Informácie

Prečo sa ostatné bázy nepoužívajú na RNA capping a tailing?

Prečo sa ostatné bázy nepoužívajú na RNA capping a tailing?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Prečo pridanie 5' čiapočky a 3' chvosta zahŕňa guanín a adenín v tomto poradí? Prečo nie je žiadna z ďalších dvoch báz pridaná k mRNA na ochranu jej koncov alebo ako signál na jej transport do cytoplazmy?


Nemyslím si, že existujú jednoznačné odpovede, ale môžem uvažovať o teoretických dôvodoch:

  • Po prvé, chvost Poly A môže byť efektívne syntetizovaný, pretože ATP je najľahšie dostupný nTP, ktorý je hlavným zdrojom energie.

  • Viac k mechanizmu, ale toto nie je vysvetlenie evolúcie: Terminačná sekvencia „TTTATT“ na templáte DNA a „AAUAAA“ na RNA je začiatkom polyadenylácie. To však patrí do kategórie „problém s kuracím vajcom“.

  • Ako bioinformatik náhodou viem, že 3'UTR je najvyššia v obsahu A v 3 genomických kontextoch a 5'UTR je najvyššia v obsahu G v 3 kontextoch, takže tieto post-transkripčné modifikácie pravdepodobne ešte viac posilnia kompozičné rozdiely v kontextoch.

  • Pre poly-A koniec môže byť tiež relevantné spomenúť, že G alebo C sekvencie majú vyššie sklony k štruktúre v dôsledku množstva vodíkových väzieb.

Dúfam, že tam boli nejaké užitočné informácie.


Riadenie koncentrácie messengerovej RNA pomocou diferenciálneho cytoplazmatického polčasu: RNA adenovírusového messengera z transkripčných jednotiek 1A a 1B ☆

Základ pre zmenu v množstve niekoľkých špecifických vírusových messengerových RNA bol skúmaný počas lytického cyklu adenovírusu 2. Dve nezávislé transkripčné jednotky, 1A a 1B, na ľavom konci vírusového genómu produkujú skupiny 5 'a 3' co-koncových mRNA, ktoré sa líšia v relatívnej koncentrácii cytoplazmy v rôznych časoch po infekcii. Tvorba jadrových polyadenylovaných, zostrihaných molekúl z týchto transkripčných jednotiek sa však nezdá byť rozdielna v súlade s cytoplazmatickými zmenami mRNA. Všetky formy 1A a 1B mRNA bolo možné vždy nájsť ako jadrové polyadenylované molekuly v podobných relatívnych množstvách. Meraním rýchlosti akumulácie značenej mRNA na maximálne hladiny sa určilo, že na začiatku infekcie majú tieto mRNA krátke cytoplazmatické polčasy, rádovo šesť až desať minút. Po replikácii DNA dôjde k približne desaťnásobnému zvýšeniu stability dvoch raných mRNA z oblasti 1A a kratšej mRNA z oblasti 1B, 1B1040. Dlhšia mRNA z oblasti 1B, 1B2300, nemá zvýšený cytoplazmatický polčas. V dôsledku meniacich sa polčasov je relatívna hojnosť dvoch 1B mRNA v ustálenom stave neskoro pri infekcii obrátená. Zvýšená stabilita je tiež navrhnutá ako príčina vzhľadu 1A500 mRNA neskoro v infekcii. Táto mRNA nie je detegovaná včas, pokiaľ nie je syntéza proteínov inhibovaná cykloheximidom. Tieto výsledky poukazujú na dôležitosť kontroly stability mRNA, ktorá vyžaduje pokračujúcu syntézu RNA a proteínov, pre regulovanú expresiu niektorých génov v eukaryotoch.

Táto práca bola podporená grantmi od National Cancer Institutes of Health (CA16006-7 a CA09256-04) a American Cancer Society (MV39J).


Technológia knockoutu

Génové „vyradenie“ by bolo neetické, keby sme ho robili u človeka. Preto sa spravidla robí s myšami. V podstate vytvárate novú formu života, ktorá má určitý gén zmenený prostredníctvom inzercie, čím sa stáva nefunkčným alebo chýba. Predpokladám, že by ste mohli odstrániť genetický materiál a "vyrezať" gén (pravdepodobne so špecifickým reštrikčným enzýmom), potom ho znova vložiť do nového prázdneho vajíčka a začať nový život (podobne ako klonujú zvieratá).

