We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Čítam tento článok, ktorý pojednáva o vplyve dlhej fotoperiódy (LP) a krátkej fotoperiódy (SP) na produkciu melatonínu: HIOMT riadi fotoperiodické zmeny v amplitúde vrcholu melatonínu u sibírskeho škrečka[1].
Zaujíma ma, aká intenzita svetla sa interpretuje ako začiatok a koniec svetlo-tmavej fotoperiódy.
Odkazovaný článok naznačuje, že zvieratá boli držané v klietkach s vopred nastaveným trvaním fotoperiódy, to mi pripadá, ako keby sa to robilo vo vnútri. Ak sa to robilo v interiéri, potom išlo o umelé osvetlenie a hádal by som, že to bola skôr záležitosť zapnutia a vypnutia, než postupná zmena alebo skoky v intenzite.
Dôvod, prečo sa pýtam, je ten, že sa snažím porozumieť dôsledkom tohto článku na ľudí, ktorí sa môžu zobudiť pred svitaním a stráviť nejaký čas pod umelé osvetlenie rôznej intenzity pred východom slnka a fungovať aj po západe slnka. Osoba sa môže napríklad pozerať na televízor alebo monitor a ja by som chcel získať predstavu, či táto „prítomnosť svetla“ stačí na spustenie zmien v mozgu súvisiacich s fotoperiódou. Existuje nejaká „kritická“ hustota (alebo hustota pri špecifickej vlnovej dĺžke) svetla, ktorá signalizuje začiatok/koniec fotoperiódy?
- Ribelayga C, Pévet O, Simonneaux V. 2000. HIOMT poháňa fotoperiodické zmeny v amplitúde vrcholu melatonínu sibírskeho škrečka. Regulačná, integračná a porovnávacia fyziológia, 278(5), R1339-R1345.
V skutočnosti nejde o špecifickú intenzitu svetla, ktorú organizmus bude interpretovať ako začiatok fotoperiódy. Maynard Johnson v roku 1939 uviedol, že intenzita použitého svetla mala vplyv na rýchlosť, ktorou myši menia svoj cirkadiánny rytmus. Jasnejšie svetlo má teda silnejší účinok, ale nie je tu žiadny medzný bod, o ktorom som si vedomý. Johnson používal osvetlenie tak nízke ako 2,5 stopové sviečky, čo je dosť slabé. Aschoff a Pittendrigh urobili v 50. a 60. rokoch viac práce na intenzite svetla, ale myslím si, že nikto nikdy nenašiel niečo, čo by sa podobalo hraničnému bodu, iba mieru, do akej mala intenzita vplyv.
Počítačové monitory sú veľmi svetlé. Hodnotenie jasu je typicky 250-350 cd/m2, čo je v porovnaní s Maynardovým experimentom ekvivalentom 23-32 nožných sviečok. http://computer.howstuffworks.com/monitor6.htm
Johnson, Maynard S. "Vplyv nepretržitého svetla na periodickú spontánnu aktivitu bielych myší (Peromyscus)." Journal of Experimental Zoology 82.2 (1939): 315-328.
Svetlý a tmavý cyklus
Cykly svetla a tmy regulujú cyklus spánku a bdenia z veľkej časti prostredníctvom ich účinku na syntézu a uvoľňovanie epifýzy. melatonín (N.-acetyl-5-metoxytryptamín). Epifýza syntetizuje melatonín, čo je indolamín, nasledujúcim spôsobom:
Tma podporuje syntézu melatonínu a spúšťa jeho uvoľnenie do plazmy. Koncentrácie melatonínu teda v noci stúpajú. Podobne, pretože prirodzené aj umelé svetlo potláča syntézu a uvoľňovanie melatonínu, jeho koncentrácia počas denného svetla klesá. Cykly spánku a bdenia u adolescentov a tínedžerov však vykazujú variáciu tohto vzoru. Hladiny melatonínu v nich stúpajú a klesajú neskôr ako v cykloch dospelých. Tento posun je v súlade s ich tendenciou zostať hore do skorého rána a zostať spať až do neskorého rána. Niekoľko štúdií naznačilo, že dospievajúci môžu prejaviť väčšiu bdelosť a lepšiu náladu po oneskorení začiatku školského dňa.
Vzťah intenzity svetla a fotoperiódy k cirkulárnej rytmizite u zimujúceho sysľa, Citellus lateralis
Voľne prebiehajúce kruhové rytmy hibernátora, Citellus lateralis, boli študované takmer 4 roky vo vzťahu k intenzite svetla a fotoperióde. Zvieratá boli držané pri konštantnej teplote 3 ° C, ale za rôznych svetelných podmienok od konštantného svetla pri 500 lx do úplnej tmy.
Zistilo sa, že cirkulačné obdobie je prakticky vždy kratšie ako 365 dní (v priemere asi 300 dní), ale toto svetlo neovplyvňuje voľne plynúce obdobie a nezdá sa, že by pôsobilo ako zeitgeber. O význame tohto sa diskutuje.
Tiež sú diskutované variácie normálneho fyziologického správania.
Mení svetelné znečistenie dĺžku dňa? Test s použitím svetelných záznamníkov na voľne sa pasúcich európskych kosoch (Turdus merula)
Umelé svetlo v noci je jednou z najzjavnejších environmentálnych zmien sprevádzajúcich zmenu antropogénneho biotopu. Globálny nárast svetelného znečistenia predstavuje pre voľne žijúce druhy nové výzvy, ale stále máme obmedzené chápanie časového a priestorového usporiadania svetla v noci. Najmä niekoľko štúdií naznačilo, že zvieratá vystavené svetelnému znečisteniu, ako sú spevavé vtáky, vnímajú dlhšiu dĺžku dňa v porovnaní s príbuznými žijúcimi v prirodzených tmavších oblastiach, ale priame testy takejto hypotézy stále chýbajú. Tu používame kombináciu zapisovačov svetla nasadených na jednotlivých európskych kosách, ako aj automatizovanú rádiotelometriu, aby sme zistili, či sú mestské vtáky vystavené dlhšej dĺžke dňa ako lesné náprotivky. Najprv sme použili údaje o aktivite lesných vtákov na určenie úrovne intenzity svetla, ktorá definuje začiatok a posun dennej aktivity vo vidieckych oblastiach. Túto hodnotu sme potom použili ako prahovú hodnotu na výpočet subjektívne vnímanej dĺžky dňa lesných a mestských kosov. V marci, keď dochádza k reprodukčnému rastu, boli mestské vtáky vystavené v priemere o 49 minút dlhšej subjektívnej vnímanej dĺžke dňa ako lesné, čo zodpovedá 19-dňovému rozdielu vo fotoperióde v tomto ročnom období. V teréne mestské kosy dosiahli reprodukčnú zrelosť o 19 dní skôr ako vidiecke vtáky, čo naznačuje, že za väčšinu rozdielov v reprodukčnom načasovaní medzi mestskými a vidieckymi obyvateľmi môže svetelné znečistenie. Došli sme k záveru, že svetlo v noci je najrelevantnejšou zmenou okolitého svetla, ktorá ovplyvňuje biologické rytmy obyvateľov vtákov v mestách, pravdepodobne prostredníctvom úpravy vnímanej fotoperiódy.
1. Úvod
Začiatok vedeckých štúdií o ekologických účinkoch svetelného znečistenia sa datuje takmer 80 rokov, keď britský fyziológ William Rowan publikoval článok v Príroda ktorá skúmala potenciálne účinky umelého osvetlenia na sezónnu reprodukciu škorcov (Sturnus vulgaris) [1]. Odvtedy sú nové štúdie na túto tému riedke a väčšinou sa zameriavajú na okamžité účinky umelých svetiel na úmrtnosť [2–4]. V poslednom desaťročí však došlo k obnovenému záujmu o túto tému, ktorý bol vyvolaný prehľadom oblasti výskumu, ktorá pritiahla medzinárodnú vedeckú pozornosť [5]. Teraz, presne o 10 rokov neskôr, toto aktuálne špeciálne vydanie zdôrazňuje a sumarizuje to, čo sa dosiahlo za posledných 10 rokov. Posun od korelačných údajov k experimentálnym dôkazom vnímame ako jeden z hlavných nedávnych pokrokov v našej oblasti [6–8]. Napriek množiacim sa štúdiám o ekologických účinkoch umelých svetiel však stále existujú len obmedzené znalosti o úrovni intenzity svetla, ktorému sú voľne žijúce organizmy vystavené, ako aj o vzoroch expozície a ich variáciách v čase a priestore. Pomocou svetelných loggerov nasadených na jednotlivé vtáky sme už predtým ukázali, že priemerná intenzita svetla, ktorej je vták vystavený v noci, je dobrým prediktorom jeho denného načasovania aktivity [9]. Stále však máme obmedzené pochopenie toho, či zvieratá žijúce v prostredí znečistenom svetlom vnímajú zmenenú dĺžku dňa v porovnaní s náprotivkami, ktoré prosperujú v prírodných ekosystémoch.
Prečo je pochopenie expozície voči dĺžke dňa také dôležité? Fotoperióda, t. j. svetelný zlomok 24-hodinového dňa, je najpredvídateľnejším približným signálom, ktorý organizmy používajú na načasovanie svojej dennej a sezónnej biológie [10]. Dokonca aj v tropickom prostredí, kde sa v priebehu roka vyskytujú iba malé odchýlky v dĺžke dňa, sú zvieratá stále schopné použiť tieto informácie na doladenie udalostí svojej životnej histórie [11]. Okrem toho je fotoperióda najúčinnejším synchronizátorom cirkadiánnych rytmov, endogénnym mechanizmom, ktorý si väčšina organizmov vyvinula na synchronizáciu svojich denných a ročných udalostí s vonkajším prostredím, a tak maximalizovala svoju kondíciu [10]. Vzťah medzi dĺžkou dňa, cirkadiánnymi rytmami a denným, ako aj sezónnym správaním, bol skúmaný u niekoľkých druhov v celom rade taxónov, od baktérií po ľudí [10]. V posledných rokoch je zrejmé, že svetelné znečistenie predstavuje nové výzvy pre ekologické systémy, ako aj pre ľudské zdravie a spoločnosť [12–14]. Keď sa zameriame na účinky zmeny antropogénneho biotopu na svetelné prostredie, tvrdíme, že druhé možno modifikovať dvoma spôsobmi. Prvým je zvýšenie intenzity svetla počas noci pomocou umelého osvetlenia. To je to, čo zvyčajne definujeme ako „svetelné znečistenie“, najštudovanejšiu zmenu svetelnej krajiny, o ktorej sa predpokladá, že predlžuje dĺžku dňa, a tým denne zvyšuje čas, ktorý majú druhy k dispozícii na kŕmenie, párenie a pohyb. Najlepším príkladom je skorší nástup spevu za úsvitu vyjadrený mnohými druhmi spevavých vtákov, ktorý bol naznačený tak, aby poskytoval adaptívnu reprodukčnú hodnotu [15]. Po druhé, navrhujeme, že zmena antropogénneho biotopu, a najmä urbanizácia, môže zmeniť svetelné prostredie aj počas dňa, pretože dramaticky ovplyvňuje krajinu nahradením prirodzeného prostredia umelými budovami a štruktúrami. Najmä odlesňovanie je jednou z najzreteľnejších zmien krajiny, ktorá predchádza rozrastaniu miest [16]. Pretože intenzita svetla v lesných oblastiach je zvyčajne nižšia ako v okolitých, otvorenejších oblastiach, predpokladáme, že denná intenzita svetla by bola v mestských oblastiach vyššia ako v blízkosti zalesnených oblastí. To by mohlo mať dôležité dôsledky z hľadiska dennej aj sezónnej organizácie aktivít, pretože sa navrhovalo, aby zníženú intenzitu svetla počas dňa vtáky interpretovali ako kratšiu dĺžku dňa, nezávisle od skutočnej fotoperiódy, ktorej boli vtáky vystavené [17].
Cieľom našej štúdie bolo objasniť, či sú voľne žijúce vtáky obývajúce mesto vystavené inej „subjektívnej dĺžke dňa“ ako lesné špecifiká. Ako subjektívnu dĺžku dňa sme definovali svetelný zlomok 24-hodinového dňa, ktorému je jednotlivý vták vystavený vo svojom prirodzenom prostredí. U jednotlivcov, ktorí žijú v tej istej oblasti, sa to môže značne líšiť, pretože malé rozdiely v mikrohabitate, ktorý vták zaberá, alebo v jeho schopnosti/vôli uniknúť zo svetlo znečistených oblastí, môžu mať za následok výrazné rozdiely vo vnímanej subjektívnej dĺžke dňa. Subjektívna dĺžka dňa sa navyše nemusí vždy zhodovať s pozorovanými modelmi aktivity zvieraťa. Napríklad v mestskej oblasti môže byť svetlo (aspoň s nízkou intenzitou) vždy prítomné, hoci sa z neho zvieratá môžu pokúsiť uniknúť. Otázkou je, ako dlho sú zvieratá vystavené intenzite svetla, ktorá je nad prirodzene sa vyskytujúcou intenzitou svetla v noci (úplný mesačný svit). Ak je toto časové obdobie dlhšie, ako je definované východom a západom slnka, je pravdepodobné, že mestské vtáky sú vystavené dlhšej dĺžke dňa ako lesné druhy. Na preskúmanie tejto možnosti sme použili európskeho kosa (Turdus merula) ako náš študijný druh, pre ktorý je už k dispozícii rozsiahle množstvo publikovaných údajov v kontexte urbanizácie [18], svetelného znečistenia [19] a denných [20], ako aj sezónnych rytmov [21]. V nedávnej štúdii sme skúmali vzťah medzi vystavením svetlu v noci a dennými vzormi aktivity pomocou svetelných záznamníkov pripojených k jednotlivým vtákom v meste Mníchov v Nemecku a v neďalekom chránenom lese [9]. Predstavujeme novú analýzu toho istého súboru údajov na testovanie dvoch konkrétnych hypotéz, ktoré sme predtým neskúmali. Po prvé, predpokladali sme, že umelé svetlá nielen zvyšujú priemernú intenzitu nočného svetla, ale zvieratá vystavené umelému svetlu v noci zažívajú v porovnaní s druhmi žijúcimi v prirodzených prostrediach dlhšiu subjektívnu dĺžku dňa. Na otestovanie tejto hypotézy sme najskôr získali údaje o rádiovom sledovaní od lesných vtákov, aby sme zhodnotili intenzitu svetla, pri ktorej tieto vtáky ráno začali svoju činnosť a večer ju ukončili. Tieto informácie sme potom použili na určenie času, v ktorom intenzita svetla prekročila tento prah ráno a večer pre mestské aj vidiecke vtáky. Nakoniec sme porovnali množstvo času medzi ranným a večerným prahom, aby sme odhadli subjektívnu dĺžku dňa, ktorej boli vystavené mestské a vidiecke kosy. Po druhé, predpokladali sme, že množstvo denného svetla, ktorému sú vtáky vystavené, by sa líšilo pre mestské a vidiecke jedince. Konkrétne sme predpovedali, že vtáky prosperujúce v obchodnej štvrti metropolitných oblastí, kde vysoké budovy zasahujú do prieniku svetla, budú vystavené nižšej intenzite denného svetla v porovnaní s chovom vtákov vo veľkých otvorených mestských parkoch, ale budú vyššie v porovnaní s lesným vtáctvom. . Predpokladali sme, že testovanie týchto dvoch vzájomne sa nevylučujúcich hypotéz objasní mechanizmy, ktorými môžu umelé svetlá ovplyvniť vnímanie dĺžky dňa u zvierat žijúcich v mestách, ako sú spevavé vtáky, čím sa upravia ich denné a sezónne rytmy.
