otázky je cieľom tohto projektu určiť, či divoké kmene D. melanogaster, izolované v tomto areáli, obsahujú vo svojich genómoch P-elementy. Tento projekt budete vykonávať v priebehu 8 laboratórnych sedení. Izolujete genómovú DNA z ovocných mušiek divokého typu a pokúsite sa detegovať a zosilniť sekvencie P-prvkov z DNA pomocou techniky polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Potom necháte sekvencovať vybrané fragmenty PCR P-elementu a použijete bioinformatický prístup na porovnanie týchto sekvencií navzájom a so známymi sekvenciami P-prvkov. Na vytvorenie pozitívnej kontroly pripravíte veľké množstvo DNA divého typu P-elementu transformáciou bakteriálnych buniek rekombinantným plazmidom obsahujúcim P-element plnej dĺžky, izoláciou plazmidu z buniek a purifikáciou P-elementu obsahujúceho fragmenty pomocou PCR a gélovej elektroforézy.

Úvod

Drosophila P-prvky
Ovocná muška, Drosophila melanogaster, je ideálnym modelovým organizmom na použitie v genetických a molekulárnych analýzach (viac informácií o Drosophila melanogaster nájdete v projekte 2). Genomy mnohých kmeňov divokého typu Drosophila melanogaster obsahujú P-prvky. P-elementy sú krátke úseky DNA (<2,9 kilo párov báz [kb]), ktoré sú transponovateľnými prvkami alebo transpozónmi (alebo “skákacie gény”), čo znamená, že sa môžu fyzicky vyrezať z jedného chromozómu a presunúť sa na iný. alebo sa môžu v chromozóme pohybovať z bodu na bod. P-elementy majú rôznu dĺžku, ale všetky sú odvodené z 2,9 kb kompletnej sekvencie P-prvku, ktorá kóduje transpozázu (enzým, ktorý oddeľuje a presúva svoj vlastný úsek DNA). Kompletný P-element je v skutočnosti viac než len transpozázový gén a jeho deriváty sú zvyčajne neúplné, ale pre jednoduchosť budeme odteraz označovať P-element ako náš “ gén, ktorý nás zaujíma.” Transpozóny sú bežné v prírode a je relatívne ľahko detekovateľný v známej sekvencii DNA, pretože transpozáza funguje na základe rozpoznania charakteristického transpozónového znaku: lemujúcich invertovaných repetícií. Keď sa transpozón pohne, často iba časť sekvencie DNA “skočí” na nové miesto a časť génovej sekvencie zostane na pôvodnej pozícii. Preto zatiaľ čo P-prvky môžu mať rôznu dĺžku od 0,5 do 2,9 kb, všetky sú rozpoznateľné podľa 31 bázových párov (bp) lemujúcich invertované repetície (“transpozónová stopa ”). Neúplná excízia a pohyb P-prvkov tiež vedie k vysokému počtu kópií, to znamená k prítomnosti mnohých kópií niektorých alebo všetkých P-prvkov rozptýlených v genóme Drosophila. Keďže cieľom nášho experimentu je detekovať P-elementy v populácii divokého typu Drosophila melanogaster, ich vysoký počet kópií dobre vyhovuje nášmu účelu.

Technológia rekombinantnej DNA
Relatívne nedávny vývoj technológie rekombinantnej DNA umožnil biologickým výskumníkom urobiť veľké pokroky v našom chápaní štruktúr a funkcií génov. Pred vývojom technológie rekombinantnej DNA bolo zložité analyzovať komplexné genómy eukaryotov. Technológia rekombinantnej DNA umožňuje výskumníkom rozdeliť veľké genómy na špecifické fragmenty, ktoré sa potom dajú vložiť do molekuly DNA z iného druhu, ako je napríklad baktéria, a relatívne ľahko analyzovať. Molekula DNA, do ktorej sú vložené fragmenty, sa nazýva vektor a molekuly rekombinantnej DNA je možné pripraviť vložením fragmentov DNA z takmer akéhokoľvek druhu do vektora. Molekuly rekombinantnej DNA sa bežne zavádzajú do bakteriálnych "hostiteľských" buniek procesom transformácie. Vektory používané na konštrukciu rekombinantných molekúl DNA sú zvyčajne schopné replikácie, takže akonáhle sa rekombinantná molekula DNA dostane do bakteriálnej bunky, bude replikovaná, čo vedie k amplifikácii (replikácii mnohých kópií) špecifického fragmentu DNA. Kópie molekuly rekombinantnej DNA sa po delení buniek prenesú do každej dcérskej bunky. Vloženie fragmentu DNA do vektora a následná replikácia molekuly rekombinantnej DNA sa často nazýva "klonovanie DNA". Schopnosť vytvoriť veľa kópií danej sekvencie DNA bola mimoriadne nápomocná pri analýze génovej štruktúry a funkcie. Projekt ľudského genómu a ďalšie genómové projekty by neboli možné bez technológie rekombinantnej DNA. Okrem toho môžu byť gény kódujúce medicínsky a priemyselne dôležité polypeptidy vložené do vektorov a udržiavané a amplifikované v hostiteľských bunkách. Hostiteľské bunky schopné syntetizovať polypeptidové produkty týchto rekombinantných génov poskytujú spôsob produkcie veľkého množstva dôležitých molekúl. Napríklad inzulín, ktorý je nevyhnutný na liečbu niektorých typov cukrovky, je produkovaný lacno a vo veľkých množstvách bakteriálnymi bunkami, ktoré exprimujú ľudský inzulínový gén z rekombinantného vektora. Technológia rekombinantnej DNA bola umožnená objavom a vývojom niekoľkých dôležitých „nástrojov“ - niektoré z nich sú diskutované nižšie.

Obmedzujúce enzýmy
Restrikčné endonukleázy (alebo reštrikčné enzýmy), objavené koncom šesťdesiatych rokov minulého storočia, sú cennými nástrojmi na charakterizáciu a manipuláciu s molekulami DNA. Restrikčné endonukleázy sú enzýmy, ktoré rozpoznávajú špecifické nukleotidové sekvencie, často dlhé 4, 6 alebo 8 bp, a delia DNA iba v týchto sekvenciách. Každý reštrikčný enzým rozpoznáva svoju vlastnú, špecifickú sekvenciu nukleotidov, nazývanú "reštrikčné miesto". Existuje mnoho rôznych reštrikčných enzýmov, ktoré rozpoznávajú a prerezávajú mnoho rôznych nukleotidových sekvencií. Reštrikčné enzýmy sú produkované baktériami ako obrana pred inváziou z cudzej DNA - najmä z bakteriofágov. Baktéria modifikuje svoju vlastnú DNA, aby ju chránila pred reštrikčnými enzýmami. Cudzia DNA, ktorá sa dostane do bakteriálnej bunky, bude rozpoznaná a strávená alebo "obmedzená" reštrikčnými enzýmami bunky. Reštrikčné enzýmy sa purifikujú z bakteriálnych buniek na použitie v experimentoch molekulárnej biológie.

Rozrezaním daného kusu DNA špecifickými reštrikčnými enzýmami môžeme určiť umiestnenie reštrikčných miest pre tieto enzýmy na tejto DNA a vytvoriť "reštrikčnú mapu" danej DNA. Fragmenty rôznej veľkosti, ktoré sú výsledkom štiepenia daného kúska DNA určitým reštrikčným enzýmom, môžeme identifikovať „citovaním elektroforézou“ reštrikčne štiepenej DNA na agarózovom géli, ako je znázornené na obr. postava 1. Stručne povedané, štiepená DNA (pozostávajúca zo zmesi mnohých kópií týchto troch fragmentov) sa vloží do jednej zo vzorkových jamiek na jednom konci agarózového elektroforetického gélu. Na géli sa nastaví napätie tak, aby jamky so vzorkami boli najbližšie k zápornej elektróde a vzdialený koniec gélu bol najbližšie k kladnej elektróde. DNA má čistý záporný náboj, a preto migruje (pohybuje sa) cez gél smerom k pozitívnej elektróde (tento proces sa nazýva elektroforéza). Gél sa skladá z poréznej matrice, ktorá funguje ako molekulárne sito. Menšie fragmenty DNA sa pohybujú gélom rýchlejšie ako väčšie fragmenty DNA. Potom, čo sa elektroforéza štiepenej DNA po určitý časový úsek vykoná, sa zastaví a DNA v géli sa zafarbí, aby bola viditeľná. DNA je často viditeľná ako diskrétne pásy. Každý pás predstavuje súbor mnohých fragmentov DNA, ktoré majú všetky rovnakú veľkosť, a preto migrovali v géli na rovnakú vzdialenosť. Reštrikčné enzýmy nám tiež umožňujú rozdeliť veľké genómy na špecifické malé fragmenty, ktoré je možné vložiť do vektorov na výrobu molekúl rekombinantnej DNA.

Generovanie molekúl rekombinantnej DNA
Kombinácia dvoch rôznych molekúl DNA je uľahčená skutočnosťou, že mnohé reštrikčné enzýmy zanechávajú krátke oblasti jednovláknovej DNA na miestach ich štiepenia. To má za následok generovanie súdržných alebo „lepkavých“ koncov v reštrikčných miestach. Ak sa dve molekuly DNA rozrežú rovnakým reštrikčným enzýmom, budú mať komplementárne lepkavé konce, ktoré je možné spojiť dohromady (ligovať) párovaním báz pomocou enzýmov nazývaných DNA ligázy.

Obrázok 2 ukazuje príklad prípadu, v ktorom sú kruhová vektorová DNA a ľudská genómová DNA štiepené reštrikčným enzýmom EcoR I, ktorý rozpoznáva reštrikčné miesto

a rezy medzi G a A na oboch vláknach, pričom zostanú krátke previsy jednovláknovej DNA na oboch stranách reštrikčného miesta. Ak má tento konkrétny vektor iba jedno miesto EcoR I, výsledkom štiepenia je lineárny vektor s dvoma lepivými koncami, ktorý vyzerá takto (N znamená nukleotid akéhokoľvek typu):

Lepkavý koniec z jednej molekuly DNA sa môže spojiť s lepkavým koncom z inej molekuly DNA alebo s ním napojiť na základe komplementárneho párovania medzi nukleotidovými bázami v jednovláknových previsoch, ktoré sa vytvárajú na reštrikčných miestach:

------------------------------- Tieto bázy sa môžu spárovať s týmito bázami

Štiepenie ľudskej genomickej DNA pomocou EcoR I vedie k veľmi veľkému počtu lineárnych molekúl DNA s lepivými koncami, ktoré sú komplementárne k lepivým koncom strávenej vektorovej DNA. Ktorýkoľvek z týchto ľudských fragmentov DNA môže byť kombinovaný s vektorovou DNA párovaním báz medzi komplementárnymi lepivými koncami. Natrávené molekuly DNA sa spolu vložia do roztoku a lepkavé konce sa stretnú, keď sa molekuly DNA náhodne pohybujú v roztoku a narážajú do seba. Ošetrenie enzýmom DNA ligázou kovalentne spojí molekuly DNA, ktoré majú pár báz, za vzniku jednej kruhovej, rekombinantnej molekuly DNA. Fragment DNA, ktorý je ligovaný s vektorovou DNA, sa nazýva "vložka".