Interferenciu s RNA je možné vykonať pomocou antisense RNA, ktorá je iba doplnkovým reťazcom RNA k RNA, ktorú chcete inhibovať, aby sa viazala na cieľovú RNA a nemohla pokračovať v procese výroby proteínu. Ak však gén stále exprimuje, je to len dočasná inhibícia.

Z vašich rôznych vlákien som zistil, že chcete vedieť, či existuje nejaký spôsob, ako "vymazať" gén u živého človeka, a verím, že odpoveď je NIE.

Ak by teda človek chcel zmeniť svoje gény (robia génovú terapiu na lekárske účely, však?), Aj keby to bolo urobené na lekárske účely a bolo by to legálne, bolo by fyzicky nemožné vymazať v nich gén? keby neboli embryo?

Mohli by ste odstrániť iba genetický materiál a „vylúčiť“ gén v organizme, ktorý ešte nebol dospelý?

Takže ak by človek chcel, aby sa jeho gény zmenili (vykonávajú génovú terapiu na lekárske účely, však?), aj keby to bolo vykonané na lekárske účely a bolo by to legálne, bolo by fyzicky nemožné vymazať gén z nich? keby neboli embryo?

Mohli by ste odstrániť genetický materiál a "vystrihnúť" gén z organizmu, ktorý ešte nebol dospelý?

Áno, pokiaľ viem, nemôžete „vylúčiť“ gén od živej bytosti.

Niektoré génové terapie pokračujú a stále sa učia o tejto novej oblasti. Pokiaľ viem, najúspešnejšia génová terapia sa vykonáva pomocou krvných bunkových línií a komponentov. Vzhľadom na to, že transplantácia kostnej drene môže skutočne nahradiť defektné gény funkčnými, vzhľadom na povahu samotnej kostnej drene (produkciu nových krviniek).

Myslím, že máte problémy s inými druhmi tkaniva. Pravdepodobne by ste mohli dodať upravený genetický materiál do cieľových tkanív pomocou niektorých vírusov a retro-vírusov, ale len by to zvýšilo genetický materiál, ktorý tam už je, a chceli by ste byť opatrní, aby ste to doručili IBA do cieľového tkaniva.

Neviem, ale viem, že táto oblasť výskumu prebieha a rastie a kto vie, čo prinesie budúcnosť?

Pravdepodobne najlepšou metódou, ak by ste chceli inhibovať expresiu konkrétneho génu, by mohlo byť navrhnutie nejakého inhibítora, ktorý bol navrhnutý tak, aby sa naviazal na špecifické väzbové miesto tohto génu, aby sa zastavila väzba polymerázy na daný gén.

Samozrejmosťou je dodávka úplne inej guličky vosku.

Vytvorenie knockoutovanej myši trvá 1 až 2 roky a je dosť zapojené. Zahŕňa kontrolovaný chov, aby sa okrem manipulácie s vajíčkami vytvorila stabilná línia. Ľudia by neboli dobrým kandidátom na tento typ manipulácie.

Vytvorenie transfekovanej bunkovej línie je podstatne jednoduchšie, ale stále vyžaduje bunkovú líniu na rozdiel od primárnych buniek. Stabilne transfekovanú bunkovú líniu som vytvoril asi za 2 týždne.

Existujú techniky ako RNAi, morpholino a Cre/Lox, ktoré môžu zničiť konkrétne gény (pravdepodobne spôsobom špecifickým pre tkanivo), ale tieto metódy som nikdy nepoužil.

Skúšky génovej terapie, o ktorých viem na ľuďoch, boli RNAi a výsledky boli ohromujúce AFAIK.

Alternatívnou metódou na zníženie génu u ľudí je Morfolino antisense (vďaka, Andy). Knockdown je dočasné potlačenie génovej expresie, podobné účinku RNAi (hoci Morpholinos má oproti siRNA určité výhody: http://www.gene-tools.com/files/Summerton2007siRNAcompare.pdf [Broken]). Spoločnosť AVI BioPharma vykonáva klinické skúšky s Morpholino oligo (www.avibio.com). Morpholinos sú široko používané vo výskume vývojovej biológie, najmä u zebra.