2. Materiál a metódy
A) Etické vyhlásenie
Všetky experimentálne postupy sa uskutočnili v súlade s predpismi regionálneho výboru pre výskum zvierat (Regierung von Oberbayern, Mníchov, Bavorsko povolenie č. 55.1-8642.3-17-2008). Údaje uvedené v tomto rukopise už boli analyzované pre nedávnu štúdiu Dominoni a kol. [9]. Ide o časové rady lokomotorickej aktivity zaznamenané rádiotelometriou (§2c) a údaje o intenzite svetla zaznamenané pomocou zapisovačov svetla umiestnených na jednotlivých vtákoch (§2d). Pretože boli tieto údaje bežne zaznamenávané 2 minúty po dobu niekoľkých dní, sú neuveriteľným zdrojom informácií, ktoré je možné analyzovať rôznymi spôsobmi na zodpovedanie rôznych otázok. V predchádzajúcej štúdii sme korelovali čas nástupu a ofsetu aktivity s priemernou intenzitou svetla počas skutočnej noci (od 22:00 do 03:00), s výnimkou fáz súmraku, ako meradlo nočného svetelného prostredia na území vtáka. V tomto rukopise sme však chceli odhadnúť subjektívne vnímanú dĺžku dňa pre každého jednotlivého vtáka. Používame teda údaje, ktoré sme v predchádzajúcej analýze neskúmali, teda fázy súmraku.
B) Študijné populácie, odchyt a označovanie
Populácie štúdie európskeho kosa sa nachádzali v meste Mníchov na juhovýchode Nemecka (48 ° 07 ′ s. Š., 11 ° 34 ′ v. 518 mnm) a vo vidieckom lese pri dedine Raisting (47 ° 53 ′ s. Š., 11 ° 04 ′ vd, 553 m n. M.), 40 km juhozápadne od Mníchova. Z vtákov v meste boli odobraté vzorky z dvoch rôznych typov biotopov: i) „mestský park“: veľké mestské parky (25–30 ha) s vysokým porastom stromov a kríkov mimo centra mesta (Alter Südfriedhof a park Olympia) a ii) „obchodná štvrť“: stredne malé zelené plochy (1 – 4 ha) na okraji starého mesta (Alter Botanischer Garten a Maximilian Platz), s malým porastom stromov a vyššou hustotou ľudí. Vidiecke obyvateľstvo obývalo mierny zmiešaný listnatý les s jelšou (Alnus spp.) a smreky (Picea spp.) ako dominantné druhy.
Odchytili sme 100 kosov v troch po sebe nasledujúcich rokoch (2009, 2010, 2011) hmlou za úsvitu a bez použitia playbackov. Presné dátumy boli: 25. marca až 1. júla 2009 1. marca až 15. júna 2010 22. februára až 25. júna 2011. Vtáky boli označené batohom obsahujúcim rádiový vysielač a zapisovač svetla a potom boli okamžite prepustené na ich územie. Batoh sme pripevnili pomocou gumičky potiahnutej bavlnou. Vždy, keď to bolo možné, sme vtáky po dvoch týždňoch nahrávania odchytili, sňali batoh a vypustili vtáka. Celkovo sa nám podarilo zachytiť 50% (n = 50) vtákov. Mohli sme získať údaje od 32 svetelných drevorubačov a konečná veľkosť vzorky bola: vidiecky les n = 9 mestský park n = 11 obchodná štvrť n = 12. Ako upozornenie, celková hmotnosť batohu bola 4,8 g, čo predstavuje približne 5% telesnej hmotnosti kosov (90–100 g). V prípade, že bol označený veľmi ľahký jedinec, batoh presahoval 5% jeho telesnej hmotnosti. Nemáme však žiadny dôkaz o tom, že by vtáky uhynuli kvôli batohu, a napriek tomu, že sa nám nepodarilo odchytiť všetky vtáky, v nasledujúcich rokoch sme niekoľko z nich znova videli. Všetci stratili batoh.
C) Meranie vzorov činnosti pomocou rádiotelometrie
Rádiové vysielače (Sparrow Systems, USA, v rokoch 2009 a 2010, hmotnosť = 1,8 g Holohil Systems, Kanada, v roku 2011, hmotnosť = 1,8 g) boli použité v kombinácii s automatizovanými záznamovými jednotkami (ARU, Sparrow Systems, USA) na vyvodenie aktivity. štát. ARU bola umiestnená blízko územia vtáka a napojená na H-anténu (Sparrow Systems, USA). Jednotka bola naprogramovaná tak, aby každú minútu skenovala zodpovedajúcu frekvenciu každého vtáka a zaznamenávala silu signálu vysielača. V Mníchove sme použili štyri ARU, jednu v každej zo štyroch lokalít, pretože tieto oblasti boli relatívne malé a s malými fyzickými prekážkami, preto sme boli schopní zachytiť kvalitné rádiové signály od všetkých vtákov. V lese sme použili dve ARU, ktoré sme každé dva týždne presúvali z jedného vtáčieho územia na druhé. Pretože pohybujúci sa jedinci vykazujú viac variácií v sile signálu ako nepohybujúce sa (pokojové) [22], použili sme zmenu sily signálu v priebehu času na detekciu prepínačov v stave aktivity. Konkrétne sme použili analýzu bodov zmeny správania [23] na vyvodenie zmien v stave aktivity ráno a večer, to znamená začiatok a koniec dennej aktivity každého jednotlivého vtáka. Predpokladali sme, že zmena sily signálu pochádza z dvoch rôznych distribúcií, jednej pre aktívny a jednej pre neaktívny stav. Všetkým časovým bodom boli priradené informačné kritériá Akaike (AIC) ako miera toho, ako rozdielne boli odchýlky 2 hodiny pred a 2 hodiny po každom časovom bode. Špecifický čas, ktorý produkoval najnižšiu hodnotu AIC ráno a večer, bol identifikovaný ako nástup/zastavenie aktivity. Túto techniku sme už použili na rovnakom súbore údajov a výsledky sme publikovali v predchádzajúcom rukopise od Dominoniho a kol. [9], a údaje sú verejne dostupné (http://doi.org/10.5061/dryad.425rs).Tu sme použili tieto predtým publikované údaje na výpočet intenzity svetla, ktorej boli tieto vtáky vystavené, keď začali svoju činnosť ráno a keď prestali byť aktívne večer (pozri § 2e), ako miera prirodzeného „subjektívneho“ denná dĺžka alebo fotoperióda.
D) Meranie prirodzeného vystavenia svetlu v noci na voľne žijúcich vtákoch
Intenzitu svetla, ktorej sú vystavené voľne sa pohybujúce európske kosy, sme vypočítali pomocou mikro loggerov. V rokoch 2009 a 2010 sme nasadili komerčne dostupné ťažobné stroje (Sigma Delta Tech., Austrália, hmotnosť = 3 g). V roku 2011 sme prešli na záznamníky vyrobené na mieru vyrobené v spolupráci s katedrou elektroniky na Univerzite v Kostnici (Nemecko, hmotnosť = 3 g). Oba typy loggerov používali rovnakú fotodiódu (TSL 235, TAOS, USA) so spektrálnou citlivosťou v rozsahu od 300 do 1100 nm (vrchol pri 780 nm). Každý záznamník bol kalibrovaný počas ranného súmraku proti pyranometru (LI-1400 a LI-2100, LI-COR, USA), aby sa z hodnôt frekvencie vypočítala ožiarenosť (W m-²). Tieto kalibrácie boli vykonané vonku v oblastiach, kde neboli prítomné žiadne umelé zdroje svetla. Záznamníky zaznamenávali a ukladali intenzitu svetla každé 2 minúty. V tejto štúdii sme tieto údaje použili na dva hlavné ciele:
| Odhad | SE | df | t Hodnota | p Hodnota | |
|---|---|---|---|---|---|
| Zachytiť | 2.68 | 0.34 | 159 | −5.28 | <0,001*** |
| Dĺžka dňa | 0.09 | 0.02 | 158 | 3.73 | 0.001*** |
| ALAN | −1.96 | 0.53 | 157 | −3.65 | 0.001*** |
| Pokles nočnej teploty | −1.04 | 0.50 | 156 | −1.83 | 0.07 |
| Dĺžka dňa × ALAN | 0.09 | 0.03 | 155 | 2.84 | 0.005** |
| Dĺžka dňa × Pokles nočnej teploty | 0.05 | 0.03 | 154 | 1.41 | 0.16 |
| ALAN × Pokles nočnej teploty | 2.09 | 0.76 | 153 | 2.86 | 0.005** |
| Dĺžka dňa × ALAN × Pokles nočnej teploty | −0.12 | 0.05 | 152 | −2.63 | 0.009** |
Okrem toho parazitoidy, ktoré zažívali ALAN pri konštantnej teplote, zvýšili mieru parazitizmu v priemere o 26,5 na 100 vošiek počas krátkeho denného svetla. Tento účinok sa pri vysokom počte denných hodín znížil na priemerný nárast 10 na 100 vošiek, takže sklon vzťahu medzi dĺžkou dňa a rýchlosťou parazitovania bol v prítomnosti ALAN plytší (obrázok 1b). Tento účinok ALAN na mieru parazitizmu bol však slabší, ak bol spojený s poklesom nočnej teploty (obrázok 1c tabuľka 1).
3.2 Experiment 2: Vplyv dĺžky dňa na celoživotnú plodnosť
Dlhšia fotoperióda zvýšila celkovú plodnosť A. megourae, od 82 ± 36,66 SD úspešné parazitárne udalosti počas života parazitoida pri dĺžke dňa 12 hodín až 132,67 ± 55,84 pri dĺžke dňa 18 hodín (t28 = 3.5, p = 0,002 Obrázok 2b). Miera parazitizmu sa navyše znižovala s vekom z 0,23 ± 0,09 (12:12) a 0,41 ± 0,01 (18:06) v prvý deň na 0,05 ± 0,007 (12:12) a 0,05 ± 0,008 (18:06) v deň 7 (t40 = −7.3, p ≤ 0,001 Obrázok 2). Nezistila sa žiadna interakcia medzi fotoperiódou a parazitoidným vekom (χ 2 = 1.6, df = 1, p = 0, 2), čo ukazuje, že účinok dĺžky dňa bol konzistentný počas celého života parazitoidov, bez zjavných nákladov na zvýšenú reprodukciu v ranom veku na reprodukciu v neskorších štádiách. Tiež sa nezistil žiadny významný vplyv dennej liečby na prežitie parazitoidov (obrázok S1).
3.3 Vplyv miery parazitizmu na dynamické modely populácie
Pri nižších úrovniach miery parazitizmu väčšina simulácií ukazuje tlmené oscilácie vedúce k stabilnej rovnováhe, ale čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy sa zvyšuje s vyššou mierou napadnutia, zatiaľ čo podiel dosahujúci rovnováhu rýchlo klesá (obrázok 3a). Zameraním sa iba na tie súbory parametrov, kde sa dosahuje rovnováha, rovnovážna hustota parazitoida a najmä hostiteľa klesá so zvyšujúcou sa rýchlosťou útoku (obrázok 3b, c). V týchto scenároch sa rovnovážna hustota hostiteľa znižovala so zvyšujúcou sa rýchlosťou útoku. Zostávajúce simulácie nedosiahli rovnováhu, namiesto toho vykazovali neurčité široké fluktuácie, čo by v skutočnosti nepochybne viedlo k (miestnemu) vyhynutiu populácie.