Rekombinantné molekuly môžu byť tiež pripravené digesciou vektorovej DNA zmesou dvoch rôznych reštrikčných enzýmov a digesciou DNA, ktorá má byť klonovaná, rovnakými dvoma reštrikčnými enzýmami. Tento proces sa nazýva "smerové" klonovanie, pretože inzert DNA bude zostrihnutý do vektorovej DNA v špecifickej orientácii, ako je znázornené na Obr.

Vektory
Na generovanie molekúl rekombinantnej DNA je možné použiť niekoľko rôznych typov vektorov. Tieto vektory pochádzajú z bakteriofágov (vírusov, ktoré infikujú bakteriálne bunky), baktérií a tiež z eukaryotov, ako sú kvasinky. V tomto laboratóriu budeme používať bakteriálny vektor a táto diskusia bude obmedzená na fágové a bakteriálne vektory. Dobrú diskusiu o eukaryotických vektoroch možno nájsť v kapitole 10 učebnice, Griffiths, A.J.F., W.M. Gelbart, J.H. Miller a R.C. Lewontin (1999). Moderná genetická analýza. New York. W.H. Freeman a spol. K niektorým neeukaryotickým vektorom, ktoré sa bežne používajú, patrí:

Plazmidy
Plazmidy sú malé kruhové molekuly DNA. Plazmidy môžu byť zavedené do kompetentných bakteriálnych buniek transformáciou. Vnútri bakteriálnej bunky existuje plazmid, ktorý sa replikuje nezávisle od oveľa väčšieho bakteriálneho genómu, ako je znázornené na obrázku 4. Plazmidy môžu (a boli) navrhnuté tak, aby niesli gény, ktoré prepožičiavajú bunkám, ktoré ich obsahujú, rezistenciu na špecifické antibiotiká. Plazmidy môžu tiež niesť gény kódujúce určité enzýmy, ktoré je možné použiť na "označenie" bakteriálnych buniek testovaním buniek na prítomnosť týchto enzýmov. Pretože sa plazmidy replikujú v bakteriálnych bunkách, umožňujú amplifikáciu vloženej molekuly DNA do mnohých kópií. Jednou nevýhodou plazmidových vektorov je, že neobsahujú veľké inzeráty. Väčšina plazmidových vektorov môže obsahovať iba inzerty menšie ako 10 kilobáz (kb) (1 kb = 1 000 párov báz). V tomto laboratórnom projekte použijeme rekombinantný plazmid nazvaný pPi25.1 (láskavo poskytol B. Engels). pPi25.1 obsahuje sekvencie P-prvkov. Linearizovaná mapa reštrikčných miest pPi25.1 je znázornená na obrázku Obrázok 5. Plazmidový vektor, ktorý je súčasťou rekombinantného plazmidu pPi25.1, sa nazýva pBR322.

Obrázok 5. Reštrikčná mapa rekombinantného plazmidu pPi25.1. P-element plnej dĺžky a kúsok lemujúcej chromozomálnej DNA z chromozomálnej pozície 17C na každej jej strane boli vyrezané z chromozómu reštrikčným enzýmom, BamH1 a vložený do plazmidového vektora pBR322, ktorý bol tiež rezaný BamH1 (všimnite si, že plazmid je zobrazený linearizovaný) (od O'Hare, K., Rubin, G. M. 1983. Štruktúry P transponovateľných prvkov a ich miesta inzercie a excízie v Drosophila melanogaster genóm. Bunka 34: 25–35)

Bakteriofágové lambda vektory
Deriváty bakteriofága lambda možno použiť na klonovanie väčších fragmentov DNA - fragmentov rádovo 15 až 20 kb. Z lineárneho genómu fága lambda možno vytvoriť klonovací vektor odstránením veľkej časti jeho centrálnej časti, ktorá sa potom môže nahradiť cudzími fragmentmi DNA, čo vedie k rekombinantným molekulám. Rekombinantný fág sa potom replikuje v bakteriálnych bunkách hostiteľa E. coli.

Kozmidové vektory
Kozmidové vektory sú hybridy medzi plazmidovými a fágovými vektormi. Kozmidy je možné použiť na klonovanie vložených fragmentov s dĺžkou až 45 kb. Kozmidy môžu byť udržiavané v bakteriálnych bunkách v kruhovej plazmidovej forme a môžu byť purifikované z buniek balením do fágových častíc.


Polymerázová reťazová reakcia (PCR)
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je metóda na vytváranie mnohých kópií alebo amplifikáciu špecifických sekvencií DNA (ako je konkrétny gén alebo oblasť genómu). PCR sa vykonáva pomocou páru špecifických primerov, ktoré sú samy o sebe jednovláknovými sekvenciami DNA, zvyčajne dlhé asi 20 báz. Primér je navrhnutý tak, aby bol sekvenčne komplementárny so špecifickou oblasťou genómu, a pár primérov, ktoré lemujú špecifickú oblasť genómu, sa použije na amplifikáciu (vytvorenie mnohých kópií) tejto genómovej oblasti, ktorá sa nazýva templát. Priméry spúšťajú replikáciu genómovej DNA enzýmom nazývaným Taq DNA polymeráza alebo Taq. Taq DNA polymeráza je izolovaná z baktérie nazývanej Thermus aquaticus, ktorá žije vo veľmi horúcej vode geotermálnych prieduchov a ktorej všetky enzýmy sú aktívne pri vysokých teplotách. Taq DNA polymeráza je stabilná pri 94 ° C a optimálne aktívna pri 72 ° C. PCR reakcia prebieha v mikrocentrifugačnej skúmavke (tiež nazývanej „skúmavka„ Eppendorf “). Reakčná zmes zvyčajne obsahuje genómovú DNA (šablónu), páry primérov, Taq, voľné deoxynukleotidové trifosfáty (dNTP - A, C, T a G) a príslušné pufre a soli, vrátane horčíka - nevyhnutný kofaktor pre enzým Taq. Mikrofúgna skúmavka obsahujúca reakčnú zmes sa vloží do termocykléra (stroj na zmenu teploty počas vopred stanoveného počtu cyklov. Pri PCR sa genómová DNA zahrieva na denaturáciu dvojvláknových molekúl DNA, čím sa stávajú jednovláknovými (toto je Krok denaturácie). Reakčná zmes sa potom ochladí, čím sa priméry môžu hybridizovať s komplementárnymi sekvenciami na protiľahlých reťazcoch templátovej genómovej DNA (vodíkovou väzbou medzi komplementárnymi bázami: AT, GC) obklopujúcou segment DNA, ktorý sa má amplifikovať (Toto je žíhanie Krok). Reakcia sa potom uvedie na strednú teplotu a pomocou voľných deoxyribonukleotidov pridaných do reakčnej zmesi Taq DNA polymeráza roztiahne tieto priméry od ich 3 'koncov k sebe, ako je znázornené na obrázku 6 (Toto sa nazýva rozšírenie alebo krok predlžovania). Toto replikuje oblasť medzi dvoma primérmi a generuje dve molekuly dvojvláknovej DNA z pôvodnej molekuly DNA. Po tomto kole replikácie je dokončené ed, reakčná zmes sa zahreje, aby sa denaturovali molekuly dvojvláknovej DNA, a potom sa teplota zníži, aby sa priméry mohli znova anelovať - ​​tentoraz s dvojnásobným počtom templátov. Reakcia sa potom opäť privedie na strednú teplotu, čo umožní predĺženie. Tento proces sa opakuje niekoľko cyklov (zvyčajne 20-30 cyklov), čo vedie k produkcii mnohých kópií sekvencie templátovej DNA. Tieto kópie sa nazývajú produkt(y) PCR alebo "amplikóny". Ak všetko pôjde podľa plánu, počet amplikónov by sa mal v každom cykle zdvojnásobiť. Ak teda vezmeme jednu molekulu templátovej DNA, koľko kópií daného amplikónu by sme mali mať na konci 40 cyklov?
V závislosti od počtu párov nukleotidových báz prítomných medzi dvoma primérmi použitými pri reakcii PCR sa pri reakcii vytvoria fragmenty DNA (produkty) rôznej veľkosti. Fragmenty DNA rôznej veľkosti, ktoré sú výsledkom reakcií PCR, môžeme identifikovať elektroforézou na produkte (produktoch) tejto reakcie na agarózovom géli.

Sekvenovanie DNA
Techniky sekvenovania DNA sa používajú na určenie sekvencie párov báz určitého fragmentu DNA. V súčasnej dobe je najbežnejšie používaný spôsob sekvenovania DNA automatizovaný a založený na metóde Sangerovho dideoxy sekvenovania, ktorú vyvinul Fred Sanger. Táto technika používa DNA templát, ktorý je vyrobený ako jednovláknový, a syntézu DNA v prítomnosti dideoxy nukleotidov, ktorým chýba 3'-OH skupina, takže nemôže vytvárať fosfodiesterovú väzbu. Dideoxynukleotidy môžu byť začlenené do rastúceho reťazca, ale ukončujú syntézu. Každá sekvenačná reakcia používa štyri reakčné skúmavky, z ktorých každá obsahuje DNA templát pre požadovanú sekvenciu, enzým DNA polymerázu a jednoreťazcový primer DNA komplementárny k vektorovým sekvenciám (alebo inej známej sekvencii susediacej s DNA, ktorá sa má sekvenovať). Každá zo štyroch skúmaviek dostane malé množstvo jedného zo štyroch rôznych dideoxy nukleotidov (ddATP, ddCTP, ddGTP alebo ddTTP) spolu so štyrmi normálnymi dNTP. Každý ddNTP je označený vlastným jedinečným fluorescenčným farbivom. Napríklad ddATP môže byť označený zelene, ddCTP môže byť označený modro, ddGTP môže byť označený purpurovo a ddTTP môže byť označený červenou. Reakčné skúmavky sa potom inkubujú pri voliteľnej teplote pre enzým DNA polymerázy. Enzým DNA polymeráza začína na priméri a syntetizuje nové vlákno DNA, ktoré je komplementárne k sekvencovanému vláknu templátu DNA. V ktorejkoľvek danej skúmavke sa vytvoria rôzne dĺžky reťazcov, z ktorých každá zodpovedá bodu, v ktorom bol príslušný ddNTP začlenený a ukončil rast reťazca. Každý novo syntetizovaný reťazec DNA bude teda označený farbou v závislosti od ddNTP, ktorý je na jeho 3 'konci. V ktorejkoľvek zo štyroch reakčných skúmaviek sa novo syntetizuje špecifická sada reťazcov DNA rôznych dĺžok. Veľkosť bude závisieť od toho, kde bol príslušný ddNTP pridaný do rastúceho vlákna a ukončená syntéza. Vedec potom spustí produkty každej zo 4 samostatných reakcií v rovnakej dráhe špeciálneho elektroforetického gélu nazývaného polyakrylamidový gél, ktorý oddelí molekuly DNA, ktoré sa líšia veľkosťou o jeden nukleotid. Potom sa na čítanie gélu použije skener, ktorý detekuje farbu každého pásu, a teda stanoví ddNTP na konci fragmentu. Skener sníma zo spodnej časti gélu a určuje farbu každého prúžku, aby načítal sekvenciu novo syntetizovaného vlákna v 5’ -? 3 a#8217 smer. Napríklad, ak skener deteguje nasledujúcu postupnosť farieb idúcu od spodnej časti gélu po vrch (od najkratších po najdlhšie novosyntetizované fragmenty): červená, zelená, modrá, červená, červená, fialová, zelená, potom postupnosť novo syntetizovaným vláknom je 5 ’-TACTTGA-3 ’.