Morfolíny môžu znížiť expresiu proteínu prerušením cesty malej ribozomálnej podjednotky od 5'-cap do štartovacieho kodónu, čím zabránia tvorbe zrelého ribozómu (http://www.gene-tools.com/files/bba%20review. pdf [Zlomené]). Používajú sa tiež na presmerovanie zostrihu pre-mRNA blokovaním väzbových miest snRNP (http://www.gene-tools.com/files/draper_etal.pdf [Broken]). Nakoniec sa Morpholinos používa na blokovanie dozrievania a aktivity miRNA (odkaz 1). Účinné dodanie do buniek dospelých organizmov sa dosiahlo konjugáciou s peptidmi penetrujúcimi do buniek bohatými na arginín (odkaz 2, 3, 4) a oktaguanidíniovými skupinami (www.gene-tools.com/vivomorpholinos).

Modifikácia zostrihu je formou génovej delécie, zatiaľ čo Morpholino zacielené na zostrih riadi odstránenie jedného exónu, ak má tento exón počet báz, ktoré nie sú rovnomerne deliteľné tromi, potom budú následné sekvencie exónov posunuté v rámcoch, čo všeobecne vedie k produkcii. nefunkčného proteínu.

Referencie
(1) Kloosterman WP, Lagendijk AK, Ketting RF, Moulton JD, Plasterk RH. Cielená inhibícia dozrievania miRNA pomocou morfolinov odhaľuje úlohu miR-375 vo vývoji ostrovčekov pankreasu. PLoS Biol. 245(8) júl 2007:e203 [Epub pred tlačou]

(2) Wu RP, Youngblood DS, Hassinger JN, Lovejoy CE, Nelson MH, Iversen PL, Moulton HM. Peptidy prenikajúce do buniek ako transportéry pre morfolínové oligoméry: účinky zloženia aminokyselín na intracelulárnu dodávku a cytotoxicitu. Nucleic Acids Res. 1. august 2007 [Epub pred tlačou]

(3) Moulton HM, Fletcher S, Neuman BW, McClorey G, Stein DA, Abes S, Wilton SD, Buchmeier MJ, Lebleu B, Iversen PL. Konjugáty peptid-morfolín prenikajúce do bunky menia pre-mRNA zostrih DMD (Duchennova svalová dystrofia) a inhibujú replikáciu myšieho koronavírusu in vivo. Biochem Soc Trans. 2007 Aug35 (Pt 4): 826-8.

(4) Amantana A, Moulton HM, Cate ML, Reddy MT, Whitehead T, Hassinger JN, Youngblood DS, Iversen PL. Farmakokinetika, biodistribúcia, stabilita a toxicita konjugátu peptid-morpholino konjugát prenikajúci bunkami. Bioconjug Chem. 21. júna 2007 [Epub pred tlačou]


zhrnuté na konci každej kapitoly.

Kvízy a extra cvičné kvízy (od iného predchádzajúceho učiteľa) máte veľa príležitostí. Cvičenie nemusí byť dokonalé, ale nedostatok praxe zvyčajne znamená veľa menej perfektné.

5) Poznajte ZNÁME PRÍKLADY, ktoré ilustrujú rôzne procesy, ale (opäť) sa netrápte nad každým detailom.

6) V prípade otázok týkajúcich sa genetických krížov je vždy dobré urobiť Punnettov štvorec na papieri, a nie to urobiť v hlave alebo spoliehať sa na zapamätané pomery. Často sa ukážu byť iné, ako očakávate.


Dusíkatá báza v nukleových kyselinách

Puríny a pyrimidíny

Keď hovoríme o dusíkatej báze v kontexte DNA alebo RNA, je dôležité poznamenať, že existujú dve základné triedy dusíkatej bázy. Každá dusíkatá báza má jednu vlastnosť: šesťstranný kruh so 4 atómami uhlíka a 2 atómami dusíka. A purín má ďalší 5-stranný kruh, vytvorený 1 ďalším uhlíkom a 2 ďalšími atómami dusíka. A pyrimidín dusíkatá báza má iba 1 šesťstranný kruh. Každá dusíkatá báza má jedinečné väzby, vďaka čomu funguje jedinečným spôsobom v rámci DNA alebo RNA. Každú základňu môžete vidieť na obrázku nižšie.