Obsah
Fototaxia v zooplanktóne je dobre študovaná u morských annelidov Platynereis dumerilii:
Platynereis dumerilii larvy trochoforov a metatrochoforov sú pozitívne fototaktické. Fototaxia je sprostredkovaná jednoduchými očnými škvrnami, ktoré sa skladajú z pigmentovej bunky a bunky fotoreceptora. Bunka fotoreceptora sa synapsuje priamo na ciliárne bunky, ktoré sa používajú na plávanie. Očné škvrny nedávajú priestorové rozlíšenie, preto sa larvy otáčajú, aby skenovali svoje prostredie smerom, odkiaľ prichádza svetlo. [5]
Platynereis dumerilii larvy nectochaete môžu prepínať medzi pozitívnou a negatívnou fototaxiou. Fototaxiu tam sprostredkúvajú dva páry zložitejších pigmentových pohárikov. Tieto oči obsahujú viac fotoreceptorových buniek, ktoré sú zatienené pigmentovými bunkami tvoriacimi misku. Fotoreceptorové bunky nesynapujú priamo na riasinkové bunky alebo svalové bunky, ale na interneuróny spracovateľského centra. Týmto spôsobom je možné porovnať informácie o všetkých štyroch očných miskách a vytvoriť obraz so štyrmi pixelmi v nízkom rozlíšení, ktorý larvám povie, odkiaľ svetlo pochádza. Larva tak nemusí svoje prostredie skenovať otáčaním. [4] Toto je prispôsobenie na život na morskom dne. Životný štýl lariev nektochaete, pričom rotácia snímania je vhodnejšia na život v otvorenom vodnom stĺpci, životný štýl larvy trochofóra. Fototaxia v Platynereis dumerilii Larva nectochaete má široký spektrálny rozsah, ktorý je pokrytý aspoň tromi opsínmi, ktoré sú vyjadrené miskovitými očkami: [6] Dva rabdomérne opsíny [7] a Go-opsín. [6]
Nie každé správanie, ktoré vyzerá ako fototaxia, je však fototaxiou: Platynereis dumerilii larvy nechtochátu a metatrochoforu vyplávajú ako prvé, keď sú stimulované ultrafialovým svetlom zhora. Po chvíli však zmenia smer a vyhýbajú sa UV žiareniu tým, že plávajú dole. Vyzerá to ako zmena z pozitívnej na negatívnu fototaxiu (pozri video vľavo), ale larvy tiež plávajú, ak ultrafialové svetlo prichádza nesmerovo zboku. A tak neplávajú k svetlu alebo od neho, ale plávajú nadol, [3] to znamená do ťažiska. Ide teda o pozitívnu gravitaxiu indukovanú UV žiarením. Pozitívna fototaxia (plávanie k svetlu z povrchu) a pozitívna gravitaxia (plávanie do ťažiska) sú indukované rôznymi rozsahmi vlnových dĺžok a navzájom sa rušia v určitom pomere vlnových dĺžok. [3] Keďže zloženie vlnových dĺžok sa vo vode mení s hĺbkou: najskôr sa stratia krátke (UV, fialové) a dlhé (červené) vlnové dĺžky, [6] fototaxia a gravitaxia tvoria pomerovo-chromatický hĺbkomer, ktorý umožňuje larvám určiť ich hĺbka podľa farby okolitej vody. V porovnaní s hĺbkomerom na báze jasu to má tú výhodu, že farba zostáva takmer konštantná bez ohľadu na dennú dobu alebo či je zamračené. [8] [9]
Pozitívnu a negatívnu fototaxiu možno nájsť u niekoľkých druhov medúz, ako sú napríklad medúzy z rodu Polyorchis. Medúza používa ocelli na detekciu prítomnosti a neprítomnosti svetla, ktoré sa potom premieta do správania pred dravosťou v prípade vrhania tieňa na ocelli alebo do kŕmenia v prípade prítomnosti svetla. [10] Mnohé tropické medúzy majú symbiotický vzťah s fotosyntetickými zooxanthelami, ktoré uchovávajú vo svojich bunkách. [11] Zooxanthellae vyživujú medúzy, zatiaľ čo medúzy ich chránia a posúvajú ich smerom k zdrojom svetla, ako je slnko, aby maximalizovali ich svetelnú expozíciu pre efektívnu fotosyntézu. V tieni môžu medúzy buď zostať nehybné, alebo sa rýchlo odsťahovať v dávkach, aby sa vyhli predácii a tiež sa znova prispôsobiť novému zdroju svetla. [12]
Táto motorická reakcia na svetlo a neprítomnosť svetla je uľahčená chemickou reakciou z ocelili, ktorá má za následok motorickú reakciu, ktorá spôsobuje, že organizmus pláva smerom k zdroju svetla.[12]
Pozitívnu fototaxiu možno nájsť u mnohých lietajúcich druhov hmyzu, ako sú mory, kobylky a muchy. Drosophila melanogaster bol podrobne študovaný kvôli svojej vrodenej pozitívnej fototaktickej odozve na svetelné zdroje pomocou kontrolovaných experimentov, ktoré pomôžu pochopiť spojenie medzi vzdušnou lokomóciou smerom k svetelnému zdroju. [13] Táto vrodená reakcia je bežná medzi hmyzom, ktorý lieta predovšetkým v noci a využíva na orientáciu priečnu orientáciu oproti mesačnému svetlu. [14] Umelé osvetlenie v mestách a obývaných oblastiach má za následok výraznejšiu pozitívnu odozvu v porovnaní so vzdialeným svetlom Mesiaca, čo má za následok, že organizmus opakovane reaguje na tento nový nadprirodzený podnet a vrodene k nemu letí.
Dôkaz o vrodenej reakcii pozitívnej fototaxie v Drosophila melanogaster sa uskutočnila zmenou krídel niekoľkých individuálnych exemplárov, a to fyzicky (prostredníctvom odstránenia) a geneticky (prostredníctvom mutácie). V oboch prípadoch bol zrejmý nedostatok pozitívnej fototaxie, čo dokazuje, že lietanie smerom k svetelným zdrojom je vrodenou odpoveďou na fotoreceptory organizmov, ktoré dostávajú pozitívnu odpoveď. [13]
U lariev je možné pozorovať negatívnu fototaxiu drosophila melanogaster v prvých troch vývojových štádiách, napriek tomu, že dospelý hmyz vykazuje pozitívnu fototaxiu. [15] Toto správanie je bežné medzi inými druhmi hmyzu, ktoré majú vo svojich životných cykloch nelietavé larválne a dospelé štádium, pričom pri hľadaní miest zakuklenia prechádzajú na pozitívnu fototaxiu. Tenebrio molitor na porovnanie je jeden druh, ktorý prenáša svoju negatívnu fototaxiu do dospelosti. [15]
V experimentálnych podmienkach organizmy, ktoré používajú pozitívnu fototaxiu, tiež preukázali koreláciu so svetlým a magnetickým poľom. Za homogénnych svetelných podmienok s meniacim sa magnetickým poľom, Drosophila melanogaster larvy sa preorientujú na predpovedané smery väčšej alebo menšej intenzity svetla, ako to očakáva rotujúce magnetické pole. V úplnej tme sa larvy náhodne orientujú bez akejkoľvek pozoruhodnej preferencie. [15] To naznačuje, že larvy môžu pozorovať viditeľný vzor v kombinácii so svetlom.
Čo určuje predĺženie eukaryotickej translácie: nedávne molekulárne a kvantitatívne analýzy syntézy proteínov
Syntéza bielkovín z mRNA je energeticky náročný a prísne kontrolovaný bunkový proces. Predĺženie translácie je dobre koordinovaný, multifaktoriálny krok v translácii, ktorý podlieha dynamickej regulácii v dôsledku bunkového stavu a environmentálnych determinantov. Nedávne štúdie zahŕňajúce prístupy v celom genóme odhalili niektoré kľúčové aspekty predĺženia translácie vrátane samotnej mRNA a rodiaceho sa polypeptidového reťazca. Tieto štúdie navyše podporili kvantitatívne a matematické modelovanie predĺženia translácie. V tomto prehľade poskytujeme komplexný prehľad kľúčových determinantov predĺženia prekladu. Diskutujeme o dôsledkoch zastavenia alebo kolízie ribozómov a o tom, ako bunky v prípade takýchto udalostí regulujú transláciu. Ďalej skúmame teoretické prístupy a široko používané matematické modely, ktoré sa stali základnou zložkou interpretácie komplexných súborov molekulárnych údajov a kvantitatívneho skúmania dynamiky prekladu. Nakoniec skúmame nedávny pokrok v reportéri živých buniek a súvisiacich analytických technikách, aby sme monitorovali dynamiku translácie jednotlivých buniek a molekúl jednej mRNA v reálnom čase.
1. Úvod
Translácia genetickej informácie do funkčných bielkovín je základným procesom vo všetkých formách života a predstavuje kritický krok génovej expresie. Bunkám a tkanivám umožňuje udržiavať homeostázu a reagovať na vonkajšie signály a jej dysregulácia je základom mnohých chorôb. Napriek tomu, že je tento proces známy od päťdesiatych rokov minulého storočia, jeho experimentálne a analytické štúdie predstavujú dodnes veľké výzvy. V poslednej dobe príchod nových prístupov, najmä profilovania ribozómov (ribo-seq), poskytuje bezprecedentnú príležitosť monitorovať proces prekladu in vivo, ktoré poskytuje pohľad na rôzne kroky translácie v celom genóme a v kodónoch rozlíšených, ako aj identifikáciu ich hlavných determinantov a regulačných mechanizmov vo viacerých organizmoch. V tomto prehľade sa konkrétne zameriavame na poskytnutie prehľadu najnovších štúdií o mechanizme predĺženia translácie u cicavcov. Zameriame sa na aktívnu transláciu zrelej mRNA, a nie na priekopnícke cykly prekladu, ktoré sa môžu podstatne líšiť od ostatných neskorších kôl a boli zahrnuté v iných prehľadoch [1]. Tu uvedené výskumné práce prispievajú k zodpovedaniu niektorých dôležitých otázok týkajúcich sa predĺženia translácie: čo určuje čistú rýchlosť produkcie konkrétneho proteínu? Ako je táto rýchlosť regulovaná bunkou? Akými spôsobmi kodónová sekvencia ovplyvňuje alebo určuje rýchlosť iniciácie a predĺženia a v dôsledku toho syntézu proteínu?
Syntéza proteínov prebieha v štyroch hlavných krokoch: iniciácia, predĺženie, ukončenie a recyklácia ribozómov. Pri iniciácii translácie rôzne proteíny nazývané iniciačné faktory (eIF) uľahčujú správne zostavenie 40S a 60S ribozomálnych podjednotiek za vzniku komplexu 80S na štartovacom kodóne mRNA s iniciátorom metionyl-tRNA viazaným na miesto P [2]. V ďalšom kroku predlžovania translácie sa komplex 80S pohybuje pozdĺž mRNA, tri nukleotidy naraz, čím sa predlžuje kódovaný proteín, v koordinácii s rôznymi elongačnými faktormi (eEF) a aminoacyl-tRNA (aa-tRNA). Keď komplex 80S dosiahne terminačný kodón, použijú sa proteíny nazývané faktory uvoľňovania (eRF), ktoré uľahčujú uvoľnenie rodiaceho sa peptidu. Nakoniec sú post-terminačné ribozómy rozdelené na 40S a 60S podjednotky, aby sa začalo nové kolo prekladu.
Predĺženie translácie je komplexný proces, ktorý si vyžaduje koordinované fungovanie mnohých zložiek, ako je mRNA templát, tRNA, ribozómy a mnoho trans-pôsobiacich faktorov a regulátorov. Skoršie metódy štúdia translácie zahŕňali meranie výstupu proteínu alebo inkorporácie aminokyselín, napríklad pomocou prístupov pulznej chase. Polyzómové profilovanie sa použilo ako „zlatý štandard“ na posúdenie globálneho stavu translácie ribozómov na transkriptoch, pretože to oddeľuje mRNA na základe počtu asociovaných ribozómov na gradiente hustoty sacharózy [3]. Nedávno rôzne reportérske testy odhalili určité kľúčové faktory zahrnuté v translácii, vrátane dynamickej povahy procesu, ale tieto prístupy sa obmedzujú na analýzu konkrétnych cieľov, spravidla pomocou transgénov [4–6]. Ribo-seq, napriek svojmu inherentnému snímku a hromadnému priemerovaniu, sa ukázal ako silný nástroj na získanie translačných analýz v celom genóme meraním pozícií translačných ribozómov pri rozlíšení nukleotidov. Jeho zavedenie pripravilo cestu pre množstvo experimentov, modelov a analýz vo viacerých organizmoch zameraných na identifikáciu determinantov translačnej regulácie [7]. Konkrétne odhalil vlastnosti mRNA, ako je použitie kodónov, kodónový kontext, sekundárne štruktúry a aminokyselinové sekvencie ako modulátory rýchlosti predĺženia translácie [8,9].
V kombinácii s teoretickým modelovaním a simuláciami údaje ribo-seq ukázali, že iniciácia je hlavným krokom obmedzujúcim rýchlosť translácie v kvasinkách za normálnych podmienok [10,11]. V prípade bunkového stresu alebo choroby je globálna translácia potlačená vypnutím iniciácie závislej od čiapky, zatiaľ čo selektívna translácia je dosiahnutá iniciáciou nezávislou od čiapky [12]. Okrem zahájenia nedávne štúdie posunu paradigmy pomocou ribo-seq v kombinácii s inými prístupmi [13] zdôraznili dôležitosť predĺženia translácie pri syntéze bielkovín. Ale ribo-seq nemôže poskytnúť informácie o heterogenite na úrovni jednej molekuly. Navyše, keďže je statický (meranie jedného časového bodu), môže iba čiastočne a/alebo nepriamo odhaliť dynamické aspekty procesu, pokiaľ nie je kombinovaný s inhibítormi, ako sú harringtonínové a pulzné chase experimenty.
Je známe, že post-transkripčné modifikácie, ako je metylácia mRNA, modulujú transláciu. Proteíny YTHDF1 a METTL3 asociované s m6A zvyšujú účinnosť translácie náborom iniciačných faktorov translácie do mRNA [14,15]. Štúdie používajúce prokaryotické systémy ukázali, že táto modifikácia tiež ovplyvňuje dynamiku predĺženia translácie. Ukázalo sa tiež, že sekundárna štruktúra mRNA ovplyvňuje výstup translácie. Bolo pozorované, že zahrnutie modifikovaných nukleotidov spôsobilo štrukturálne zmeny mRNA, ktoré zase viedli k zmenám v expresii proteínu [16]. Ukázalo sa, že 5'-vedúce sekvencie so redukovanými sekundárnymi štruktúrami podliehajú efektívnej translácii a reportérové testy vykazovali zvýšenú produkciu proteínov z CDS so sekundárnymi štruktúrami. Účinok sekundárnej štruktúry mRNA na transláciu je však stále málo pochopený a vyžaduje si rozsiahlejšie štúdie.
V tomto prehľade najskôr prediskutujeme hlavné determinanty rýchlosti predĺženia translácie (obrázok 2a) a ako zmeny v týchto faktoroch počas stresu a chorôb vyvolávajú špecifické bunkové reakcie. V nadväznosti na to preskúmame funkcie vedúce k zrážkam ribozómov alebo k zastaveniu a evolučne konzervovaným mechanizmom na uľahčenie predĺženia a prevenciu (faktory ako eIF5A) alebo odstránenie týchto udalostí (kontrola kvality ribozómov, RQC). Predstavíme nedávne pokroky v matematických a výpočtových modeloch prekladu a ich význam pre analýzu reportérových dát translácie ribo-seq a jednej molekuly. Predovšetkým sa zameriame na široko používanú triedu modelov na štúdium dynamických vlastností prekladu známych ako proces úplne asymetrického vylúčenia (TASEP) a jeho variantov. V súčasnosti sa veľká väčšina týchto teoretických a výpočtových prístupov použila v kvasinkách, ale pravdepodobne v blízkej budúcnosti odhalia nové poznatky o dynamike translácie vo vyšších eukaryotoch vrátane ľudí. Nakoniec popíšeme nedávny pokrok v jednomolekulových dynamických meraniach translácie na základe značkovania proteínov a fluorescenčného zobrazovania.