BLAST vyhľadávanie a iné bioinformatické analýzy
Jednoducho povedané, “Bioinformatika” je použitie počítačov pri analýze biologických údajov. Údaje analyzované pomocou bioinformatického prístupu sú často sekvenčnými údajmi (buď sekvencie nukleovej kyseliny alebo aminokyseliny). Keď je napríklad určená sekvencia páru nukleotidových báz a báz konkrétnej molekuly DNA, môžete ju analyzovať pomocou bioinformatického prístupu. Na analýzu sekvencie môžete vykonať BLAST vyhľadávanie. BLAST je skratka pre nástroj na vyhľadávanie základných miestnych zarovnaní. Pri BLAST vyhľadávaní odošlete požadovanú sekvenciu (“query ” sekvencia, čo je v tomto prípade nukleotidová sekvencia) na špeciálnu webovú stránku vyvinutú a spravovanú Národným centrom pre biotechnologické informácie (NCBI). . Keď vykonáte vyhľadávanie BLAST, počítačový algoritmus sa použije na porovnanie vašej sekvencie dopytu so sekvenciami v počítačových databázach. Môžu zahŕňať všetky známe nukleotidové sekvencie alebo podmnožinu, na ktorú obmedzíte vyhľadávanie. Podľa webovej stránky NCBI


“ BLAST nachádza oblasti lokálnej podobnosti medzi sekvenciami. Program porovnáva nukleotidové alebo proteínové sekvencie so sekvenčnými databázami a vypočítava štatistickú významnosť zhôd. BLAST je možné použiť na vyvodenie funkčných a evolučných vzťahov medzi sekvenciami a tiež na identifikáciu členov génových rodín. ”

Keď je vyhľadávanie BLAST dokončené, dostanete zoznam všetkých sekvencií, ktoré zdieľajú oblasti podobnosti s vašou sekvenciou dotazov. Stupeň podobnosti, ktorý každá sekvencia zdieľa s dopytovanou sekvenciou, bude hodnotený na základe niekoľkých rôznych skóre a sekvencie budú zoradené v zostupnom poradí podobnosti s dopytovanou sekvenciou. BLAST vyhľadávanie vám môže povedať, aké ďalšie sekvencie súvisia (prostredníctvom evolúcie) s vašimi. Existuje mnoho ďalších spôsobov, ktorými môžete analyzovať sekvencie pomocou bioinformatického prístupu, a budeme o nich diskutovať v triede a v laboratóriu.

Tento laboratórny projekt

Transformácia bakteriálnych buniek rekombinantnými molekulami
Máme veľmi malé množstvo rekombinantného plazmidu nazývaného pPi25.1 (láskavo poskytol B. Engels). pPi25.1 obsahuje sekvencie P-prvkov. Na výrobu hmotnostného množstva tohto plazmidu, ktorý potrebujeme, použijeme bakteriálne bunky E. coli. Za týmto účelom sa plazmid zavedie do buniek E. coli procesom transformácie. Bakteriálne bunky, ktoré sa majú transformovať, musia byť najskôr ošetrené špeciálnym spôsobom, aby boli "kompetentné" na prijímanie cudzej DNA. V procese transformácie za špeciálnych podmienok kompetentné bakteriálne bunky prijímajú cudzie molekuly DNA z okolitého média.

Výber buniek, ktoré obsahujú plazmidy
Plazmidový vektor, ktorý je súčasťou rekombinantného plazmidu obsahujúceho P-prvok, sa nazýva pBR322. K dispozícii bude jednoduchá mapa pBR322. pBR322 obsahuje gén, ktorý bunkám, ktoré nesú plazmid, prepožičiava rezistenciu na antibiotikum ampicilín. Bunky, ktoré nesú pBR322, môžu byť preto odlíšené a purifikované od buniek bez pBR322 pestovaním zmesi buniek s a bez plazmidu na médiu, ktoré obsahuje ampicilín. Bunkám s pBR322 sa bude dariť v médiu obsahujúcom ampicilín, zatiaľ čo antibiotikum zabráni bunkám, ktorým chýba plazmid, rásť na doskách. PBR322 tiež obsahuje ďalší gén, ktorý poskytuje rezistenciu na antibiotikum tetracyklín. Okrem toho má pBR322 jednoduché reštrikčné miesta pre mnoho bežne používaných reštrikčných enzýmov (každý z týchto enzýmov teda rozštiepi pBR322 iba v jednom odlišnom mieste, pričom linearizuje plazmid). Mnoho z týchto reštrikčných miest je v géne rezistencie na tetracyklín. Inzercia cudzích fragmentov DNA (ako sú sekvencie P-elementov Drosophila P) do týchto reštrikčných miest teda naruší gén pre rezistenciu k tetracyklínu, čím sa stane neschopným poskytnúť rezistenciu voči tetracyklínu. Bunky, ktoré nesú rekombinantné plazmidy s inzertmi sekvencie P-elementov v géne odolnom voči tetracyklínu, nebudú rásť na platniach, ktoré obsahujú tetracyklín.

V tomto projekte umiestnite bunky, ktoré ste sa pokúsili transformovať, na misky s pPi25.1 a s kontrolným plazmidom pBR322 na dvoch rôznych typoch platní s živným agarom. Prvý typ doštičiek bude obsahovať ampicilín. Druhý typ doštičiek bude obsahovať tetracyklín.

Čo očakávate, že uvidíte na každej z rôznych platní, ktoré budete nastavovať?

Amplifikácia sekvencií špecifických pre P-prvok z rekombinantných plazmidov
Potom, čo ste purifikovali svoju plazmidovú DNA p 𗜙.1, zahájite PCR reakciu na konkrétne zosilnenie sekvencií P-prvkov. Priméry pre túto PCR reakciu boli navrhnuté po preskúmaní sekvencie nukleotidových bázových párov P-elementu (dostupné na World Wide Web). Po ukončení reakcie PCR spustíte produkty PCR na agarózovom elektroforetickom géli. Budete hľadať pás na géli, ktorý obsahuje sekvencie P-prvkov, a v skutočnosti tento pás z gélu vystrihnete žiletkou, čím pripravíte čistú vzorku DNA prvku P na sekvenovanie a použitie ako pozitívnu kontrolu pre Sekvencia P-prvkov.
Použitie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pri pokuse o detekciu P-prvkov
Na kontrolu prítomnosti P-elementov vo vašich vzorkách genómovej DNA muchy použijete stratégiu založenú na PCR. Najprv izolujete genómovú DNA z miestneho kmeňa, ako aj z iných kmeňov Drosophila melanogaster. Dvojicu vyššie uvedených PCR primerov použijete na pokus o amplifikáciu a detekciu P-prvkov v genóme lokálneho kmeňa Drosophila. Na géli budete hľadať pásy, ktoré môžu obsahovať sekvencie P-prvkov. V skutočnosti vystrihnete vybrané pásy z gélu žiletkou a extrahujete DNA z agarózy, čím pripravíte čisté vzorky DNA na sekvenovanie a analýzu.
Analýza vašich sekvenčných údajov pomocou bioinformatického prístupu
Akonáhle sú určené sekvencie páru nukleotidových báz vašich produktov PCR, analyzujete ich pomocou bioinformatického prístupu. Na analýzu sekvencií budete vykonávať RÝCHLE vyhľadávanie. Vykonáte tiež ďalšie bioinformatické analýzy a budeme o nich diskutovať v triede a v laboratóriu.

Náčrt laboratórneho projektu
* = práca s DNA P-elementu pozitívnej kontroly z rekombinantného plazmidu p 𗜙.1
# = práca s genómovou DNA mušiek
*# = práca s DNA P-elementu pozitívnej kontroly z rekombinantného plazmidu p &# 96025.1 a genómovou DNA muchy

Laboratórna relácia 1
1) *Transformujte bunky E. coli plazmidom obsahujúcim DNA pozitívneho kontrolného P-prvku a bunky naneste na platňu.

Laboratórna relácia 2
1) #Začnite izolovať genómovú DNA z ovocnej mušky, Drosophila melanogaster.
2) *Identifikujte kolónie transformantov na svojich doštičkách z laboratória Lab Session 1 a vypočítajte účinnosti transformácie.

Laboratórna relácia 3
1) #Dokončite izoláciu genómovej DNA z ovocnej mušky, Drosophila melanogaster.
2) #Nastavte a spustite PCR reakcie na amplifikáciu predpokladaných sekvencií P-prvkov s použitím mušej genómovej DNA ako templátu. Počas relácie 5 urobíte elektroforetickú analýzu produktov (produktov) PCR.

Laboratórna relácia 4
1) *Váš inštruktor vypestuje 2 ml kultúry vybraných kolónií z vašich doštičiek, ktoré ste založili počas relácie 1.
2) *Z týchto kultivovaných buniek izolujete rekombinantnú plazmidovú DNA obsahujúcu sekvencie pozitívnej kontroly P-elementu.
3) *Vytvorte PCR reakciu na špecifickú amplifikáciu sekvencií P-elementov z rekombinantného plazmidu. Uložte tieto produkty PCR na elektroforetickú analýzu počas relácie 5.

Laboratórna relácia 5
1) *#Na všetky produkty PCR naneste gél a izolujte vybrané pásy DNA.

Laboratórna relácia 6
1) *#Vyčistite DNA v pásoch vystrihnutých z gélov počas laboratórneho cvičenia 5. Odošlite DNA na sekvenovanie.

Laboratórna relácia 7
1) *#Prijímajte a organizujte svoje údaje o sekvenčnej analýze.

Laboratórna relácia 8
1) *#Analyzujte svoje údaje sekvenčnej analýzy vykonaním vyhľadávania BLAST atď. Experimentálne postupy

Laboratórna relácia 1
1. Transformujte bunky E. coli plazmidom obsahujúcim pozitívnu kontrolnú DNA P-elementu a bunky uložte na platne.

Počas tejto laboratórnej relácie začnete s procesom prípravy veľkého množstva DNA pozitívnej kontroly P-prvku. Rekombinantný plazmid nazvaný p 𗜙.1, ktorý obsahuje sekvencie P-prvkov, vložíte do kompetentného E.coli bunky, "transformujúce" bakteriálne bunky. Bunky potom naložíte na platne s živným agarom, ktoré obsahujú antibiotikum, ampicilín, ktorý usmrtí netransformované bunky. Budete tiež vykonávať niektoré kontrolné experimenty. Bunky E. coli budete transformovať čistým plazmidom nazývaným pBR322, čo je vektorový plazmid p 𗜙.1 (pBR322 = p 𗜙.1 – sekvencie P-elementov). Vaše dve sady transformovaných buniek položíte na dva rôzne typy tanierov. Jeden typ doštičky bude obsahovať ampicilín, zatiaľ čo druhý bude obsahovať iné antibiotikum nazývané tetracyklín. PBR322 obsahuje gény pre rezistenciu na ampicilín aj pre rezistenciu na tetracyklín, takže bunky transformované pBR322 by mali rásť na oboch typoch doštičiek. Po pozorovaní reštrikčných máp p 𗜙.1 a pBR322 urobte predpoveď o tom, na ktorých doštičkách bunky transformované týmto rekombinantným plazmidom budú rásť.

Postup
1) Získajte dve mikrocentrifugačné skúmavky plazmidovej DNA označené pBR322 a p 𗜙.1 a dve mikrocentrifugačné skúmavky obsahujúce 90 & mikrolitrovú riediacu tekutinu (sterilný fyziologický roztok). Pipetujte 10 μl vzorky plazmidovej DNA pBR322 do jednej zo skúmaviek s 90 μl riediacej tekutiny, aby sa vytvorilo riedenie 10-1. Označte túto skúmavku kontrolou#8220pBR322 Iba DNA ”. Opakujte pre vzorku plazmidovej DNA p𗜙.1, potom odložte tieto dve zriedené (10-1) vzorky DNA na chvíľu bokom.

2) Získajte skúmavku s mikrocentrifúgami obsahujúcu kompetentné bunky E. coli a umiestnite ju na ľad.

3) Jemne poklepte špičkou prsta na skúmavku s kompetentnými bunkami, aby ste sa uistili, že bunky sú dobre suspendované.

4) Pomocou pipety preneste 0,2 ml (200 mikrolitrov) kompetentných buniek do skúmavky obsahujúcej zvyšok neriedenej plazmidovej DNA pBR322. Skúmavku uzatvorte a klepnite na ňu špičkou prsta, aby sa bunky zmiešali s DNA. Skúmavku položte na ľad na 20 minút. Kompetentné bunky, ktoré sú suspendované v CaCl2, začnú vychytávať rekombinantnú plazmidovú DNA.

5) Podobne pomocou pipety preneste 0,2 ml (200 & mikrol) príslušných buniek do zostávajúcej skúmavky neriedenej plazmidovej DNA p 𗜙.1. Uzavrite viečkom a klepnite, ako predtým, a skúmavku vložte na 20 minút na ľad.

6) Podobne pomocou pipety preneste 0,2 ml (200 & mikrol) kompetentných buniek do skúmavky označenej “Cells Only ”, ktorá obsahuje iba 5 & mikrol sterilného fyziologického roztoku. Uzavrite viečkom a klepnite, ako predtým, a skúmavku vložte na 20 minút na ľad.

7) Po 20-minútovom ošetrení ľadom vložte tri skúmavky do vodného kúpeľa s teplotou 42 °C na 1,5 minúty. Tento tepelný šok uľahčuje príjem DNA bakteriálnymi bunkami.

8) Skúmavky preneste na ľad na 1,5 minúty.

9) Do každej skúmavky, vrátane dvoch skúmaviek “DNA Only control”, pridajte pomocou pipety 0,8 ml (800 mikrolitrov) LB (L Broth, médium na rast baktérií bohaté na živiny).

10) Skúmavky inkubujte pri 37 °C 20 minút, potom poklepte na každú skúmavku, aby sa obsah dobre premiešal. Umiestnite ich späť na 37 °C na ďalších 20 minút. Táto inkubačná doba umožňuje bunkám zotaviť sa z ošetrenia CaCl2 a začať v plazmide exprimovať gény rezistencie na ampicilín a/alebo gény rezistencie na tetracyklín. Klepnutím premiešajte obsah každej zo skúmaviek.

11) Teraz transformujte svoje transformačné zmesi pred nanesením na platne na selektívne agarové médium. Preneste 0,1 ml (100 mikrolitrov) transformačnej zmesi pBR322 do skúmavky obsahujúcej 9,9 ml riediacej tekutiny. Toto je riedenie 1: 100 (alebo 10-2). Urobte tiež riedenie 10-3 prenesením 1,0 ml z riedenia 10-2 do skúmavky obsahujúcej 9,0 ml riediacej tekutiny

12) Opakujte krok 11 pre transformačnú zmes p 𗜙.1.

13) Pomocou techniky & quotspread pokovovania (ktorá vám vysvetlí a predvedie váš laboratórny inštruktor) naneste na tanier 0,2 ml (200 & mikrol) každého z troch riedení transformačnej zmesi pBR322 (neriedený, 10-2, 10-3). LBAmp platne a tiež na LBTet platne.

14) Opakujte krok 13 pre tri riedenia transformačnej zmesi p 𗜙.1, pomocou doštičiek LBAmp a LBTet.

15) Naneste 0,1 ml (100 mikrolitrov) “Cells Only” na platňu LBAmp aj LBTet. Tiež naneste 0,2 ml (200 a mikrol.) Každej z dvoch kontrolných vzoriek “DNA Only ” (10-1 riedenie vzoriek plazmidovej DNA + 800 & mikrol LB) na oddelené platne LB (platňa s LB, ale bez antibiotika).

16) Spolu by malo byť 16 tanierov. Inkubujte tieto platne hore dnom pri 37 ° C. Zajtra ráno váš inštruktor premiestni taniere do chladničky na uskladnenie do budúceho týždňa.

17) Okrem toho musí váš laboratórny inštruktor naniesť niekoľko riedení (skúste 3 rôzne riedenia: 10-4, 10-5, 10-6) netransformovaných buniek E. coli, ktoré prešli postupmi amplifikácie a transformácie na platniach s výživným agarom. nedostatok antibiotík. Toto bude slúžiť ako kontrola, ktorá vám umožní určiť titer (koncentráciu) pôvodnej suspenzie buniek, a teda vypočítať účinnosti transformácie, ktoré dosiahnete.

Laboratórna relácia 2
1. Začnite izolovať genómovú DNA z ovocnej mušky Drosophila melanogaster.
2. Identifikujte kolónie transformantov na svojich doštičkách z laboratória Lab Session 1 a vypočítajte účinnosti transformácie.

Počas tejto laboratórnej relácie zahájite aj proces izolácie genómovej DNA z ovocných mušiek. Asi 50 dospelých múch anestetizujete, potom ich rozdrvíte (homogenizujete) v špeciálnom pufri, ktorý udržuje DNA stabilnú. Výsledný homogenát potom ošetríte detergentom, ktorý naruší bunkové membrány, a proteázovým enzýmom na zničenie bielkovín. Nakoniec zmiešajte homogenát s kombináciou fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu a uložte ho do mrazničky do ďalšej laboratórnej relácie.
Tiež preskúmate taniere, ktoré ste pripravili v minulom sedení, a hľadáte kolónie baktérií. Spočítate počet kolónií na každej z vašich tanierov a určíte účinnosť transformácie. Časť 1. Izolácia genómovej DNA z Drosophila melanogaster

Postup
1) Najprv vám bude poskytnutá injekčná liekovka obsahujúca ovocné mušky. Anestetizujte všetky muchy v injekčnej liekovke, ako to ukázal váš laboratórny inštruktor. Anestetizované mušky položte na kartu z bieleho papiera a prezerajte si ich pomocou pitevného mikroskopu. Ďalšie informácie o ovocných muškách nájdete v projekte 2.

2) Nacvičte si pohyb mušiek na papieri z bieleho papiera pomocou jemného štetca. Preneste približne 50 múch do 1,7 ml mikrocentrifugačnej skúmavky. Skúmavku uchovávajte na ľade.

3) Pridajte 500 mikrolitrov HOM* pufra k muchám v mikrocentrifugačnej skúmavke. Pomocou modrého plastového homogenizátora muchy homogenizujte. Použite niekoľko ťahov a nebuďte príliš drsní. Pridajte ďalších 500 a mikrol HOM pufra do skúmavky a pokračujte v homogenizácii múch, kým nie sú rozpoznateľné žiadne časti tela.

(*HOM: 80 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 160 mM sacharóza, pH 8,0)

4) Homogenát preneste do 15 ml centrifugačnej skúmavky. Pridajte ďalších 500 mikrolitrov HOM do pôvodnej mikrocentrifugačnej skúmavky a potom preneste do 15 ml centrifugačnej skúmavky.

5) Pridajte 75 a mikrol 10% SDS a 25 a mikrol 10 mg/ml proteinázy K.

6) Inkubujte aspoň 1 hodinu pri 68 °C.
Počas tejto inkubácie urobte časť 2 dnešnej laboratórnej relácie.

7) Po inkubácii pri 68 ° C ochlaďte na ľade, až kým nedosiahne izbovú teplotu.

8) Pridajte množstvo fenolu: chloroformu: izoamylalkoholu (25: 24: 1) rovnajúce sa množstvu tekutiny vo vašej skúmavke (

2 ml) a premiešajte. Uložte to do mrazničky do nasledujúceho laboratórneho obdobia.

Časť 2. Skúška transformačných platní
1) Zaobstarajte si taniere, ktoré ste pripravili v minulom sedení.

2) Váš inštruktor vám ukáže, ako efektívne spočítať počet kolónií na každej platni a určiť účinnosť transformácie.

Dokončite 1. časť dnešnej laboratórnej relácie.

Laboratórna relácia 3
1. Dokončite izoláciu genómovej DNA z ovocnej mušky Drosophila melanogaster.
2. Nastavte a spustite PCR reakcie s použitím genómovej DNA ako templátu.

Počas tohto laboratórneho sedenia dokončíte proces izolácie genómovej DNA z ovocných mušiek. Vykonáte sériu extrakcií fenol:chloroform:izoamylalkohol, aby ste odstránili nečistoty z DNA, a pomocou etanolu vyzrážate DNA preč od iných nečistôt. Svoju genómovú DNA muchy rozpustíte v pufri zvanom TE. Nakoniec nastavíte a spustíte reakcie PCR na detekciu domnelých sekvencií P-elementov pomocou vašej genómovej DNA muchy ako templátu.

Postup
1) Vyberte vzorku z laboratórnej relácie 2 z mrazničky a nechajte ju rozmraziť pri izbovej teplote.

2) Vzorku odstreďte 5 minút pri 5 000 ot./min.