2. Hlavné determinanty predĺženia translácie
2.1. Vplyv nadbytku (aminoacyl-) tRNA na rýchlosť predĺženia translácie
Transferové RNA (tRNA) sú kľúčové molekuly translačného aparátu buniek, ktoré umožňujú dekódovanie kodónov na aminokyseliny. Majú unikátnu ďatelinovú sekundárnu štruktúru s tromi vlásenkovými slučkami. Jedna z týchto slučiek, nazývaná antikodónová slučka, rozpoznáva kodóny. D-slučka blízko 5'-konca tRNA má dihydrouridínovú bázu a TΨC-slučka blízko 3'-konca má sekvenciu tymín-pseudouridín-cytozínových báz. Akceptorové rameno na 3 'tRNA je miesto, kde je aminokyselina naviazaná enzýmami nazývanými aminoacyl-tRNA syntetáza (aaRS) [17] (obrázok 1). Rýchlosť, účinnosť a presnosť translácie sú skutočne silne ovplyvnené dostupnosťou aminoacyl-tRNA (aa-tRNA). Kvantifikácia hladín tRNA je notoricky náročná kvôli prítomnosti mnohých post-transkripčných modifikácií a sekundárnych štruktúr. Napriek tomu bolo vynaložené veľké úsilie na vytvorenie komplexného pohľadu na tRNA pooly. Najmä príchod vysoko výkonných metód na štúdium hladín tRNA poskytol lepšie pochopenie krajiny tRNA v bunkách za rôznych podmienok [18–22].
Obrázok 1. Štruktúra a aminoacylácia tRNA. Sekundárna štruktúra tRNA zobrazujúca rôzne domény a vlásenkové slučky: D-slučka s premenlivým obsahom dihydrouridínu antikodónová slučka, obsahujúca antikodónový triplet variabilná oblasť usporiadaná do kmeňovej slučky TψC-slučka so sekvenciou tymín-pseudouridín-cytozín, akceptorové rameno, 3'-koniec, na ktorom je aminokyselina konjugovaná/viazaná. D, dihydrouridín T, tymidín ψ, pseudouridín C, cytidín. tRNA podliehajú aminoacylácii pomocou enzýmov nazývaných aminoacyl-tRNA syntetázy počas translácie tRNA sa de-aminoacyluje a potom znova vstupuje do skupiny voľných tRNA, aby podstúpila ďalší aminoacylačný cyklus.
Prístup založený na mikročipoch ukázal, že zásoby tRNA sa medzi tkanivami u ľudí líšia [23] a že existuje významná korelácia medzi relatívnym výskytom tRNA a použitím kodónov vysoko exprimovaných, tkanivovo špecifických génov [23]. Boli pozorované rozdiely v zložení poolu tRNA medzi proliferujúcimi a diferencujúcimi sa bunkami [24], čo zodpovedá odlišným vzorcom využívania kodónov. Táto štúdia odhalila, že takáto koordinácia medzi použitím tRNA a kodónov môže byť spôsobená modifikáciami histónu okolo génov tRNA. Existencia odlišných skupín tRNA počas rôznych fáz bunkového cyklu bola nedávno potvrdená in vitro, popri rozdieloch v použití kodónov, najmä v bunkách vo fázach G1 a G2/M [25]. Táto štúdia navyše odhalila, že počas proliferácie je translácia mRNA obohatená o vzácne kodóny zvýšená a že tento nárast rýchlosti dekódovania vzácnych kodónov možno pripísať zvýšeniu dostupnosti tRNA pripravených na transláciu, tj. tRNA [25]. Nedávna správa z nášho laboratória tiež naznačuje, že existuje významná korelácia medzi použitím kodónov a dostupnosťou tRNA v tkanivách myšej pečene [18]. Celkovo vzaté, objavujúce sa dôkazy poukazujú na to, že krajina tRNA sa medzi bunkovými stavmi líši, čo zase vedie k špecifickosti génovej expresie zmenou parametrov predĺženia translácie.
2.2. modifikácie tRNA
tRNA sú jedinečné molekuly známe svojimi bohatými modifikáciami [26]. Je známe, že tieto modifikácie ovplyvňujú ich funkciu a štruktúru [27]. Napríklad boli zdôraznené dôsledky týchto modifikácií a ich komplexná povaha, keď modifikácie mRNA kvasiniek a ľudských buniek m1A58 tRNA vykazovali rôzne funkcie. Ukázalo sa, že ovplyvňuje stabilitu a dozrievanie iniciátora-tRNA met v kvasinkách, zatiaľ čo v ľudských bunkách táto modifikácia okrem ovplyvnenia stability zmenila aj asociáciu tRNA s polyzómovými frakciami [28,29]. pseudoidylácia, ψ (pozícia 8), sprostredkovaná PUS7, ovplyvňuje všeobecnú iniciáciu translácie [30]. V skutočnosti sú fragmenty tRNA odvodené od 5'-konca ψ obsahujúce tRNA inhibujú komplex iniciácie translácie, ktorý môže naopak regulovať skorú embryogenézu [30].
V antikodónovej slučke bolo tiež identifikovaných niekoľko modifikácií, o ktorých je známe, že ovplyvňujú účinnosť dekódovania tRNA. Štúdia celého genómu využívajúca ribozómové profilovanie v kvasinkách a C. elegans ukázal, že strata modifikácií U34 v pozícii kolísania antikodónu vedie k pozastaveniu ribozómov a že strata týchto modifikácií vedie k defektom homeostázy proteínu, ktoré sú zachránené po nadmernej expresii hypomodifikovanej tRNA [31]. Modifikácie v antikodónovej slučke a okolo nej ovplyvňujú interakciu s príbuznými a blízko príbuznými kodónmi. Ukázalo sa, že ďalšia modifikácia, m5C38 sprostredkovaná DNMT2, ovplyvňuje presnosť translácie a táto modifikácia tiež chráni tRNA pred ribonukleázovou aktivitou [32]. Je zaujímavé, že sa ukázalo, že táto modifikácia m5C38 je závislá od modifikácie queuozínu (Q), ktorá sa vyskytuje v kývavej antikodónovej polohe tRNA pre aminokyseliny His, Asn, Tyr a Asp. Tieto dve modifikácie spolu regulujú rýchlosť translácie príbuzných a takmer príbuzných Q-dekódovaných kodónov a chránia tRNA pred ribonukleolytickým štiepením [33].
Modifikácie vo wobble polohe (pozícia 34) a bezprostrednej 3′-polohe antikodónu (pozícia 37) ovplyvňujú dekódovaciu funkciu tRNA ovplyvňujúcu presnosť a vernosť translácie [34]. Inozín v kolísavej polohe (I34) je výsledkom deaminácie adenozínu adenozíndeaminázou pôsobiacou na enzým transfer RNA (ADAT). Táto modifikácia I34 umožňuje rozpoznanie nukleotidov C, U a A na tretej pozícii kodónov, čo vedie k rozšírenej kapacite párovania báz prostredníctvom ne-Watson-Crickovho párovania báz [35]. Nedávna štúdia na kvasinkách ukázala, že modifikácia tRNA v antikodónovej slučke tiež hrá úlohu pri čítaní stop kodónov. V skutočnosti strata ψ35 a i6A37 modifikácie Tyr tRNA spôsobili zníženie účinnosti čítania bez ovplyvnenia dekódovania tyrozínových kodónov [36].
2.3. Páry použitia kodónov a kodónov
Synonymné kodóny sa používajú pri rôznych frekvenciách, čo je vlastnosť známa ako „zaujatosť voči využívaniu kodónov“. Obsah kodónov v translatóme je jedným z faktorov, ktoré prispievajú k veľkej variabilite a heterogenite závislej od kodónov v rýchlostiach predĺženia ribozómov. Nepriame odhady časov zotrvania ribozómov získané zo súborov údajov profilovania ribozómov z pečene kvasiniek a myší skutočne ukázali, že časy zotrvania ribozómov, teda čas strávený ribozómom na špecifickej pozícii v transkripte, sú silne špecifické pre kodóny [18,37, 38]. Návrh, že často používané kodóny sa prekladajú rýchlejšie, je v literatúre v mnohých organizmoch častý. Bolo navrhnuté, že odchýlka v použití kodónov môže byť spôsobená „mutáciou“ spôsobujúcou variácie medzi druhmi alebo „prirodzeným výberom“ na zlepšenie účinnosti translácie naprieč genómom, popísané v [39]. Nástup ribozómového profilovania odhalil rôzne zaujímavé aspekty použitia a translácie kodónov. Použitím údajov o ribozómovom profilovaní z kvasiniek sa ukázalo, že synonymné kodóny majú rôzne dekódovacie rýchlosti v závislosti od ich použitia [40]. Okrem toho bezbunkové translačné testy a profilovanie ribozómov v Neurospora ukázali, že využitie kodónov ovplyvňuje rýchlosť predĺženia a že existuje negatívna korelácia medzi obsadením ribozómov a použitím kodónov [41]. Aj keď existuje viac dôkazov o vzťahu medzi použitím kodónov a obsadením ribozómov v kvasinkách, podobný vzťah sa zrejme nenachádza vo vyšších eukaryotoch [42]. To sa tiež zopakovalo pomocou analýzy doby zdržania ribozómov na údajoch o profilovaní ribozómov [18]. Existovala silná korelácia medzi časom zotrvania a použitím kodónov v kvasinkových bunkách a nezdalo sa, že by tomu tak bolo u myší. Predchádzajúca správa však ukázala, že toto odpojenie možno vysvetliť mutačnými odchýlkami GC naprieč génmi [43].
Keď ribozóm prekladá mRNA, interaguje súčasne s viac ako jedným kodónom. Účinok priľahlého kodónu na predĺženie translácie v eukaryotoch bol prvýkrát ukázaný v kvasinkách [44]. Táto štúdia identifikovala 17 párov inhibičných kodónov, ktoré spomaľovali rýchlosť predĺženia. Väčšina týchto inhibičných kodónov zahŕňa párovanie zvlnených báz, čo vedie k slabému predĺženiu. Časy zotrvania mohli byť ovplyvnené pármi kodónov v tkanive pečene myši a zistilo sa, že časy zotrvania párov kodónov sú stabilné počas cyklu kŕmenia/hladovania [18]. Ďalším faktorom, ktorý ovplyvňuje rýchlosť predĺženia translácie, je zloženie aminokyselín syntetizovaného peptidu.Nedávna štúdia na kvasinkách v skutočnosti ukázala, že v dôsledku interakcií s ribozómovým výstupným tunelom sa negatívne nabité aminokyseliny prekladajú rýchlejšie ako kladne nabité a aminokyseliny s menšími bočnými reťazcami sú rýchlejšie ako aminokyseliny s väčšími bočnými reťazcami [ 11].
2.4. Nepriamy vplyv použitia kodónov na stabilitu mRNA
So stabilitou a obratom mRNA sú spojené rôzne faktory (prehľad v [45,46]). Tu zdôrazňujeme úlohu použitia kodónov - a tým aj translácie - pri regulácii stability mRNA. Včasný dôkaz vzťahu medzi použitím kodónov a stabilitou mRNA bol v kvasinkách ukázaný, keď úsek arginínových kodónov zlepšil rozpad mRNA spojený s polysómom [47], čo naznačuje spojenie medzi dynamikou translácie a stabilitou mRNA. Neskôr sa ukázalo, že stabilné transkripty sú viac spojené s optimálnymi kodónmi a substitúcia týchto kodónov za neoptimálne vedie k zníženiu stability mRNA [48].
Optimálne kodóny sú kodóny zodpovedajúce príbuzným druhom tRNA, ktoré sú hojnejšie a podliehajú rýchlejšej a efektívnejšej translácii. Ukázalo sa tiež, že optimalita kodónov ovplyvňuje rýchlosť ribozomálnej translokácie a tým aj účinnosť translácie [48]. Ďalšie štúdie, ktoré nasledovali, ukázali, že tento vzťah medzi použitím kodónov a stabilitou RNA je zachovaný vo vyšších organizmoch [49–53]. Tento vzťah medzi použitím kodónu transkriptu a stabilitou mRNA je definovaný mierou koeficientu stabilizácie kodónu (CSC). CSC je definovaný ako korelačný koeficient medzi frekvenciou výskytu každého kodónu v mRNA a polčasom mRNA [48]. Zistilo sa, že hodnoty CSC dobre korelujú s adaptačným indexom tRNA (tAI), čo je metrika ukazujúca, ako efektívne je kodón translatovaný v danej skupine tRNA [54].
Komplexná štúdia o CSC v kvasinkách ukázala, že sa našiel veľký podiel optimálnych kodónov pre gény kódujúce vysoko hojné proteíny. Okrem toho bola pozorovaná pozitívna korelácia medzi množstvom proteínov získaným zo štúdií proteomiky a hodnotami CSC [55]. Práca s použitím ľudských bunkových línií naznačuje, že kodóny súvisiace s nestabilitou mRNA majú významne dlhšie doby zdržania v mieste A ako v miestach P a E [52]. Je prekvapujúce, že táto súhra medzi predĺžením translácie a stabilitou mRNA mohla byť čiastočne regulovaná intracelulárnymi hladinami tRNA a aminokyselín [49].
2.5. Deregulácia predĺženia translácie počas stresu a choroby
Je známe, že bunky regulujú tRNA krajinu a využitie kodónov [21,24], pretože ich nerovnováha môže ovplyvniť účinnosť translácie a rýchlosť predlžovania [56], čo ohrozuje bunkovú homeostázu. Čo je dôležité, ukázalo sa, že optimalita kodónov hrá kľúčovú úlohu v bunkovom strese. Napríklad počas hladovania aminokyselín v bunkách HEK293T sa dosiahla selektívna translácia mRNA v dôsledku zmeny v globálnom používaní kodónov: účinnosť translácie mRNA obohatených o vzácne kodóny sa zvýšila spolu s obohatením o vzácne izoakceptory tRNA [57]. Optimálnosť kodónov a hladiny tRNA sú tiež silne zapojené do nádorov. Nedávna štúdia využívajúca výhody komplexnej databázy TCGA napríklad ukázala zmenenú krajinu tRNA v rôznych rakovinových tkanivách, spôsobenú predovšetkým stavom bunkovej proliferácie [58], ktorá je podobná predchádzajúcim pozorovaniam [24]. Nakoniec, nesprávna regulácia špecifických kodónov alebo aminokyselín je tiež spojená s rakovinou [58,59].
2.6. Vlastnosti kodónov ako determinanty zastavenia ribozómov
Ako je diskutované vyššie, doby zotrvania alebo rýchlosti predĺženia translačného ribozómu sa líšia pozdĺž mRNA. V závislosti od parametrov, ako je optimalita kodónu, účinnosť tvorby peptidovej väzby, dostupnosť elongačných faktorov alebo vlastnosti vznikajúceho reťazca, môžu mať ribozómy rôzne doby zotrvania. Niekedy je doba zdržania taká dlhá, že sa ribozóm počas predĺženia zastaví, čo je jav označovaný ako zastavenie ribozómov.
Aj keď v niektorých prípadoch môže byť zastavenie ribozómov regulačné, pretože bolo opísané, že podporuje správnu transláciu proteínov, skladanie, komplexné zostavovanie a zacielenie [60–62], nedávne štúdie začínajú odhaľovať osudy „neúmyselne“ zastavených ribozómov ako signály, ktoré upozorňujú na prítomnosť defektných mRNA alebo zmenených fyziologických stavov. Napriek tomu, že príčiny a osudy zastavených ribozómov ešte nie sú jasné, vznik techník, ktoré umožňujú zmapovať ribozomálne zastavovacie miesta [63,64], začal ilustrovať komplexný obraz, ktorý ukazuje obohatenie určitých motívov a odhaľuje niektoré faktory, ktoré sa zdajú byť podieľajú sa na regulácii zadržiavania.
Dobre preštudovaný príklad zastavenia ribozómov nastáva počas translácie poly-lyzínových stôp, najmä keď ribozómy chybne dosiahnu poly(A) chvost mRNA (obrázok 2a). Translácia poly(A) konca sa môže vyskytnúť v defektných mRNA, ktorým chýba stop kodón, alebo v prípadoch, keď ribozóm preskočí stop kodón. Dlho nebolo jasné, čo spustilo zastavenie prítomnosti lyzínových zvyškov v ribozomálnom výstupnom tuneli spôsobené dekódovaním lyzínového AAA kodónu alebo prítomnosť určitých proteínov viažucich RNA v poly(A) chvoste. Nedávna štúdia [65], ktorá vyriešila štruktúru ribozómu prekladajúceho poly (A) úsek, odhalila, že aditívnu úlohu zohráva jednak prítomnosť viacerých lyzínov interagujúcich s ribozomálnym výstupným tunelom, jednak následné preskupenie konformácie v dekódovacom centre. pri podpore zastavovania ribozómov v poly (A) motívoch, ako je poly (A) chvost. Dôležité je, že táto práca tiež ukázala požiadavku na aspoň 10 po sebe idúcich lyzínových zvyškov, pričom aspoň posledné dva sú kódované kodónom AAA, aby sa podporilo zastavenie, čo ukazuje selektivitu ribozómu na zastavenie v poly (A) chvostoch.
Obrázok 2. Faktory ovplyvňujúce predĺženie translácie a znaky mRNA spôsobujúce zastavenie a záchranné procesy ribozómov. (a) Zmeny v súboroch tRNA v dôsledku modifikácií alebo meniacich sa bunkových stavov vedú k zmenám v rýchlosti predĺženia translácie. Obmedzenie aminokyselín spôsobuje globálne alebo kodónovo špecifické účinky na úrovne translácie a rýchlosť predlžovania. Rodiace sa sekvencie reťazca, ako je veľkosť a náboj, modulujú predĺženie translácie. Poly(A) stopy v mRNA menia rýchlosť translokácie ribozómov spúšťajúc RQC dráhu, a tým znižujú čistý výstup proteínu. (b) K zaradeniu/zastaveniu ribozómu dochádza (i) keď sa ribozóm stretne s kodónmi Pro-Pro v sekvencii mRNA v miestach P: A, (ii) v dôsledku pomalého uvoľňovania ribozómov v stop kodóne mRNA, (iii) v dôsledku prítomnosť určitých kombinácií aminokyselín, ako je RxK, na miestach E: P: A alebo kyslých aminokyselín, ako sú D a E, na miestach P: A. Hypusinovaný eIF5A by však mohol zachrániť ribozómy zastavené pri motíve Pro-Pro. (c) Dráha RQC príde na záchranu, keď sa ribozómy zastavia v dôsledku defektných mRNA. Nedávno bolo identifikované, že EDF1 je spojený so zrazenými ribozómami, čo potom vedie k stabilizácii komplexu GIGYF2-EIF4E2 na týchto zastavených komplexoch, čím sa inhibuje ďalšia iniciácia translácie defektnej mRNA. Pri pretrvávajúcej kolízii ZNF598 ubikvitinuje podjednotku 40S, čím spúšťa dráhu RQC, kde je vznikajúci reťazec degradovaný a ribozómové podjednotky sú recyklované.
Ďalším spúšťačom zastavenia ribozómov je obmedzenie aminokyselín (obrázok 2a). Zatiaľ čo obmedzenie niektorých aminokyselín spôsobuje zastavenie ribozómov počas predlžovania, obmedzenie iných aminokyselín môže viesť ku globálnemu zastaveniu iniciácie translácie v dôsledku obmedzenej dostupnosti aa-tRNA. Toto bolo podrobne opísané pre arginín a leucín [66], kde strata nabíjania arginínovej tRNA viedla k zastaveniu ribozómu na dvoch zo šiestich arginínových kodónov, čo odráža nielen aminokyselinovo špecifický, ale aj kodónovo špecifický stagnujúci účinok pri predlžovaní. . Na druhej strane rovnaká práca ukázala, že vyčerpanie hladín leucínu je snímané osou mTORC1/GCN2, čo vedie k vypnutiu iniciácie translácie. Táto dôležitá práca preto odhalila alternatívne mechanizmy používané bunkami na reguláciu translácie v rôznych stavoch obmedzených na výživu, pričom uprednostňuje rozsiahle zastavenie translácie v prípade vyčerpania viac esenciálnych aminokyselín, ako je leucín, pričom uprednostňuje špecifickejšiu reguláciu v prípade vyčerpania aminokyseliny ako arginín. Je zaujímavé poznamenať, že účinky pozorované pre arginín boli špecifické pre kodóny, ukázalo sa, že táto špecifickosť odráža reguláciu na úrovni nabíjania rôznych izoakceptorových tRNA, pričom arginínové tRNA, ktoré dekódovali kodóny v mieste pauzy, vykazovali silnejšiu stratu nabíjania po obmedzenie arginínu.
V kvasinkových bunkách bol navyše pozorovaný ďalší spúšťač pre špecifické páry kodónov a bolo zistené, že 17 párov kodónov silne inhibuje transláciu spomalením predĺženia, čo je účinok, ktorý je tiež špecifický pre poradie kodónov v každom z týchto párov [44]. Nedávno podrobnejší popis účinku inhibičného páru odhalil, že tieto páry kodónov spôsobujú, že ribozóm sa zastaví s prázdnym miestom A, čo je spôsobené zmenou štruktúry mRNA vo vnútri dekódovacieho centra, čím sa vytvorí aberantná štruktúra, ktorá vylučuje Akomodácia tRNA v mieste A [67]. Zatiaľ nie je jasné, či je tento účinok inhibičného páru prítomný aj v cicavčích bunkách, avšak v tkanive cicavcov boli opísané rozdiely v rýchlosti predĺženia určitých párov kodónov [18].
Nedávne množstvo štúdií o zrážkach ribozómov založených na disome (alebo di-ribozómovom) sekvenovaní poskytlo nový pohľad na tieto miesta zrážok. Profilovanie mRNA čítaní chránených dvoma ribozómami, čo naznačuje kolízne udalosti, odhalilo frekvenčný a sekvenčný kontext týchto udalostí. Štúdia na kvasinkách naznačila, že tieto kolízne (alebo ribozómové fronty) udalosti, ktoré sú dôsledkom translačného pozastavenia, sú častejšie, ako sa pôvodne predpokladalo, pričom do kolízií je zapojených jeden až päť translačných ribozómov [68]. V myšej pečeni sa odhadovalo, že asi 10% ribozómov je v nepríjemnom stave [69]. Zistilo sa, že frekvencia týchto kolízií súvisí s translačným tokom (rýchlosť syntézy bielkovín). Okrem toho boli znaky kódovaných aminokyselín, vrátane náboja a štruktúry vznikajúceho polypeptidu, identifikované ako príčiny pauzy ribozómov [69–71]. Pomalé uvoľňovanie ribozómov v stop kodónoch tiež viedlo k zastaveniu ribozómov [70,71] (obrázok 2b). Nedávna štúdia sa zamerala na proteíny prijaté do kolidovaného ribozomálneho komplexu pomocou kombinácie profilovania polyzómov a kvantitatívnej proteomiky. EDF1 bol identifikovaný ako nový proteín viažuci sa na kolidované ribozómy. Tiež bolo pozorované, že EDF1 rekrutuje a stabilizuje komplex GIGYF2-EIF4E2 na mRNA, aby inhiboval ďalšiu iniciáciu translácie defektnej mRNA [72,73] (obrázok 2c).
3. Odstraňovanie dopravných zápch a kolízií ribozómov
3.1. eIF5A: kodónovo špecifický záchranca zastavenia ribozómov
Aby sa zabránilo nežiaducemu zastaveniu ribozómov, ktoré by mohlo byť škodlivé pre účinnosť translácie špecifických transkriptov a všeobecne pre proteostázu, bunky našli dômyselné mechanizmy. Jedným z príkladov je eukaryotický iniciačný faktor 5A (eIF5A (E) predĺženie (F) herec-P v prokaryotoch), o ktorom sa široko popísalo, že má dôležitú funkciu počas predĺženia translácie [63,74]. eIF5A, prvýkrát extrahovaný z králičieho retikulocytového lyzátu, bol identifikovaný ako translačný iniciačný faktor pomocou in vitro test, pretože uľahčuje tvorbu metionyl-puromycínu, ktorý predstavuje prvú tvorbu peptidovej väzby (prehľad v [75]). Neskoršie štúdie však ukázali, že má podstatnú úlohu v predĺžení translácie. Zistilo sa, že dve izoformy tohto proteínu sú exprimované v eukaryotoch, eIF5A1 a eIF5A2, z ktorých prvá je bežnejšia a exprimuje sa vo väčšine tkanív. Existujú tiež dôkazy naznačujúce zmenenú reguláciu týchto izoforiem pri rôznych rakovinách [76,77].
eIF5A je jediným proteínom v eukaryotickom proteóme, ktorý sa má identifikovať, aby podstúpil posttranslačnú modifikáciu známu ako hypusinácia [78] na lyzínovom zvyšku (Lys50 u ľudí a 51 u kvasiniek). Obe vyššie uvedené izoformy sú hypusinizované. Ide o dvojstupňový proces koordinovaný dvoma enzýmami nazývanými deoxyhypusín syntáza (DHS) a deoxyhypusínhydroxyláza (DOHH) [78]. Genetické a biochemické testy ukázali, že táto modifikácia hypusínu je dôležitá pre funkciu proteínu eIF5A.
Z predchádzajúcej práce v kvasinkách a zo štúdií funkčnej homológie s prokaryotickým EF-P bolo ukázané, že eIF5A má špecifickú úlohu v predĺžení polyprolínových motívov [79]. Keď je v proteíne prítomný polyprolínový úsek, mohlo by to spomaliť predĺženie v tomto konkrétnom motíve, čím by sa vytvoril ribozómový blok, kde by ribozóm s prolínom v P- a A-miestach mal voľné E-miesto. V tomto prípade je eIF5A schopný rozpoznať zastavenú konformáciu a vstúpiť do voľného E-miesta takým spôsobom, že hypusínový zvyšok dosiahne centrum peptidyl transferázy, stabilizuje prolíny a uľahčuje tvorbu peptidovej väzby [80] (obrázok 2b). Nedávno bola táto funkcia eIF5A v predĺžení potvrdená aj v cicavčích bunkách, kde deplécia alebo ablácia hypusinovaných hladín eIF5A viedla k zvýšenému zastaveniu špecifických ribozómov nielen na polyprolínoch, ale aj v niekoľkých ďalších motívoch, ktoré zahŕňali kodóny pre glycín, glutamát , aspartát, serín, lyzín a leucín, okrem iného [81].
Okrem toho dve nedávne nezávislé práce opätovne upravili úlohu eIF5A pri iniciácii translácie upstream otvoreného čítacieho rámca (uORF) obsahujúceho transkripty v mechanizme závislom od predĺženia [81,82]. V opísaných modeloch kódujúce sekvencie (CDS) uORF obsahujú cieľové motívy eIF5A, takže v prípade, že skenovací ribozóm iniciuje transláciu uORF, ribozóm sa v tomto motíve zastaví a potrebuje eIF5A na obnovenie translácie. Ak je prítomný eIF5A, translácia uORF sa obnoví a ostatné skenovacie ribozómy môžu začať transláciu v hlavnom ORF. V neprítomnosti eIF5A, zastavený ribozóm translujúci uORF vytvorí blokádu, ktorá zabráni iným skenovacím ribozómom iniciovať transláciu hlavného otvoreného čítacieho rámca (ORF), čo vedie k zníženiu expresie príslušného proteínu. Tento mechanizmus bol podrobne opísaný iba pre dva prepisy, azin1 a môj C, ale predpokladá sa, že by mohlo ísť o rozšírenejší jav [81,82].
Tieto práce tiež odhalili dôležitosť eIF5A pri regulácii udržiavania určitého stavu proteómu prostredníctvom regulácie predĺženia translácie. Ak eIF5A nie je aktívny, špecifické sady proteínov, najmä tie, ktoré sa týkajú tvorby extracelulárnej matrice, organizácie cytoskeletu a bunkovej proliferácie, sú downregulované [63]. Na druhej strane, v prípadoch, keď je eIF5A nadmerne exprimovaný, ako sa vyskytuje pri niekoľkých rakovinách [83–86], pri rovnakých podpisoch by sa zvýšila ich translačná účinnosť, čo by mohlo mať vplyv na progresiu rakoviny.