3) Preneste vodnú (vrchnú) vrstvu do čistej 15 ml centrifugačnej skúmavky a pridajte do nej 1 objem zmesi fenol:chloroform:izoamylalkohol (25:24:1). Zmiešajte a odstreďujte pri 5 000 ot./min. počas 5 minút.

4) Preneste vodnú (vrchnú) vrstvu do čistej centrifugačnej skúmavky a pridajte do nej 1 objem chloroformu. Mieša sa a centrifuguje sa pri 5 000 ot./min. 5 minút.

5) Vodnú (hornú) vrstvu preneste do čistej centrifugačnej skúmavky a pridajte k nej 1 objem chloroformu. Zmiešajte a odstreďujte pri 5 000 ot./min. počas 5 minút.

6) Vodnú (hornú) vrstvu preneste do čistej centrifugačnej skúmavky a pridajte do nej 225 mikrolitrov 8M octanu draselného (KOAc). Premiešajte a dajte na ľad aspoň na 30 minút.

7) Centrifugujte to pri 13 000 otáčkach za minútu po dobu 20 minút.

8) Supernatant sa prenesie do čistej skúmavky a pridá sa k nemu 1 objem 95% etanolu. Inkubujte 10 minút pri teplote miestnosti, aby sa vyzrážala genómová DNA Drosophila.

9) Odstreďte to pri 10 000 ot / min po dobu 10 minút. Odstráňte etanol a nechajte peletu mierne vyschnúť na vzduchu.

10) Peletu resuspendujte v 50 a mikrolitroch pufra TE.

11) Preneste všetku resuspendovanú DNA do čistej mikrocentrifugačnej skúmavky a skúmavku vhodne označte.

Postup
1) Označte mikroskúmavku svojimi iniciálkami a písmenom Q (pre “kvantifikačnú vzorku”). Do skúmavky nalejte 250 a mikrol destilovanej vody.

2) Pomocou mikropipetéra 2 & microl pridajte 0,5 & mikrol DNA zo vzorky do skúmavky Q. Dobre premiešajte vortexovaním.

3) Stanovte koncentráciu svojich vzoriek DNA pomocou UV spektrofotometra. Váš inštruktor vám to predvedie.

4) Označte čerstvú skúmavku mikrofugy svojimi iniciálami, skratkami vzoriek a P (pre PCR). Z vašich kvantifikačných údajov vypočítajte potrebný objem vzorky na pridanie 40 ng genómovej DNA Drosophila do skúmavky (pravdepodobne sa to bude líšiť medzi vzorkami a možno budete musieť zriediť alikvóty DNA pufrom TE). Do skúmavky pridajte príslušné množstvo zmesi DNA, priméru a reakčnej zmesi PCR a umiestnite ju do tepelného cyklovača. Keď sú vzorky všetkých v tepelnom cykléri, zapne sa a spustí sa počas správneho počtu cyklov.
Po dokončení reakcií PCR váš inštruktor vypne termocykler a uloží vaše vzorky do budúceho týždňa.
Uložte zvyšok svojej genómovej DNA Drosophila do mrazničky.

Laboratórna relácia 4
1. Váš inštruktor vypestuje 2 ml kultúry vybraných kolónií z vašich doštičiek, ktoré ste založili počas relácie 1.
2. Z týchto kultivovaných buniek izolujete rekombinantnú plazmidovú DNA obsahujúcu P-element pozitívne kontrolné sekvencie.
3. Vytvorte PCR reakciu na špecifickú amplifikáciu sekvencií P-elementov z rekombinantného plazmidu. Uložte tieto produkty PCR na elektroforetickú analýzu počas relácie 6.

Popoludní pred týmto laboratórnym sedením váš inštruktor vybral bakteriálne kolónie z vašich doštičiek, ktoré ste založili počas relácie 1. Tieto bakteriálne kolónie pozostávajú z buniek, ktoré boli transformované rekombinantným plazmidom p 𗜙.1 (obsahuje sekvencie P-prvkov). Váš inštruktor naočkoval do každej kolónie 2 ml LB (živný bujón) + ampicilín. Naočkované kultúry rástli cez noc pri 37 °C. Počas tohto laboratórneho sedenia izolujete plazmidovú DNA z týchto nočných tekutých kultúr. Potom nastavíte PCR reakciu na amplifikáciu sekvencií P-prvkov na použitie ako pozitívna kontrola. Tieto produkty PCR uložíte na elektroforetickú analýzu počas relácie 6.

Časť 1. Izolácia rekombinantnej plazmidovej DNA

Postup
1) Každý pár študentov by mal dostať dve skúmavky obsahujúce 2 ml kultúr cez noc, pričom každá vychádzala z jednej kolónie buniek transformovaných rekombinantným plazmidom p𗜙.1 (obsahuje sekvencie P-prvkov).

2) Nalejte 1,5 ml jedného cez noc do primerane označenej mikrocentrifugačnej skúmavky. Nalejte 1,5 ml druhej kultúry cez noc do druhej vhodne označenej mikrocentrifugačnej skúmavky. Nasledujúce pokyny platia pre každú z dvoch mikrocentrifugačných skúmaviek.

3) Odstreďujte skúmavku pri plnej rýchlosti počas 20 sekúnd, aby sa bunky peletovali.

4) Supernatant vylejte zo skúmavky. Supernatant zlikvidujte.

5) Resuspendujte baktérie v 100 mikrokroloch (0,1 ml) GTE tlmivého roztoku tak, že dobre vortexujete.

6) Do každej skúmavky pridajte 200 a mikrol (0,2 ml) roztoku NS, aby sa baktérie lyzovali. Zmiešajte niekoľkokrát prevrátením skúmavky. Skúmavku nechajte pri izbovej teplote 5 minút.

7) Do skúmavky pridajte 100 ml (0,1 ml) octanu draselného (KOAc). Zmiešajte energickým potrasením skúmavky. Mali by ste vidieť ťažkú, zrazenú zrazeninu bakteriálnej genómovej DNA, bielkovín, lipidov a sacharidov.

8) Odstreďujte skúmavku pri plnej rýchlosti 2 minúty.

9) Odstráňte supernatant pomocou plastovej prenosovej pipety. Snažte sa vyhnúť plávajúcim bielym úlomkom a peletám. Supernatant sa prenesie do novej, vhodne označenej mikrocentrifugačnej skúmavky.

10) Pridajte 500 mikrolitrov (0,5 ml) izopropanolu do skúmavky obsahujúcej supernatant. Zmiešajte niekoľkokrát prevrátením skúmavky.

11) Skúmavku centrifugujte pri plnej rýchlosti 2 minúty.

12) Odstráňte supernatant plastovou prenosovou pipetou a supernatant zlikvidujte. Peleta obsahuje plazmidovú DNA. Peleta sa resuspenduje v 100 mikrokroloch (0,1 ml) 50 mM Tris, pH 8,3.

13) Pridá sa 50 mikrolitrov 8 M octanu amónneho (NH4Ac). Zmiešajte obsah skúmavky a vložte ju do kúpeľa suchý ľad/etanol, kým obsah nezmrzne (

14) Nechajte obsah skúmavky rozmraziť pri izbovej teplote, potom ju odstreďte 2 minúty pri plnej rýchlosti.

15) Supernatant obsahuje plazmidovú DNA. Preneste tento supernatant do novej, vhodne označenej mikrocentrifugačnej skúmavky.

16) Pridajte 500 a mikrol etanolu. Obsah premiešajte niekoľkonásobným prevrátením skúmavky. Skúmavku centrifugujte pri plnej rýchlosti 2 minúty.

17) Vylejte etanolový supernatant zo skúmavky. Zlikvidujte etanol. Skúmavku rýchlo premiešajte a potom zo skúmavky vyberte zvyšok etanolu, pričom peletu plazmidovej DNA nechajte nerušenú.

18) Nechajte peletu sušiť na vzduchu asi 5 minút, potom peletu resuspendujte v 25 a mikrolitroch pufra TE.

Postup
1) Pre každú zo svojich vzoriek DNA označte skúmavku s mikrocentrifugou svojimi iniciálami, názvom vzorky DNA a písmenom Q (pre “kvantifikačnú vzorku ”). Do každej skúmavky nalejte 998 µg destilovanej vody.

2) Pomocou mikropipetéra 5-40 a mikrolitrov pridajte 2,0 a mikrol každého z vašich vzoriek rekombinantnej plazmidovej DNA do vhodne označenej Q skúmavky. Každú dobre premiešajte vortexovaním.

3) Stanovte koncentráciu svojich vzoriek DNA pomocou UV spektrofotometra. Váš inštruktor vám to predvedie. Vyberte vzorku DNA s najdôveryhodnejšou koncentráciou, ktorú použijete v ďalšej analýze.

4) Zrieďte alikvotnú časť vašej vzorky plazmidovej DNA na koncentráciu 8 ng/µm.

5) Pridajte 5 & mikrol (= 40 ng) rekombinantnej plazmidovej DNA do skúmavky obsahujúcej reakčnú zmes PCR (reakčný pufer, deoxynukleotid trifosfáty [dNTP], priméry a Taq DNA polymerázu) a umiestnite do tepelného cyklovača. Keď sú všetky vzorky v termocykléri, zapne sa a spustí sa so správnym počtom cyklov.
Po dokončení reakcií PCR váš inštruktor vypne tepelný cyklovač a vaše vzorky vám uloží do budúceho týždňa.

Laboratórna relácia 5
1. Na produkty PCR naneste gél a izolujte fragment DNA.
V tejto laboratórnej relácii budete analyzovať svoje produkty PCR ich elektroforézou na špeciálnom agarózovom géli s nízkou teplotou topenia. Na základe výsledkov tohto experimentu budete môcť určiť veľkosť amplifikovaného fragmentu DNA DNA prvku, ktorý vyplynul z vašej reakcie PCR. Úlomky, ktoré obsahujú čistú DNA P-prvku, izolujete tak, že ich z gélu vystrihnete žiletkou. Pritom pripravíte čistú DNA P-prvku.

Časť 1. Elektroforetická analýza produktov PCR

Postup
1) Vyberte skúmavky obsahujúce všetky vaše produkty reakcie z mrazničky a zahrievajte ich vo vodnom kúpeli s teplotou 70 ° C po dobu 5 minút a potom ich dajte na ľad.

2) Dostanete ďalšiu mikroodstredivkovú skúmavku s označením „lambda-Hind III“. Táto skúmavka obsahuje fág? DNA úplne štiepená Hind III. Táto natrávená DNA bude pozostávať z fragmentov DNA známej dĺžky, ktoré budú slúžiť ako štandardy veľkosti DNA vo vašom elektroforetickom géli. Umiestnite túto skúmavku do vodného kúpeľa s teplotou 70 °C na 5 minút a potom ju ponechajte na ľade, kým nebudete pripravení ju použiť.