3.2. Degradácia RNA závislá od kontroly kvality ribozómu/optimálnosti kodónu
Opísali sme rôzne signály, ktoré môžu spôsobiť zastavenie ribozómu počas predĺženia translácie (krajiny tRNA, translácia poly (A) chvosta, narušené kofaktory predĺženia, ako je eIF5A, skrátené alebo defektné mRNA). Ak sa zablokovanie nevyrieši včas, zadný translačný ribozóm sa zrazí s vedúcim/zaseknutým ribozómom. Tento druh kolízie môže mať za následok skoré uvoľnenie skrátených polypeptidov, ktoré má škodlivé účinky na bunky. Pred desiatimi rokmi začala semenná práca [87] vrhať svetlo na komplexnú dráhu kontroly kvality, ktorá je schopná vnímať zrazené ribozómy, zamerať sa na rodiace sa proteíny a mRNA na degradáciu a recyklovať ribozomálne podjednotky. Táto cesta sa nazýva RQC. Dôležitosť RQC je odhalená jeho zachovaním počas vývoja. Čoskoro po počiatočnej práci, ktorá podrobne opísala niekoľko krokov RQC dráhy v kvasinkových bunkách, sa komponenty a mechanizmy tejto dráhy začali odhaľovať aj v cicavčích bunkách [88–93].
Prvým krokom v RQC je snímanie zrazených ribozómov a existuje niekoľko mechanizmov snímania, ktoré zaisťujú účinné rozpoznanie rôznych typov defektnej translácie. V klasickejšom prípade translácie skrátených mRNA je komplex HBS1L/GTPBP2/PELO schopný vnímať translačné ribozómy ani s mRNA, ani s nabitou tRNA v mieste A. PELO a HBS1L sú paralógmi eukaryotických terminačných faktorov eRF1 a eRF3, v danom poradí, a sú teda schopné napodobňovať termináciu translácie týchto chybných mRNA. Po naviazaní PELO na prázdne miesto A sa prijme ATPáza ABCE1, čím sa indukuje rozdelenie dvoch ribozomálnych podjednotiek, podjednotka 40S sa recykluje a podjednotka 60S, stále nabitá komplexom tRNA a rodiacim sa reťazcom, sa odovzdá komplexu RQC. na spracovanie, v ďalších krokoch cesty RQC [94].
V prípade zrážok ribozómov, ku ktorým dochádza v dôsledku poly (A) sekvencií, sa ukázalo, že ubikvitin ligáza ZNF598 rozpoznáva tieto zrazené ribozómy a ubikvitinuje 40S ribozomálne proteíny RPS10 a RPS20 [95,96], čím sa zameriava na tieto ubikvitinované ribozómy pre RQC. Zdá sa, že tieto akcie sú koordinované s ubikvitináciou RPS2, RPS3 a RPS20 pomocou RACK1 [97]. Nedávno sa ukázalo, že udalosť ubikvitylácie sprostredkovaná ZNF598 môže byť zvrátená pomocou USP21 a OTUD3, pravdepodobne preto, aby sa predišlo degradácii podjednotky 40S, čo umožní jej recykláciu v ďalších translačných kolách [98]. Stredný krok medzi ubikvityláciou 40S podjednotky sprostredkovanou ZNF598 a rozdelením dvoch ribozomálnych podjednotiek a po nábore komplexu RQC stále nie je známy.
V kvasinkách, po štiepení dvoch ribozomálnych podjednotiek a recyklácii 40S podjednotky, je mRNA zameraná na degradáciu pomocou Xrn1 a komplexu exozómov. Nedávna práca [99] však naznačuje, že v bunkách cicavcov to tak nemusí byť, pretože v reportéroch kolízií ribozómov nachádzajú len malú degradáciu mRNA. V kvasinkách aj u cicavcov je podjednotka 60S zaťažená vznikajúcim reťazcom a tRNA v P-mieste rozpoznávaná komplexom RQC (obrázok 2c). Obštrukcia 60S podjednotky nesúcej exponovaný rodiaci sa polypeptid spolu s peptidyl-tRNA je potom špecificky rozpoznaná a viazaná NEMF, ktorý zase získava LTN1, stabilizuje jeho väzbu na podjednotku 60S. LTN1 je E3 ubikvitín ligáza, ktorá polyubikvitinuje vznikajúci polypeptid na lyzínových zvyškoch, ktorý je potom zameraný na degradáciu, zatiaľ čo teraz voľná podjednotka 60S sa môže recyklovať [94, 100]. V niektorých prípadoch, keď rodiaci sa polypeptid nemá lyzíny prístupné pre LTN1, NEMF sprostredkuje proces známy ako CATylácia (C-koncové alanín treonínové chvosty), kde alanínové a treonínové zvyšky je možné pridať do rodiaceho sa reťazca v mRNA, čím sa predlžuje rodiaci sa reťazec a zvýšenie šancí, že lyzínový zvyšok sa stane prístupným pre ubikvityláciu z LTN1 [93].
Podrobnejšie mechanizmy a regulačné procesy zahrnuté v RQC zostávajú nedostatočne pochopené. Nedávny pokrok v technikách profilovania ribozómov, ako sú metódy na štúdium zrážaných ribozómov (najmä disomov, pozri vyššie), však určite poskytne komplexnejší pohľad na to, čo spúšťa zrážky ribozómov a ako sa aktivuje RQC.
4. Matematické modely prekladu
Popísaná molekulárna zložitosť translačného procesu robí kvantitatívnu interpretáciu translačných experimentov, najmä ribo-seq, veľmi náročnou [56,101–103]. Predtým, ako predstavíme matematické modely, ktoré sa používajú na interpretáciu údajov ribo-seq, stručne preskúmame niektoré špecifiká experimentálnych protokolov, ktoré sú dôležité pre analýzu.
Prvý krok ribo-seq zahŕňa zastavenie translácie pomocou inhibítorov translácie alebo rýchleho zmrazenia, potom sa mRNA spolu s naviazanými ribozómami izoluje a podrobuje sa nukleázovému štiepeniu. Na prípravu a sekvenovanie knižnice DNA sa vyberú fragmenty s približne 30 nukleotidmi (zodpovedajúce typickej dĺžke fragmentov chránených ribozómami, nazývaných stopy ribozómov). Nakoniec sa čítania mapujú do genómu a pri každom čítaní sa identifikuje A miesto ribozómu, čím sa získa poloha translačného ribozómu pri nukleotidovom rozlíšení. Čítania zodpovedajúce v každej polohe sa nakoniec sčítajú, čím sa získa profil obsadenosti ribozómov pre každý gén [104].
V praxi sú experimentálne protokoly náchylné na odchýlky, ktoré predstavujú dôležitý mätúci faktor v analýze. Napríklad použitie cykloheximidu na zastavenie translácie bezprostredne pred extrakciou RNA môže významne ovplyvniť profil pokrytia, najmä tým, že spôsobí akumuláciu hustoty ribozómov v blízkosti miest začiatku translácie a „rozmazanie“ hustoty ribozómov v telách génov [105, 106]. Skutočne existujú dôkazy, že translácia pokračuje v prítomnosti cykloheximidu, ale rýchlosti predlžovania špecifického pre kodóny sú dramaticky zmenené [107], zatiaľ čo v pečeni myší použitie CHX v lyzovacom pufri nemení dynamiku translácie [18]. Príprava knižnice môže tiež skresliť experimentálny výsledok tým, že zahrnie množstvo reakcií zahŕňajúcich enzýmy so špecifickosťou sekvencie nukleotidov, ako je štiepenie a ligácia [101]. V niektorých súboroch údajov majú tieto sekvenčné odchýlky väčší vplyv na pokrytie ako identita kodónov v dekódovacom centre ribozómu [37]. Aktuálny pracovný postup ribo-seq zvyčajne vyberá čítanie konkrétnej dĺžky (približne 30 nt). To má výhodu v znížení kontaminácie ribozomálnou RNA, ale môže to skryť časť translačnej odpovede. Páry uviaznutých ribozómov môžu najmä chrániť dlhšie fragmenty mRNA pred štiepením nukleázami, takže údaje o ribozómoch zaradených do poradia môžu byť vyčerpané [37]. Analýza údajov môže priniesť ďalšiu neistotu, najmä pri identifikácii polohy A-miesta v ribozómovej stope. Toto je skutočne zásadný krok v analýze a bolo vyvinutých niekoľko metód [38,42,64,107–112] na poskytnutie spoľahlivého odhadu polohy ribozómu pri rozlíšení kodónov.
V posledných rokoch sa matematické a výpočtové modely prekladu stali kľúčovou zložkou pre interpretáciu údajov ribo-seq. Taký komplexný a mnohostranný problém pritiahol vedcov z rôznych domén a motivoval vývoj špecifických techník na skúmanie determinantov predĺženia translácie a rýchlosti syntézy bielkovín.
4.1. Modely úplne asymetrického procesu vylúčenia
Významným krokom bolo zníženie náročnosti prekladu na dynamický model s malým počtom parametrov. Jeden úspešný model, ktorý zachytáva množstvo základných vlastností translácie (diskrétne a jednosmerné kroky, sterická prekážka, stochasticita), je známy ako TASEP, ktorý patrí do širšej triedy procesov študovaných v štatistickej fyzike nazývaných systémy interagujúcich častíc. V biológii ho predstavili spolupracovníci Gibbs & amp [113], aby popísal dynamiku ribozómov súčasného prekladu mRNA transkriptu a predstavil ho v matematike Spitzer [114] na štúdium procesov Brownovho pohybu s interakciami v jadre. TASEP v podstate pozostáva z častíc pohybujúcich sa po jednorozmernej mriežke skokom z jedného miesta na druhé konštantnou rýchlosťou [115]. Miesto A môže byť obsadené iba jednou časticou súčasne, preto môže častica skočiť dopredu iba vtedy, ak je ďalšie miesto prázdne (obrázok 3a). V priebehu rokov sa model ukázal ako vhodný na opis rôznych javov, od cestnej premávky [116] po biologický transport [117,118].
Obrázok 3. Teoretické modelovanie a analýza prekladu. (a) (i, ii) schematické znázornenie úplne asymetrického vylučovacieho procesu (TASEP) s časticami veľkosti ℓ = 1 a jeho fázovým diagramom sú uvedené tri režimy ustáleného stavu (nízka hustota (LD), vysoká hustota (HD) a maximálny prúd) (MC)). Miera iniciácie, ukončenia a predĺženia je označená α, β a λ. (iii) zjednodušená reprezentácia prekladu molekuly mRNA s poukázaním na prepojenia na TASEP. (b) Zovšeobecnenia TASEP: (i) rozšírené častice (ℓ > 1) (ii) nehomogénne rýchlosti λi ≠ λj iii) obmedzené zdroje zodpovedajúce TASEP s celkovým počtom častíc N.tot ktorý je pevný, zdieľaný medzi nádržou (N.r) a mriežka (N.) (iv) recyklačné mechanizmy: častice môžu difundovať v trojrozmernom zásobníku, mriežka je modelovaná ako flexibilný polymér efektívna rýchlosť iniciácie αeff závisí od koncentrácie častíc v miestnom objeme v okolo miesta iniciácie (v) súťaž o zdroje: viaceré mriežky (možno rôznych dĺžok) súťažia o konečný počet (N.tot) častíc. Efektívna rýchlosť začatia αeff závisí od počtu častíc dostupných na iniciáciu (N.). (c) Analýza údajov ribo-seq pomocou simulácií TASEP (i) a zovšeobecnenej lineárnej regresie (ii). i) Výsledky simulácie a údaje sa porovnajú a vstupné parametre sa upravia tak, aby zodpovedali údajom. (ii) Za predpokladu nízkej hustoty, logaritmus strednej hustoty (μgi) čítaní na každej pozícii sa aproximuje súčtom logaritmu génovo špecifického toku (fg) a logaritmus doby zotrvania je súčtom rôznych parametrov, ktoré predstavujú čas dekódovania v mieste A, tvorbu peptidovej väzby, interakcie vo výstupnom tuneli, kolízie a odchýlky. K údajom je priložený zovšeobecnený lineárny model. (d) i) Schéma reportérovej mRNA SunTag. Značka s opakovaným epitopom nazývaná SunTag (tmavozelená mRNA) kóduje peptidy (sivé šesťuholníky), ktoré je možné kotranslačne označiť fluorescenčnými protilátkami (zelené ovály). Súbor kmeňových slučiek MS2 (červená mRNA) v 3 'UTR umožňuje vizualizáciu jednotlivých mRNA pomocou fluorescenčne označeného obalového proteínu MS2. (ii, iii, iv) Na väčšom grafe ideálne stopy intenzity fluorescenčného svetla transkribovanej reportérovej mRNA v rôznych časových bodoch (t1, t2, t3, t4) zodpovedajú konfiguráciám translačných ribozómov uvedených vpravo. Menšia krivka je schematickým znázornením profilu autokovariančnej funkcie G(τ) signálu intenzity svetla v závislosti od časového oneskorenia τ. Čas, v ktorom G(τ) ide na nulu odhaduje charakteristický čas T aby ribozóm translatoval gén z oblasti tagu na koniec požadovaného proteínu. Od G(τ) je možné odhadnúť rýchlosť začatia aj celkový čas zotrvania. Táto metóda je známa ako fluorescenčná korelačná spektroskopia (FCS) a je jednou z metód používaných na odvodenie času translácie spolu s testom run-off assay (ROA) a regeneráciou fluorescencie po fotobielení (FRAP).
V pôvodnom TASEPe majú častice jednotnú dĺžku (pokrývajú iba jedno miesto) a rýchlosti preskakovania sú rovnaké pre každé miesto mriežky (homogénny model) (obrázok 3a). Hranice môžu byť uzavreté (periodické okrajové podmienky) tak, aby sa prvé a posledné miesto zhodovalo, alebo otvorené. Posledný prípad je skutočne biologicky relevantnejší pre preklad. Pri tejto voľbe je každá hranica spojená s nekonečným rezervoárom častíc častíc (napr. ribozómov), ktoré vstupujú do systému na prvom mieste, prechádzajú celou mriežkou a opúšťajú systém na poslednom mieste. V biologickom kontexte je vstupná rýchlosť obvykle označovaná ako počiatočná rýchlosť, výstupná rýchlosť ako ukončovacia rýchlosť a skoková rýchlosť ako rýchlosť predĺženia. V tejto pôvodnej formulácii sú rýchlosti predĺženia všetky rovnaké, zatiaľ čo rýchlosti spustenia a ukončenia sa môžu líšiť (všetky sú konštantné v čase). V závislosti od hodnoty týchto dvoch parametrov možno systém nájsť v troch ustálených fázach: napoly naplnená fáza nazývaná maximálny prúd (MC), fáza s nízkou hustotou (LD) a fáza s vysokou hustotou (HD) [ 115] (obrázok 3a). Každá fáza je charakterizovaná rôznymi vzťahmi medzi prúdom a hustotou častíc.
Zložitejšie formulácie pôvodného TASEP boli v posledných rokoch rozsiahle študované ako realistickejšie modely syntézy proteínov (pozri [115,117] pre prehľady týchto modelov a ich aplikácií). Ustálené stavy takýchto modelov zvyčajne nie sú analyticky známe a získavajú sa pomocou aproximácií alebo simulácií Monte Carlo. Takéto modely sa vo veľkej miere používajú pri interpretácii a analýze údajov ribo-seq, najmä na odvodenie rýchlostí iniciácie a predĺženia [7,11,56,119–123] a na kvantifikáciu radenia ribozómov [68]. Štúdium týchto teoretických modelov navyše objasnilo hlavné črty kodónovej sekvencie určujúcej rýchlosť syntézy proteínov [10]. Boli použité na údaje ribo-seq hlavne v kvasniciach (S. Cerevisiae), zriedkavejšie u cicavcov [56,123].
4.2. Zovšeobecnenia úplne asymetrického procesu vylúčenia
Prvú, dôležitú, zovšeobecnenie systému TASEP urobili spolupracovníci Gibbs & amp [113,124], ktorí považovali častice s veľkosťou väčšou ako 1 (ℓ> 1) (obrázok 3b(i)), aby sa zohľadnila dĺžka ribozómu, ktorý pokrýva približne 30 nukleotidov (10 kodónov) [64, 125]. Zatiaľ čo v pôvodnej formulácii (ℓ = 1, rýchlosti homogénneho predĺženia) modelu je možné prúdy a hustoty vypočítať presne pre akúkoľvek hodnotu počiatočnej a koncovej rýchlosti [126–128], rozšírenie na častice ľubovoľnej veľkosti (ℓ> gt 1) nemá presné riešenie. Existuje niekoľko dobrých aproximácií, inšpirovaných prístupmi stredného poľa [113,129] a poruchovými prístupmi [130]. Fázový diagram TASEP s ℓ> 1, charakterizovaný prístupmi Monte Carlo a prístupmi stredného poľa [131], je kvalitatívne podobný diagramu pôvodného programu TASEP, konkrétne ukazuje tri fázy (obrázok 3)a).
Najjednoduchšia aproximácia predpokladá, že hustota ribozómov je dostatočne nízka na to, aby bolo možné zrážky ribozómov zanedbať, čo výrazne znižuje zložitosť modelu. Aproximácia sa často používa pri interpretácii údajov ribo-seq, pretože existujú dôkazy o tom, že preklad sa väčšinou deje v režime s nízkou hustotou, napríklad v kvasinkách divokého typu [10], aj keď sa stále diskutuje o tom, aké dôležité sú zrážky v rôzne systémy za rôznych podmienok [69,71,132]. Keď je to platné, hustota čítaní na každom kodóne môže byť aproximovaná tokom (špecifický pre gén, ekvivalentný rýchlosti syntézy proteínov na mRNA) vydeleným rýchlosťou predĺženia (špecifickou pre kodón, ktorý sa prekladá, a pre kontext kodónu) ( podrobné vysvetlenie nájdete v doplnkovom materiáli [119]). Použitím tejto aproximácie a za predpokladu, že pokles ribozómov je počas translácie zanedbateľný (aby bol tok zachovaný pozdĺž transkriptu), je možné odhadnúť doby zotrvania (recipročné hodnoty rýchlosti predĺženia) priamo z počtu prečítaní ribo-seq , až do faktora proporcionality špecifického pre gén. Za tohto predpokladu je skutočne čas zotrvania v každej polohe pozdĺž CDS úmerný počtu fragmentov chránených ribozómami v tejto polohe. V praxi je tiež potrebné vziať do úvahy experimentálnu odchýlku, ktorá môže zmiasť doby zotrvania [18].
Druhým prístupom je použiť aproximácie stredného poľa (MF). Prístupy stredného poľa zahŕňajú zanedbávanie určitých korelácií v systéme za predpokladu, že úplné rozdelenie pravdepodobnosti modelu sa faktorizuje na súčin lokálnych marginálov [133]. Bežný MF predpokladá, že okrajové rozdelenie pravdepodobnosti pre lokalitu i a i+ ℓ obsadenie faktorizuje súčin medzi hraničnou pravdepodobnosťou pre i byť obsadený a hraničná pravdepodobnosť pre i+ ℓ je obsadená. Tu ℓ predstavuje veľkosť ribozómu takú, že ribozóm v mieste i môže posunúť jeden kodón dopredu, iba ak v polohe nie je žiadny ribozóm i+ ℓ (obsadenie ℓ kodónov po prúde).
Nanešťastie pre TASEP s ℓ> 1 je jednoduchá aproximácia MF veľmi slabá [117]. Bola vyvinutá sofistikovanejšia aproximácia (tiež „stredné pole“, pretože zanedbáva niektoré korelácie) [124, 134], ktorá presnejšie predpovedá priemerný prúd. Pôvodný prístup [129] využíva skutočnosť, že v „veľkom“ (ďaleko od hraníc) možno systém v MC a ustálenom stave opísať ako plyn častíc v jednorozmernej diskrétnej mriežke s tvrdými -interakcie jadra. Použitím teórie štatistickej mechaniky pre takýto plyn vo fáze MC a rafinovaného prístupu stredného poľa pre fázy LD/HD našli hodnoty prúdu v súlade so simuláciami Monte Carlo (v rámci numerickej presnosti). Svazits-Nossan a kol. [130,135] vyvinuli iniciačne obmedzenú aproximáciu hustôt a prúdov na základe rozšírenia modelovej distribúcie pravdepodobnosti v silách iniciačnej rýchlosti. Táto aproximácia je založená na predpoklade, že iniciácia je krokom obmedzujúcim rýchlosť prekladu. Koeficienty expanzie zistili až do tretieho rádu, pričom využili graficko-teoretickú interpretáciu Markovových reťazcov aplikovaných na TASEP.
Druhým dôležitým rozšírením programu TASEP je zvážiť miery nehomogénneho predĺženia. Ako už bolo spomenuté, heterogenita rýchlosti predĺženia je spôsobená viacerými faktormi, ako je abundancia tRNA, tvorba peptidovej väzby, sekundárna štruktúra mRNA, interakcie výstup-tunel [119] a ko-translačné skladanie [136]. Heterogenita rýchlostí predĺženia je skutočne naznačená profilmi ribo-seq, ktoré predstavujú (ako už bolo uvedené vyššie) odhady doby zotrvania [119] za predpokladu nízkej hustoty.
Prístup stredného poľa podľa McDonalda a Gibbsa, ktorý autori aplikovali na jednotný systém, je účinný aj pri popise neuniformných systémov [137]. Ak druhý prístup zlyhá, rozšírenie pôvodného prístupu k priemernému poľu na dvojbodové okraje (a faktorizovanie okrajov vyššieho rádu) je pri popisovaní systému účinnejšie než bežné jednobodové priemerné pole, ale je tiež náchylnejšie na na numerické nestability a analytické ťažkosti [137]. Vo všeobecnosti sú všetky aproximácie popísané pre jednotný prípad zovšeobecnené na TASEP s nejednotnými sadzbami, s výnimkou [129]. Táto aproximácia sa opiera o ekvivalenciu systému vo fáze MC s plynom častíc v rovnováhe, čo je založené na skutočnosti, že v nekonečnej mriežke pri maximálnom prúde sú častice rovnomerne rozložené v objeme. To už neplatí, keď sa ceny líšia web od webu. Tiež ich aproximácia MF pre režimy s obmedzenými hranicami je založená na predpoklade takmer rovnomernej distribúcie častíc a nemusí byť vhodná na zovšeobecnenie na ľubovoľný súbor rýchlostí.
Nedávno bolo vyvinuté riešenie pre model TASEP s rozšírenými časticami a nehomogénnymi rýchlosťami [10], ktorý je platný v kontinuum limit (hydrodynamický limit), keď je možné rýchlosti opísať „hladkou“ funkciou polohy pozdĺž prepisu. Aj keď sú skutočné rýchlosti od kodónu k kodónu veľmi diskontinuálne, ich prístup objasnil hlavné črty kodónovej sekvencie určujúcej translačnú účinnosť odhalením vzťahov hustota-prúd v rôznych režimoch translácie. Zistili existenciu rovnakých fáz ustáleného stavu jednoduchého TASEP (LD, HD a MC) a kvantifikovali dôležitosť sekvenčne závislých znakov, ako je poloha minimálnej rýchlosti a rýchlosti predĺženia blízko začiatku ORF. Konkrétne, ak je minimálna rýchlosť umiestnená v 5 'oblasti ORF, umožňuje to zníženie počtu ribozómov, a tým aj náklady na transláciu vo fáze MC. Rýchlosti predĺženia blízko začiatku ORF tiež hrajú dôležitú úlohu, pretože vysoké rýchlosti predĺženia zvyšujú citlivosť na rýchlosť iniciácie, čo je užitočná vlastnosť vysoko exprimovaných génov alebo regulovaných génov, ktoré sú predmetom rôzneho dopytu v hladinách expresie.
Z analýzy rýchlosti predĺženia odvodenej v predchádzajúcej práci [119] autori [10] zistili, že tieto princípy sa vo všeobecnosti pozorujú v kvasinkách. Napríklad 5 'translačná rampa, ktorá predstavuje model spomalenia translácie okolo polohy kodónu 30–50, môže slúžiť na zabránenie zhlukovania predĺžených ribozómov umiestnením minimálnej rýchlosti na začiatku sekvencie, ako sa pôvodne navrhovalo [138]. Okrem toho teoretická analýza pomáha odpovedať na dlhotrvajúcu diskusiu o skreslení používania kodónov, čo je obohatenie špecifických synonymných kodónov vo vysoko exprimovaných génoch. Skutočne to bolo pozorované u kvasiniek, čo naznačuje hypotézu, že zaujatosť používania kodónov urýchľuje predĺženie [139]. Podľa [109] by tento mechanizmus mal mať významný vplyv na translačnú účinnosť iba vtedy, ak ovplyvní umiestnenie minimálnej sadzby a sadzby v ranom ORF. Vo všetkých ostatných prípadoch by to však mohlo ovplyvniť rýchlosť produkcie proteínov nepriamo znížením hustoty ribozómov v transkripte, a teda aj nákladov na transláciu. To by zase zvýšilo dostupnosť voľných ribozómov, pripravených na recykláciu na nový preklad. Aspektu recyklácie sa budeme venovať ďalej v tejto časti.
Vyvodenie miery biologického predĺženia z experimentálnych meraní na posúdenie translačnej účinnosti zostáva veľmi náročné. Niekoľko prác [18,38] odvodilo doby zotrvania špecifické pre kodón a toky špecifické pre gén pomocou štatistickej regresie a za predpokladu, že hustota ribozómov je dostatočne nízka na to, aby sa zrážky mohli zanedbať. Na základe tohto predpokladu považujú hustotu čítaní v každej polohe za súčin toku a doby zotrvania, kde doba zotrvania môže byť súčinom parametrov špecifických pre sekvenciu, ktoré závisia od kontextu kodónu a ktoré môžu zahŕňať funkcie, ako napr. interakcie výstupného tunela, sekundárne štruktúry mRNA, identita kodónu, ktorý sa prekladá, ako aj technická odchýlka.Na prispôsobenie parametrov sa používajú zovšeobecnené lineárne modely s vhodnou funkciou šumu (ako sú záporné binomické distribúcie [18]) alebo pravdepodobnostnou penalizáciou na zohľadnenie odchýlky vzorky [38] (obrázok 3c).
Pri poruchách, najmä pri vyčerpaní špecifickej aminokyseliny (podmienky 3-AT), jeden z týchto modelov [18] zachytil podpisy kolízií ribozómov zahrnutím ďalších parametrov „zrážky“ odhaľujúcich „tiene“ vo vzorcoch doby zotrvania kompenzované o jednu ribozóm. To naznačuje, že za určitých podmienok môže ribo-seq analýza monozómov detegovať zrážky ribozómov, aj keď štiepenie mRNA medzi susednými ribozómami je pravdepodobne menej účinné v prítomnosti dvoch (alebo viacerých) skladaných ribozómov, a preto môže dôjsť k podpisu kolízie podhodnotené v údajoch o monozómoch.
Tieto metódy založené na štatistickej regresii nezahŕňajú interakcie medzi časticami (na rozdiel od TASEPu), preto kolízie možno detekovať iba čiastočne a tam, kde sa objavujú systematicky (ako v podmienkach 3-AT). Napriek tomu tieto metódy pravdepodobne spoľahlivo predpovedajú časy zotrvania v podmienkach divokého typu, pre ktoré sa nízka hustota vo všeobecnosti považuje za realistický predpoklad. Výhody limitu nízkej hustoty vzhľadom na presnejšie schémy spoliehajúce sa na simulácie uvedené vyššie sú menšie náklady z hľadiska času a výpočtových zdrojov a, čo je dôležité, možnosť pomerne ľahko zohľadniť experimentálne odchýlky pri vyvodzovaní časov zotrvania. Táto posledná funkcia je obzvlášť dôležitá, pretože ribo-seq môže podliehať experimentálnym odchýlkam špecifickým pre protokol (najmä počas štiepenia a prípravy knižnice), ktoré je potrebné pri analýze starostlivo vziať do úvahy a ktoré sa pri analýze údajov často ignoruje s využitím teoretických prístupov založených na TASEP [18,37,101].