3) Pridajte 5 & mikrol elektroforetického tlmivého roztoku na vzorky do skúmaviek obsahujúcich vaše produkty PCR. Klepnutím na skúmavky premiešajte obsah.
Upozornenie: Gél a rezervoárový pufer použité v krokoch 4-8 obsahujú etídiumbromid (etBr), karcinogén. Pri manipulácii s čímkoľvek, čo obsahuje etBr, noste rukavice!

4) Do jamiek so vzorkou agarózového gélu vložte celý obsah skúmavky „lambda-Hind III “a 25 µl každej reakcie PCR:

5) Zakryte elektroforetickú jednotku a zapojte vodiče do napájacieho zdroja. Vodiče sú farebne označené tak, aby sa červený vodič zapojil do kladného pólu a čierny vodič do záporného pólu. Jamky na vzorky v géli by mali byť najbližšie k negatívnej (čiernej) elektróde.

6) Zapnite zdroj napájania a nastavte napätie na približne 100 voltov. Elektroforézujte dovtedy, kým sa brómfenolová modrá (farbivo) vo vzorkách nemigruje do vzdialenosti 5 mm od pozitívneho (červeného) konca gélu s elektródou. Pri 100 voltoch by to malo trvať približne 1 hodinu.

7) Po dokončení procesu gélu vypnite napájanie a odpojte káble. Vyberte gél z jednotky a umiestnite ho na ultrafialový (UV) transiluminátor.

8) Zapnite UV transiluminátor a odfoťte svoj gél pomocou gélového snímača, ako to ukázal váš inštruktor.

9) Použitím informácií v časti “Interpretácia údajov o elektroforéze ” tejto príručky (s. 19–20) a podľa pokynov vášho laboratórneho inštruktora určte veľkosť (y) fragmentov DNA v akýchkoľvek pásoch v & Výrobky#8220PCR a#8221 pruhy vášho gélu.

10) Prezrite si sekvenciu P-prvku a rozhodnite, ktoré pásy na géli obsahujú fragmenty čistej P-elementovej DNA. Váš inštruktor predvedie, ako tieto pásy vystrihnúť z gélu pomocou čistého holiaceho strojčeka, čím sa izoluje čistá DNA P-prvku na použitie ako pozitívna kontrola pre sekvenciu P-prvkov. Po vyrezaní príslušných pásov DNA vložte každý z nich do samostatnej skúmavky s mikrocentrifugáciou a skúmavky uložte do chladničky.

Laboratórna relácia 6
1. Vyčistite DNA v pásoch vystrihnutých z gélov počas laboratórnej relácie.
2. Pošlite DNA preč na sekvenovanie.

Aby ste mohli sekvenovať svoje produkty PCR, budete musieť svoj produkt PCR vyčistiť od kontaminujúcej agarózy. Urobíte to pomocou “spin columns” z komerčne dostupnej súpravy.Potom pošlete svoje vyčistené vzorky DNA biotechnologickej spoločnosti, aby ich sekvenovala.

Časť 1. Čistenie produktu PCR

Postup
1) Získajte hmotnosť pre váš produkt PCR: Vyvážte váhu pomocou prázdnej skúmavky na mikrocentrifúgu a potom odvážte plátok gélu v skúmavke.

2) Pomocou mikropipetéra pridajte pufr QG do skúmavky obsahujúcej plátok gélu (pridajte 300 ul QG na každých 10 mg plátu gélu), plátok gélu zahrievajte v pufri v zahrievacom bloku 65 ° C počas 10 minút alebo do úplného roztavenia.

3) Odstráňte roztok gélových plátkov z vyhrievacieho bloku a pridajte izopropanol (100 & mikro na každých 10 mg gélového plátku).

4) Pomocou mikropipety preneste roztok gélových plátkov do rotačnej kolóny. Umiestnite rotačnú kolónu do zbernej skúmavky a centrifugujte pri plnej rýchlosti 1 minútu (ak máte príliš veľký objem na to, aby sa zmestil do kolóny, naplňte kolónu asi do 2/3, odstreďte ju a vylejte prietok. Potom pridajte zvyšok vášho roztoku do kolóny a druhýkrát odstreďte).

5) Zlikvidujte prietok zo zbernej skúmavky.

6) Premyte rotačnú kolónu pridaním 500 μl QG pufra do rotačnej kolóny a centrifugujte pri plnej rýchlosti 1 minútu. Zlikvidujte prietok zo zbernej trubice.

7) Premyte rotačnú kolónu druhýkrát, tentoraz pridaním 750 mikrolitrov pufra PE do rotačnej kolóny, a centrifugujte pri plnej rýchlosti počas 1 minúty. Zlikvidujte prietok zo zbernej trubice.

8) Rotačná kolóna sa suší otáčaním ďalšiu minútu v mikrocentrifúge pri 13 000 otáčkach za minútu.

9) Ak chcete eluovať svoju DNA, presuňte rotačnú kolónu do čistej mikrocentrifugačnej skúmavky. Pridajte 50 mikrolitrov tlmivého roztoku TE do kolóny a nechajte tlmivý roztok preniknúť do matrice kolóny aspoň 1 minútu.

10) Eluujte odstreďovaním pri plnej rýchlosti 1 minútu. Vaša DNA bude teraz na dne mikrocentrifugačnej skúmavky.

11) Stanovte koncentráciu svojich vzoriek DNA pomocou UV spektrofotometra, ako ste to urobili v laboratórnych reláciách 3 a 4.

12) Váš intruktor vám ukáže, ako pripraviť vzorku (-y) DNA na odoslanie do biotechnologickej spoločnosti na sekvenovanie.

Laboratórna relácia 7
Prijímajte a organizujte svoje údaje o sekvenčnej analýze.
Dostaneme údaje zo sekvenovania vašich vzoriek DNA. Údaje budú odoslané e-mailom a budú k dispozícii online. Váš inštruktor vám ukáže, ako načítať a interpretovať údaje o sekvenovaní. Mali by ste sa oboznámiť s údajmi a usporiadať ich tak, aby ste ich mohli analyzovať počas nasledujúcej laboratórnej relácie.

Laboratórna relácia 8
Analyzujte svoje údaje sekvenčnej analýzy vykonaním vyhľadávania BLAST. Budete tiež robiť ďalšie bioinformatické analýzy a budeme o nich diskutovať v triede a v laboratóriu. Ak môžete, prineste si do laboratória prenosný počítač ešte dnes!
Váš inštruktor vám ukáže, ako analyzovať vaše sekvencie DNA, a to pomocou BLAST vyhľadávaní. Potom vykonáte rozsiahlu bioinformatickú analýzu vašich sekvenčných údajov. Tým by ste mali byť schopní odpovedať na mnohé otázky, vrátane nasledujúcich:

-Majú DNA pozitívnej kontroly P-elementu očakávanú sekvenciu?
-Sú vaše sekvencie amplifikované zo sekvencií P-prvkov genómovej DNA Drosophila?
-Ak sú vaše sekvencie amplifikované z genómovej DNA Drosophila v skutočnosti sekvenciami P-prvkov, sú presne také, ako publikovaná sekvencia P-prvkov divokého typu? Ak nie, v čom sa líšia?
-Ak sú vaše sekvencie amplifikované z genomických sekvencií P-prvkov Drosophila genómovej DNA, nie sú to sekvencie P-prvkov, čo sú to? Ako mohli byť zosilnené pomocou primerov, ktoré ste použili?

Mali by ste myslieť na ďalšie otázky a vaša skupina prediskutuje celý projekt a zistenia. Príjemnú zábavu!

Interpretácia údajov z elektroforézy

1) Obrázok 7 ukazuje dĺžky (v kb) fragmentov DNA v každom páse, ktoré sú výsledkom elektroforézy 1 DNA štiepenej samotným Hind III (štandardy veľkosti DNA v tomto experimente). Preskúmajte pásy v pruhu lambda-Hin d III vášho gélu a určte dĺžky fragmentov, ktoré tvoria každý pás. Napríklad pás, ktorý je najbližšie k jamke vzorky, predstavuje najväčší fragment, ktorý je dlhý 23,1 kb. Určte vzdialenosť (v mm), ktorou každý z týchto pásov lambda-Hin d III migroval zo vzorkových jamiek. Pomocou semilogaritového milimetrového grafu zakreslite migračnú vzdialenosť (v mm) každého pásu lambda-Hin d III na os X a dĺžku fragmentu DNA (v kb) tohto pásu na os Y. Body nakreslite do grafu. Z tohto grafu určte dĺžku fragmentov, ktoré tvoria každý pás v experimentálnych dráhach vášho gélu alebo autorádiogramu, na základe ich migračných vzdialeností. Pre každé pásmo postupujte takto:

a) Nájdite migračnú vzdialenosť pásma na osi X vášho grafu.
b) Nájdite bod na priamke, ktorý je priamo nad touto súradnicou X.
c) Nájdite bod na osi Y, ktorý je priamo naľavo od tohto bodu na priamke. Táto súradnica Y je veľkosť fragmentu (v kb).

Projekt 2: Izolácia a charakterizácia mutácií v Drosophila melanogaster

Jedným z najpoužívanejších organizmov v genetických štúdiách je ovocná muška, Drosophila melanogaster. Thomas Hunt Morgan bol priekopníkom genetických štúdií s Drosophila na Kolumbijskej univerzite v roku 1911. Dnes existuje veľké množstvo poznatkov o genetike ovocných mušiek. Drosophila má štyri páry chromozómov (relatívne malý počet), ktoré boli rozsiahle charakterizované. Za menej ako dva týždne ovocná muška prechádza špecifickou vývojovou sekvenciou od oplodneného vajíčka po larvu, prepupu, kuklu a potom dospelého jedinca. Genetik môže sledovať dedičnosť morfologických, fyziologických a vývojových vzorcov. V tomto projekte budete (genetik) vykonávať screening na identifikáciu a charakterizáciu mutantov Drosophila, ktoré vykazujú morfologické abnormality. Potom charakterizujete mutácie, ktoré identifikujete, v nádeji, že sa niečo dozviete o zapojených génoch.

Chromozómy Drosophila melanogaster

Jedinec Drosophila má štyri páry chromozómov. Žena má po dva chromozómy 1 (bežnejšie nazývané chromozóm X), 2, 3 a 4. Muž má jeden chromozóm X, jeden chromozóm Y a po dva chromozómy 2, 3 a 4. Chromozóm Y a chromozóm 4 sú veľmi malé a nesú málo génov. Väčšina génov muchy je nesená na chromozómoch X, 2 a 3. Chromozómy X a Y sa podieľajú na určovaní pohlavia, a preto sa nazývajú pohlavné chromozómy. Chromozómy 2, 3 a 4 sa nazývajú autozómy. U ovocnej mušky je pohlavie určené relatívnym počtom X chromozómov a autozómov. Ak má mucha dva chromozómy X a dva z každého autozómu (pomer X:autozóm 1:1), vyvinie sa ako samica. Ak má mucha iba jeden chromozóm X a dva z každého autozómu (pomer X: autozóm 1: 2), vyvinie sa ako samec. V Drosophile chromozóm Y neurčuje mužnosť! (To je na rozdiel od prípadu u cicavcov, u ktorých prítomnosť chromozómu Y určuje mužskú povahu.). V skutočnosti sa mucha, ktorá má dva chromozómy X a chromozóm Y, vyvinie ako žena.