Nedávno niektoré štúdie odhalili prítomnosť zrážok ribozómov v kvasinkách [68,70,140], ako aj u cicavcov [69,71], čo naznačuje, že dynamické modely, ako napríklad TASEP, budú pravdepodobne vhodnejšie na skúmanie translácie a jej regulačných mechanizmov. V prípade kolízií je vzťah medzi dobami zdržania a hustotou ribozómov nelineárny a komplexný na vyriešenie tejto zložitosti niekoľko autorov použilo na simuláciu translácie nástroj TASEP [119,120,122]. Simulácia je zvyčajne založená na Gillespieho algoritme, kde je uplynulý čas pre každú udalosť čerpaný z exponenciálneho rozdelenia so strednou inverznou hodnotou. Simulácia procesu vyžaduje stanovenie veľkého počtu parametrov, menovite rýchlosti predĺženia a rýchlosti iniciácie/ukončenia. Simulácia sa používa na overenie zhody predpovedaných rýchlostí a experimentálnych údajov a používa sa aj na optimalizáciu parametrov tak, aby zodpovedali údajom (obrázok 3c). Napríklad v [119] autori odvodzujú miery z profilu hustoty optimalizáciou zhody medzi simulovaným profilom a experimentálnym profilom, iní autori [120] odvodzujú miery optimalizáciou objektívnej funkcie na základe diskutovanej aproximácie s obmedzenou iniciáciou. predtým, alebo použite postup iteračnej optimalizácie na získanie najlepšej zhody medzi simulovaným profilom a údajmi [122]. Odvodené rýchlosti môžu byť špecifické pre transkript a polohu [119,120] alebo špecifické pre kodón (nezávislé od špecifického transkriptu) [122]. Dôležitou nevýhodou týchto prístupov je, že sú výpočtovo drahé a časovo náročné, takže niektorí autori vyvinuli hrubozrnnú verziu modelu TASEP, ktorá vyžaduje menej výpočtových zdrojov a umožňuje jednoduchšie analytické spracovanie [121].
Dôležitým biologickým znakom translácie, ktorý nie je zahrnutý vo vyššie uvedených modeloch, je to, že súbor zdrojov (ako sú ribozómy a tRNA), ku ktorým má každá mRNA prístup, je konečný. Variant homogénneho ℓ = 1 TASEP [141] zavádza globálne obmedzenie počtu častíc (ribozómov) (obrázok 3b(iii)). Konkrétne, hranice a systém zdieľajú pevný počet častíc, takže nárast počtu častíc v systéme určuje vyčerpanie zásobníka. V modeli obmedzenie celkového počtu častíc pôsobí nepriamo na rýchlosť iniciácie, ktorá závisí od počtu častíc v zásobníku a klesá, keď sa zásobník vyčerpá. Obmedzenia počtu ribozómov môžu byť relevantné pri zvažovaní rýchleho rastu buniek, keď sa zdroje môžu stať obmedzujúcimi rýchlosť, bolo by zaujímavé zvážiť vplyv obmedzení na počet aa-tRNA, ktoré môžu byť relevantné v podmienkach obmedzujúcich živiny.
Vyššie sme stručne spomenuli recykláciu ako možný mechanizmus spätnej väzby zlepšujúci preklad. Recyklačné mechanizmy môžu skutočne hrať dôležitú úlohu v regulácii translácie vysoko exprimovaných génov. V skutočnosti sa predpokladá, že niektoré zložky translačného aparátu možno po ukončení recyklovať bez úplného opätovného vstupu do enzýmového poolu v cytoplazme, čím sa zvyšuje účinnosť translácie [142]. Na štúdium tohto javu niektoré práce [143,144] spojili TASEP s ribozómovou difúziou v trojrozmernom médiu a tieto modelové kinetiky ribozómovej adsorpcie/desorpcie na počiatočných/koncových miestach mRNA, ako aj vo fyzike polymérov, ktorá určuje priestorové rozloženie konce navzájom (obrázok 3biv)). Tento proces môže byť uľahčený ďalšími faktormi viažucimi mRNA, ktoré môžu vyvolať tvorbu slučky, čím sa 3′ a 5′ konce transkriptu priblížia [145–147]. Tento účinok je modelovaný väzbovou energiou medzi 5'-cap a poly(A) chvostovými proteínmi, pričom sa určuje pravdepodobnosť, že reťazec je zacyklený, a zvyšuje sa rýchlosť ribozomálnej väzby v iniciačnom mieste za prítomnosti kooperatívnych účinkov [143].
Všetky doteraz prezentované modely založené na TASEP-e uvažujú súčasne s jednou molekulou mRNA, pričom úplne zanedbávajú interakcie medzi rôznymi molekulami mRNA vyplývajúce z konkurencie na konečnom súbore zdrojov, ako sú ribozómy, translačné faktory a aa-tRNA. Prvé pokusy o objasnenie konkurencie o ribozómy boli uskutočnené pre homogénne TASEPy s časticami jednotnej veľkosti (ℓ = 1). Autori vyriešili ustálený stav systému s ľubovoľným počtom TASEP napojených na spoločný zásobník konečných častíc [148] (obrázok 3bv)). Je potrebná ďalšia generalizácia, aby bol model relevantný pre syntézu proteínov, medzi ktorými sú už uvedené (častice s veľkosťou väčšou ako jedno mriežkové miesto, nehomogénne miery predĺženia, recyklácia) a kompetícia pre aa-tRNA a väzbové faktory.
4.3. Jednomolekulová analýza prekladu
Ribo-seq poskytuje informácie o procese translácie v priemere tisícok molekúl a buniek mRNA a napriek tomu, že ide o výkonný nástroj, nie je vhodné merať určité aspekty heterogenity translácie [149]. Napríklad každý transkript génu môže prejsť transláciou s rôznymi počiatočnými miestami alebo dokonca rôznymi rámcami, čo vedie ku kanonickej a nekanonickej translácii [150, 151] (vnútrogénna heterogenita). Okrem toho môže byť translácia vo vnútri bunky regulovaná odlišne v čase a priestore, ako v primárnych neurónoch, kde sú mRNA translatované v proximálnych dendritoch, ale potláčané v distálnych dendritoch a vykazujú „burstovú“ transláciu [6]. Nakoniec, ak sú medzi bunkami v tkanive rozdiely (medzibunková heterogenita), boli by tiež spriemerované v experimente ribo-seq.
Tieto zdroje heterogenity boli vo väčšine teoretických modelov založených na TASEP zanedbané aj preto, že ich autori majú ako experimentálnu referenciu globálne merania, konkrétne ribo-seq a rna-seq. Dokonca aj regresný prístup vytvára silné predpoklady homogenity: najmä skutočnosť, že každý transkript génu je translatovaný za rovnakých podmienok (s rovnakou rýchlosťou iniciácie a rýchlosťou produkcie proteínu) a že doby zdržania sú v rôznych transkriptoch rovnaké.
Meranie translácie na úrovni jednej molekuly sa stalo možným vďaka nedávnemu pokroku v označovaní proteínov a zobrazovacích technikách. Medzi nedávno vyvinutými testami TRICK umožňuje rozlíšenie medzi mRNA, ktoré už prešli cyklom translácie, a nepreloženými [152]. Ďalší súbor testov, zobrazovanie rodiacich sa peptidov s jednou molekulou (SINAPS), umožňuje monitorovanie translácie jednotlivých molekúl mRNA in vivo. V týchto testoch je reportérová mRNA modifikovaná tak, aby kódovala viacero epitopov v otvorenom čítacom rámci proteínu, o ktorý je záujem. Keď je proteín translatovaný, epitopy sú rozpoznané a viazané fluorescenčnými sondami fragmentov protilátok (obrázok 3d). Použitie tohto konštruktu v kombinácii so značením MS2-používaným na obrazovú detekciu mRNA v živých bunkách-umožňuje monitorovanie molekúl jednej mRNA, ktoré podliehajú aktívnej translácii [153]. Je možné sledovať dynamiku prekladu v priebehu času a použiť údaje na kvantifikáciu celkového času potrebného na preklad otvoreného čítacieho rámca, ako aj rýchlosti začatia prekladu (pozri [154] pre analýzu fluorescenčného signálu a [155] pre prehľad). Kombináciou ortogonálnych fluorescenčných značkovacích systémov, ako sú SunTag [156] a MoonTag [150], je možné sledovať výber počiatočného miesta a výber rôznych čítacích rámcov, čo do značnej miery rozširuje možnosť skúmať heterogenitu translácie na úrovni jednej bunky.
V nedávnej štúdii [153] bol TASEP ďalej zovšeobecnený tak, aby zahŕňal ľubovoľné umiestnenie fluorescenčných epitopov viažucich sondu, aby sa napodobnil výsledok zobrazovania dynamiky translácie jednej molekuly. Použitím stochastického modelu na simuláciu realistických syntetických údajov mohli autori porovnať rôzne experimentálne testy a stanoviť, ktoré z nich s väčšou pravdepodobnosťou poskytnú spoľahlivé odhady kinetických parametrov. Kalibrovali svoj stochastický model pomocou údajov z fluorescenčnej korelačnej mikroskopie (FCS) (najspoľahlivejší test podľa ich analýzy), aby sa odhadli rýchlosti začatia a predĺženia (obrázok 3dii), iii), iv)). Autori poskytli softvérový balík s otvoreným zdrojovým kódom (rSNAPsim) na simuláciu výstupu rôznych typov experimentov s jednou molekulou (pozri popis na obrázku 3d), pre akúkoľvek génovú sekvenciu a s rôznymi predpokladmi týkajúcimi sa použitia synonymných kodónov, modifikácií úrovne tRNA alebo ribozómových prestávok. Podpisy ribozómových radov boli nedávno pozorované v translačných miestach, ktoré posúvajú rámce HIV-1, pomocou zobrazovacej techniky s jednou RNA založenej na kombinácii dvoch rôznych typov epitopov (epitopy SunTag a HA) a testov odtoku ribozómov [157].
Doteraz sa modelovanie translácie založené na TASEP často aplikovalo na analýzu údajov o celom genóme, najmä ribo-seq, čo sa ukázalo ako silný teoretický nástroj. Pôvodný model bol vylepšený tak, aby zahŕňal biologicky významné vlastnosti, ako je veľkosť ribozómov, heterogénne miery predĺženia, obmedzené zdroje a recyklačné mechanizmy. Účinok konečných zdrojov, recyklácie a konkurencie medzi molekulami mRNA bol skúmaný iba čiastočne a zostáva zaujímavým budúcim predmetom výskumu. Nedávna štúdia [158] sa pokúsila študovať transláciu na úrovni celých buniek simuláciou translácie tisícok molekúl mRNA, vrátane konkurencie o ribozómy, tRNA, tRNA kolísavých interakcií a recyklácie tRNA v E. coli, a predstavuje krok k štúdiu prekladu vrátane viacerých funkcií na úrovni buniek. Kombinácia rôznych experimentálnych testov synergickým spôsobom, ako sú merania v jednobunkových a jednomolekulových molekulách, ako aj globálne merania, môže poskytnúť bezprecedentné príležitosti na hlboké porozumenie prekladu.
Simulácie translácie s jednou molekulou môžu pomôcť interpretácii najmä experimentálnych údajov, kombinácia modelovania založeného na TASEP a časovo rozlíšených testov s jednou molekulou by mohla objasniť dynamiku translácie, ako aj jej heterogenitu a súťaž o zdroje v bunkovej úrovni. Modelovanie TASEP by sa mohlo ďalej skomplikovať, aby sa zohľadnili zaujímavé vlastnosti, ako je trojrozmerná štruktúra polyzómov (ktorá by mohla ovplyvniť transláciu aj prostredníctvom recyklácie častíc), ktorú je možné vizualizovať pomocou techník elektrónovej mikroskopie [159]. -kanonický preklad, posun snímok, všetko merateľné napríklad pomocou systémov SunTag/MoonTag. Okrem toho by teoretické modelovanie mohlo ťažiť z priamych opatrení iniciácie translácie a celkového času zotrvania poskytovaného zobrazovaním jednou molekulou.
5. Záver
Produkcia funkčných bielkovín je predpokladom správneho fungovania rôznych bunkových procesov. Rastúci počet dôkazov naznačuje, že predĺženie translácie je kritickým procesom modulujúcim translačný výnos mRNA rôznymi mechanizmami spätnej väzby. V tomto prehľade upozorňujeme na niektoré z kľúčových molekulárnych determinantov predĺženia translácie u cicavcov, ktoré odhalili nedávne štúdie. Aj keď metódy ako profilovanie ribozómov a profilovanie tRNA spolu s teoretickým modelovaním odhalili rôzne faktory ovplyvňujúce dynamiku predĺženia translácie, stále je veľa vecí, ktoré je potrebné odhaliť. Napríklad doby zdržania ribozómov sú od kodónu k kodónu veľmi variabilné a je známe, že špecifické páry kodónov spomaľujú predĺženie translácie. Dôvody, ktoré sú za tým, sú stále do značnej miery neznáme. Avšak kombinácia vyššie uvedených prístupov spolu so štrukturálnymi štúdiami a štúdiami na jednej molekule by to objasnila.
Prístupy založené na nástroji TASEP sú teoreticky účinnými nástrojmi na interpretáciu údajov o profilovaní ribozómov, pretože môžu plne zodpovedať za dynamiku procesu. Vyžadujú však komplexné simulácie a doladenie mnohých parametrov. Prístupy založené na štatistickej analýze, ako je zovšeobecnený lineárny model, poskytujú pohľad na determinanty miery predĺženia a vyžadujú oveľa menej výpočtových zdrojov, s dôležitou nevýhodou len čiastočného zohľadnenia kolízií a predpokladu existencie časov zotrvania v celom genóme. .
Preklad u cicavcov je komplexný proces, ktorý je stále menej zrozumiteľný ako u baktérií a kvasiniek. Zaujímavou perspektívou do budúcnosti by bolo rozšírenie štúdia prekladu cicavcov o začlenenie informácií pochádzajúcich z meraní translácie s jednou molekulou. To by umožnilo monitorovať preklad na úrovni jednej bunky a in vivo, čím sa otvára možnosť priameho merania počiatočnej rýchlosti, ako aj celkového času predĺženia každého transkriptu. Predpokladáme, že kombinácia rôznych testov, hromadne aj v jednotlivých molekulách, spolu so spomínanými teoretickými prístupmi poskytne nové možnosti hlbšieho pochopenia translačného procesu, ako aj jeho perturbácií počas stresu alebo choroby.