Vývoj Drosophila melanogaster

K páreniu v ovocnej muške dochádza 6-8 hodín po tom, ako dospelá žena vystúpi zo svojho puzdra. Vajcia je možné v tejto chvíli klásť alebo ponechať a znášať neskôr. Žena dostane od muža asi 4000 spermií a uloží ich do špeciálnych vreciek. Spermie sa uvoľňujú postupne, keď sa tvoria vajíčka. Každá žena môže položiť niekoľko stoviek oplodnených vajíčok na povrch zdroja potravy. Z každého oplodneného vajíčka sa počas 24 hodín vyvinie larva. Larva sa vnorí do zdroja potravy a zje bunky kvasiniek. O štyri až päť dní a dva molty (uvoľnenie vonkajšej kutikuly larvy) neskôr larva vylezie na pevný povrch a kuklí sa, čím sa vytvorí prepupa, ktorá sa v tvrdom puzdre zakryje. Z prekukla sa za 12 hodín vyvinie kukla. Počas nasledujúcich 4-5 dní sa z kukly vyvinie dospelý jedinec, ktorý sa vynorí z puzdra kukly v procese eklózie. Mucha je spočiatku dlhá a tenká, so založenými krídlami a má svetlú farbu. Krídla sa postupne roztiahnu a mucha nadobudne zaoblenejšiu podobu a tmavšiu farbu. Celý životný cyklus, ktorý trvá 10-14 dní pri 25 C, je znázornený na obrázku 1.

Obrázok 1. Životný cyklus Drosophila.

Štúdium mutácií v Drosophila melanogaster

Mutácie sú silné nástroje v genetickej analýze. Logika mutačnej analýzy spočíva v tom, že sa môžeme dozvedieť o funkcii génu skúmaním toho, čo sa pokazí, keď tento gén nefunguje správne. Gény je možné zmeniť z ich foriem divokého typu mutáciami, ktoré často narúšajú alebo úplne eliminujú funkciu génu. Mutačná analýza sa nazýva „genetická disekcia“. Prvým štádiom genetickej disekcie je hon na mutanty (jednotlivé organizmy, ktoré nesú mutantné gény). Mutanty sa vyskytujú spontánne v akejkoľvek populácii s nízkou frekvenciou. Použitím mutagénov však môžeme dramaticky zvýšiť pravdepodobnosť nájdenia užitočných mutantov. Použitie mutagénu na vyvolanie mutácií sa nazýva mutagenéza. Mutagén, ktorý sa ukázal ako mimoriadne účinný pri indukcii mutácií v Drosophile, je chemický etylmetánsulfonát (EMS). EMS môže pridať etylovú skupinu (-CH2CH3) do mnohých polôh na všetkých štyroch bázach nachádzajúcich sa v DNA, čím sa menia ich vlastnosti párovania. Najbežnejšou zmenou indukovanou EMS je pridanie etylovej skupiny k guanínu (G), čo mu umožňuje párovanie s tymínom (T). Toto nelegitímne párovanie vedie k prechodom GC -& gt AT v nasledujúcom kole replikácie (pozri učebnicu Griffithsa, s. 596).
EMS indukuje vysoký podiel bodových mutácií. Tento mutagén sa ľahko podáva dospelým muchám umiestnením na filtračný papier nasýtený zmiešaným vodným roztokom EMS a cukru. Samce kŕmené 0,025 M EMS produkujú spermie nesúce smrteľné mutácie na 70% všetkých chromozómov X a takmer na každom chromozóme 2 a 3. Pri týchto úrovniach indukcie mutácií je možné hľadať (skríning) mutácií v špecifických lokusoch, alebo pre mutanty, ktoré vykazujú neobvyklé fenotypy (pozri učebnicu Griffithsa, s. 202). V tomto projekte budete skrínovať muchy, ktoré boli mutagenizované pomocou EMS, aby ste našli mutanty s abnormálnymi fenotypmi.

Použitie pripojeného chromozómu X pri mutagenéze Drosophila

Väčšina zaujímavých mutácií, ktoré sa detegujú pri skríningu po EMS mutagenéze, bude recesívna, čím sa nezíska žiadny mutantný fenotyp, pokiaľ nie sú homozygotné. Výnimkou z tejto požiadavky homozygotnosti na expresiu recesívnych mutantných fenotypov je prípad mutácií spojených s chromozómom X u samcov múch. Pretože mužská muška má iba jeden chromozóm X (a preto sa nazýva hemizygotná pre všetky gény spojené s X), bude vyjadrovať abnormálny fenotyp spojený s akoukoľvek recesívnou mutáciou na X. Použitím špeciálneho chromozómu nazývaného pripojený-X chromozóme (reprezentovaný ako X^X), je možné skrínovať samcov F1 generácie na zaujímavé mutácie na X chromozóme. Pripojený chromozóm X je zložený chromozóm vytvorený fúziou dvoch chromozómov X. Chromozóm X^X sa zdedí ako jedna jednotka a muchy nesúce chromozóm X^X budú samice. Samica, ktorá má chromozóm X^X a tiež chromozóm Y, sa môže spáriť s normálnym samcom, aby sa vytvorila samica X^X/Y a potomstvo X/Y samca F1, ako je znázornené na obrázku 2. Pripojené chromozómy X umožňujú vykonať rýchlu EMS mutagenézu a skríning mutantov kŕmením EMS samcom rodičovskej generácie, ich párením s X^X samicami a skríningom výsledných F1 potomkov samcov na abnormálne fenotypy. Schéma na uskutočnenie tohto typu mutagenézy a screeningu je načrtnutá na obrázku 3. V F1 generácii budú niesť mutagenizované X chromozómy iba muži. Pretože samce sú hemizygotné pre všetky gény viazané na X, u týchto samcov F1 sa prejavia recesívne mutácie viazané na X.

V tomto laboratórnom projekte dostanete veľkú skupinu F1 potomkov, ktoré sú výsledkom párenia samcov divokého typu liečených EMS so samicami typu pripojená X. Táto skupina múch F1 by mala obsahovať niekoľko mutantov spojených s X. Ste na pátraní po zaujímavých mutantoch. Budete pracovať vo dvojiciach, ale pri hľadaní mutantov bude spolupracovať celá trieda a mutantov môžete navzájom zdieľať. Tieto mutanty objavíte hľadaním múch vykazujúcich fenotypy, ktoré sa líšia od divokého typu. Príkladom takého fenotypu môžu byť oči, ktoré majú inú farbu ako farba očí divokého typu, tmavočervená. Môžete tiež nájsť muchy, ktoré majú abnormálne vyzerajúce krídla, štetiny alebo iné časti tela. Keď identifikujete čo najviac zaujímavých mutantov, budete ich chcieť charakterizovať. Pre danú mutáciu budete chcieť určiť, či sa táto mutácia môže preniesť na ďalšiu generáciu. Chcete tiež určiť, či je každá mutácia v skutočnosti na chromozóme X. Na zodpovedanie týchto otázok by ste mali navrhnúť experimenty. Keď ste určili, ktoré z vašich mutácií sú prenosné, je čas vybrať si jednu na podrobnejšie preskúmanie. Budete chcieť mapovať mutáciu na konkrétnu oblasť chromozómu X. Táto laboratórna príručka je navrhnutá tak, aby vám poskytla návod. Cieľom nie je viesť vás krok za krokom každým experimentom. Túto analýzu by ste mali vykonať čo najnezávislejšie! S pomocou svojich inštruktorov by ste mali navrhnúť a vykonávať experimenty na riešenie vyššie uvedených otázok. Možný harmonogram tohto projektu je uvedený nižšie.

Experimentálne postupy (pracujte v skupinách po 4)

Počas tejto laboratórnej relácie začnete skríning mutantných múch. Najprv anestetizujete a vyšetríte skupinu divokých Drosophila. Mali by ste sa zoznámiť so vzhľadom muchy divokého typu a naučiť sa rozlišovať samcov od samíc. Akonáhle sa budete cítiť pohodlne pri práci s muchami, dostanete kultivačnú fľašu obsahujúcu F1 potomstvo samcov divokého typu liečených EMS, ktoré sa spárili s pripojenými-X samicami. Fľaša bude obsahovať pripevnené-X F1 samice a X*/Y F1 samce. (Pozri obrázok 3) Budete sa sústrediť na samcov a hľadať muchy s abnormálnymi fenotypmi.

Bude vám poskytnuté:

liekovka obsahujúca ovocné mušky divokého typu
anestetikum proti muchám
letecká anestetická chemikália
karta z bieleho papiera
maliarsky štetec
pitevný mikroskop
veľká skupina potomkov F1 pochádzajúcich z párenia samcov divokého typu ošetrených EMS s
pripevnené-X ženy.
injekčná liekovka s panenskými pripojenými ženami X [C (1) A, y]
prázdne kultivačné fľaštičky od mušiek

Vyšetrenie ovocných mušiek divokého typu

Najprv vám bude poskytnutá injekčná liekovka obsahujúca ovocné mušky divokého typu. Anestetizujte všetky muchy v injekčnej liekovke, ako je popísané nižšie a ako to ukázal váš laboratórny inštruktor.

1) Odstráňte spodný uzáver anestetizátora proti muchám a vyberte penovú gumovú podložku, ktorá sa nachádza vo vnútri zariadenia.

2) „Nabite“ svoj muší anestetizér tak, že na penovú gumovú podložku nanesiete asi 10 kvapiek anestetika Fly Nap a vložíte vložku späť do zariadenia. Nasaďte späť spodný uzáver.

3) Odstráňte vrchný kryt z anestetizátora na mušky. Zľahka a rýchlo poklepte na dno liekovky s muchami na podložke na lavičke a potom odstráňte zátku z liekovky. Rýchlo prevráťte ampulku s muchami cez hornú časť otvoreného anestetika a celú vec zľahka a rýchlo poklepte na podložku, aby muchy spadli do anestetika.

4) Rýchlo uzavrite anestetizér a nechajte muchy v anestetickej komore, kým sa všetky neprestanú pohybovať (to by malo trvať niekoľko minút).

5) Vysypte anestetizované muchy z anestetika na bielu papierovú kartu a prezrite si ich pomocou pitevného mikroskopu.

6) Precvičte si pohyb múch na bielej papierovej karte jemným štetcom. Všimnite si divokú, tmavočervenú farbu očí.

7) Podľa schém na obrázku 4 a dodaných v laboratórnej miestnosti oddeľte mužov od žien. Samce majú užšie brucho ako ženy a zadný koniec mužského brucha je tmavšie pigmentovaný ako u ženy. Samce majú tmavé genitálie na extrémnych zadných koncoch brucha, ktoré samiciam chýbajú. Samce majú na svojom prednom páre nôh špecializované štetiny nazývané „hrebene“. Ak máte problém rozoznať mužov od žien pri pohľade na koniec brucha, sexuálne hrebene pozitívne identifikujú muža.

8) Akonáhle sa budete cítiť príjemne pri práci s muchami a pri rozlišovaní samcov od samíc, je načase začať skríning mutantných múch!

Obrázok 4. Rozlíšenie mužskej a ženskej drozofily

Dostanete veľkú skupinu potomkov F1 po párení samcov divokého typu ošetrených EMS s prichytenými X samicami.

1) Anestetizujte a starostlivo preskúmajte mušky, pričom sa sústreďte na samcov. Samce a samice by mali byť ľahko rozoznateľné, pretože pripojené X samice majú žlté telá, zatiaľ čo samce, pokiaľ nie sú zmenené novo vyvolanou mutáciou ovplyvňujúcou farbu tela, budú mať tmavohnedé telá. Samice budú mať žlté telá, pretože pripojené chromozómy X nesú mutáciu, žltú (skrátene y ). Názov pripojeného chromozómu X, ktorý tieto ženy nesú, je C (1) A, y. To znamená „zlúčený chromozóm 1 (X) od spoločnosti Armentrout (vedec, ktorý vytvoril chromozóm), ktorý nesie mutáciu, žltý. Obidva chromozómy X, ktoré tvoria C(1)A,y nesú žltú mutáciu, takže ženy sú homozygotné pre túto recesívnu mutáciu a vykazujú mutantnú žltú farbu tela. Majte na pamäti, že ak uvidíte žltého muža, je to pravdepodobne kvôli novo vyvolanej mutácii spojenej s X a mali by ste to ďalej skúmať.

2) Hľadaj samce, ktorí vykazujú akékoľvek rozdiely od divokého typu. Zachráňte každého mutantne vyzerajúceho muža, ktorého nájdete v jeho vlastnej kultivačnej fľaštičke. Ak absolútne nemôžete nájsť mutanta, NEBOJTE SA! Bude to tímová práca a v prípade potreby môžete získať mutanta z inej skupiny študentov. Váš inštruktor tiež poskytne ďalších mutantov.

3) S pomocou svojho laboratórneho inštruktora (ak to chcete) navrhnite a začnite experimentovať, aby ste určili, či sú mutácie, ktoré ste identifikovali, prenosné na ďalšiu generáciu. Budete mať k dispozícii všetko (vrátane múch), ktoré potrebujete na nastavenie týchto experimentov. Váš prístup by ste mali prediskutovať so svojim inštruktorom. Mali by ste tiež premýšľať o tom, ako namapujete svoje mutácie do oblasti chromozómu X.

Počas tohto laboratórneho obdobia budete interpretovať výsledky experimentu navrhnutého tak, aby ste zistili, či sú všetky vaše novo identifikované mutácie prenosné.

1) Anestetizujte muchy v injekčných liekovkách, do ktorých ste založili krížiky počas laboratórneho cvičenia 1. Skontrolujte všetky muchy. Tieto muchy, potomkovia kríženia (krížov), ktoré ste vytvorili počas Lab Session 1, sú generácie F2. Pozrite sa na muchy F2, ktoré zobrazujú mutantné fenotypy, ktoré ste identifikovali počas laboratórnej relácie 1. Dávajte pozor na rozdiely medzi mužmi a ženami.

-Ktoré z vašich mutácií sú prenosné?

-Z mutácií, ktoré sú prenosné, môžete povedať, či sú nejaké dominantné alebo recesívne? Môžete povedať, či sú niektoré viazané na X alebo autozomálne? Vysvetlite svoje úvahy.

-Ak sa konkrétna mutácia nepreniesla, zamyslite sa nad tým, prečo to tak môže byť.

2) Ak je konkrétna mutácia prenosná, začnite experiment a namapujte ju na oblasť chromozómu X. Dostanete panenské samice ovocných mušiek homozygotných pre viacnásobne označený X-chromozóm.Tento viacnásobne označený X-chromozóm nesie niekoľko rôznych recesívnych mutácií, ktoré je ľahké identifikovať. Príkladom viacnásobne označeného chromozómu X je
y cv v f chromozóm. Tento chromozóm nesie recesívne mutantné alely štyroch génov, ktoré sú rozmiestnené po dĺžke chromozómu. Tieto gény sú:

y = žltá (mapuje sa k telomére alebo extrémnemu ľavému koncu X-chromozómu, poloha na mape = 0) Homozygotné samičky múch (alebo hemizygotné samce múch) pre mutácie v žltej farbe majú veľmi svetložltú farbu tela, na rozdiel od opáleného tela farba mušiek divokého typu.

cv = bez crossveinless (pozícia na mape = 13,7, čo znamená, že je 13,7 mapových jednotiek napravo od teloméry) Homozygotné ženské muchy (alebo hemizygotné mužské muchy) pre mutácie v bez žilovej nemajú určitý súbor žíl, ktoré by mali byť na ich krídlach .

v = vermillion (poloha mapy = 33,0, čo znamená, že je to 33 mapových jednotiek napravo od telomery) Samice homozygotných (alebo samcov hemizygotných) mutácií vo vermillione majú abnormálne ružovkastú farbu očí, na rozdiel od tmavočerveného oka farba múch divokého typu.

f = vidlicovitá (pozícia na mape = 56,7, čo znamená, že je to 56,7 jednotiek mapy napravo od teloméry) Homozygotné samičky (alebo hemizygotné samce múch) pre mutácie vidlicovitých majú abnormálne ostré ohyby na konci ich štetín, čo spôsobuje vidlicové štetiny sa zdajú byť úplne odlišné od priamych, špicatých štetín ovocných mušiek divokého typu.

Schematická mapa chromozómu y cv v f by vyzerala takto:

Ak je mutácia, ktorú chcete zmapovať, spojená s X, vytvorte kríženec mužov hemizygotných pre vašu novo identifikovanú mutáciu s panenskými ženami homozygotnými pre viacnásobne označený X-chromozóm. Výsledky tohto experimentu budete interpretovať počas laboratórnej relácie 3.

Počas tohto laboratórneho obdobia budete pokračovať vo svojich mapovacích experimentoch. Budete interpretovať výsledky kríženia (krížov), ktoré ste nastavili počas Lab Session 2, a nastaviť ďalšie kríženie (alebo kríženia).

1) Anestetizujte muchy vo fľaštičkách, do ktorých ste založili krížiky počas Lab Session 2. Tieto muchy, potomstvo krížikov, ktoré ste založili počas Lab Session 2, sú generáciou F3. Prezrite si všetky muchy. Hľadajte muchy s mutantnými fenotypmi, ktoré ste identifikovali počas laboratórneho stretnutia 1. Venujte pozornosť rozdielom medzi samcami a samicami.

-Ako vyzerajú muchy samcov?

-Ako vyzerajú ženské mušky?

-Zobrazuje niektorá z múch mutantný fenotyp, ktorý ste identifikovali v laboratórnej relácii 1?

- Môžete z vašich výsledkov určiť, či je vaša novo identifikovaná mutácia dominantná alebo recesívna?

- Môžete z vašich výsledkov určiť, či je vaša novo identifikovaná mutácia alelická k nejakej známej mutácii?

2) Samice F3 sú heterozygotné pre X-chromozóm nesúci vašu novo identifikovanú mutáciu a viacnásobne označený X-chromozóm. Počas meiózy u týchto samíc môže dôjsť k prekríženiu medzi týmito dvoma X-chromozómami, výsledkom čoho sú vajíčka nesúce rekombinantné X-chromozómy. Skúmaním potomstva F4, ktoré je výsledkom kríženia týchto samíc a príslušných samcov múch, môžete určiť frekvencie rekombinácie medzi vašou novo identifikovanou mutáciou a známymi mutáciami na viacnásobne označených X-chromozómoch. To vám umožní vypočítať polohu mapy pre vašu novú mutáciu.
Keďže máte čo do činenia s mutáciami viazanými na X, môžete plánovať obmedziť analýzu potomstva F4 na samcov F4. Každý samec F4 zdedí jeden X-chromozóm od svojej heterozygotnej F3 matky a bude vykazovať fenotypy spojené s akýmikoľvek mutáciami na tomto X-chromozóme. Každý samec F4 bude buď rodičovského typu alebo rekombinantný vzhľadom na niekoľko mutácií, s ktorými pracujete. Stanovenie percenta mužských potomkov F4, ktoré sú rekombinantné, vám umožní vypočítať polohu mapy pre vašu novo identifikovanú mutáciu.
Keďže sa budete pozerať len na samcov v generácii F4, na genotype samcov, ktorých krížite s vašimi heterozygotnými samicami F3, nezáleží. Týchto mužov môžete považovať len za darcov spermií. Nastavte krížence svojich heterozygotných žien F3 s dostupnými mužmi.

Počas tohto laboratórneho obdobia by ste mali byť schopní dokončiť navrhovaný experiment s mapovaním a určiť, do ktorej oblasti chromozómu X sa mapujú všetky vaše mutácie.

1) Anestetizujte muchy vo fľaštičkách, v ktorých ste nastavili kríženie počas laboratórnej relácie 3. Tieto muchy, potomkovia krížení, ktoré ste nastavili počas laboratórnej relácie 3, sú generácie F4. Prezrite si všetky muchy. Oddeľte samce od samíc a samice zlikvidujte. Túto analýzu zameriate iba na mužov F4.

2) Vyberte tri mutácie, na ktoré chcete zamerať svoju pozornosť. Tieto tri mutácie musia zahŕňať vašu novo izolovanú mutáciu a dve z mutácií na viacnásobne označenom X-chromozóme. Teraz môžete svoju štúdiu považovať za trojbodový kríž, ako je popísané na stranách 156-167 učebnice Griffiths et al. (2002) Modern Genetic Analysi, 2. vydanie. New York, W.H. Freeman and Company. Vašou prvou úlohou bude určiť fenotyp (mutantný alebo divoký typ) každého z mužov F4 s ohľadom na tri mutácie, ktoré zvažujete. Potom môžete zistiť počet samcov F4, ktorí sú rodičovského typu a rekombinantného typu, pre každú z týchto troch mutácií.

3) Po vyhodnotení fenotypu všetkých samcov F4 určite, ktorá trieda potomstva predstavuje dvojité kríženie. Určte počet jednotlivých krížení, ku ktorým došlo medzi každou z troch mutácií. S týmito číslami by ste mali byť schopní zmapovať tri mutácie navzájom. Pretože poznáte polohy mapy dvoch z týchto mutácií, mali by ste byť schopní určiť polohu mapy pre svoju novo izolovanú mutáciu.

4) Nakreslite mapu chromozómu X zobrazujúcu polohy mapy vašej novo izolovanej mutácie a dvoch ďalších mutácií, ktoré ste použili.