Kyselina deoxyribonukleová (DNA)

Na obrázku nižšie je znázornená štruktúra DNA. DNA má „chrbticu“ deoxyribóza, tu zobrazené ako bezfarebné molekuly s 5 'a 3' koncom. Tieto čísla sa vzťahujú na odkryté uhlíky v cukrovom reťazci, čo dáva DNA jej smerovosť a čitateľnosť. To umožňuje rôznym proteínom efektívne čítať a spracovávať DNA.

Každá farebná molekula predstavuje dusíkatú bázu. Všimnite si, ako sa každá dusíkatá báza páruje s dusíkatou bázou oproti nej. Toto sa volá párovanie báz, a je dôležitou súčasťou replikácie, opravy a údržby DNA. Tu je vidieť v správnej konfigurácii, každý pyrimidín sa páruje s purínom, čo umožňuje vytvorenie niekoľkých vodíkových väzieb. Tieto väzby, prerušované čiary na obrázku vyššie, držia DNA v pravidelnom špirálovitom tvare a chránia DNA pred náhodným prerušením dusíkatej bázy.

Medzi RNA a DNA existujú dva viditeľné rozdiely. Prvá je v samotnom názve. Tam, kde je DNA postavená na deoxyribóze, je postavená RNA ribóza. Jediným rozdielom medzi ribózou a deoxyribózou je atóm kyslíka.

Druhý rozdiel medzi DNA a RNA je v tom, že RNA používa mierne odlišnú sadu dusíkatých báz. Ako je vidieť na obrázku nižšie, molekula RNA sa nahrádza uracil pre tymín. Dôvody nie sú úplne objasnené, aj keď RNA je spravidla molekula s kratšou životnosťou. Ďalej RNA často existuje skôr ako jednovláknová než dvojvláknová s vodíkovými väzbami. Nie je to vždy tak, ako je vidieť na dvojvláknových RNA vírusoch, ale RNA je vo väčšine zvierat typicky jednovláknová.

Bez ohľadu na to, či je nukleovou kyselinou DNA alebo RNA, základný vzorec je rovnaký. Vezmite dusíkatý základ, pridajte 5-uhlíkový cukor so skupinou fosforu a spojte. Väzby vytvorené medzi skupinou fosforu a kyslíkom nasledujúceho 5-uhlíkového kruhu sa nazývajú a fosfodiesterová väzba, a tvoria chrbticu RNA aj DNA.

Ako dusíkatá báza nesie genetické informácie

Každá dusíkatá báza nesie sama o sebe málo informácií. Každá dusíkatá báza sa skôr číta ako jednotka s dvoma ďalšími bázami. Tieto tri základné informačné pakety sa nazývajú kodóny. Každý kodón špecifikuje určitý aminokyselina. V správnom poradí a poskladaných do tvaru vytvorí reťazec aminokyselín a bielkoviny. Tieto proteíny potom vykonávajú funkcie života vrátane všetkého od rastu po reprodukciu.

Na vytvorenie fungujúceho človeka je potrebných približne 3 000 000 000 párov báz. To znamená, že v každej bunke vášho tela je asi 6 000 000 000 jednotlivých báz. Aj keď sa to môže zdať ako obrovské množstvo, vaše telo neustále spracováva a replikuje vašu DNA. Toto je pravdepodobne hlavná a najdôležitejšia funkcia dusíkatého základu pre akýkoľvek organizmus.


Účinky najbližšieho suseda v štruktúre a funkcii nukleových kyselín

Tento článok skúma hypotézu, nazývanú model RY, že tieto rozšírené komíny sa vyskytujú v špeciálnych usporiadaniach purínov (R) a pyrimidínov (Y) pozdĺž reťazcov. Model RY pochádza z meraní chemických posunov jadrovej magnetickej rezonancie (nmr) v oligoribonukleotide a nachádza určitú podporu v štúdiách rôntgenovej difrakcie. Model sa rozvinie do komplexnejšieho obrazu, keď budú účinky najbližšieho suseda dôkladnejšie charakterizované ďalšími experimentmi. Cieľom je stimulovať molekulárnych biológov, aby premýšľali nad rámec sekvencie, aby zvážili usporiadanie najbližších susedov. Do značnej miery sú to tieto susedské interakcie, ktoré určujú miestny trojrozmerný tvar poskytovaný sekvenciou. A-forma môže predstavovať konformáciu DNA v jej aktívne exprimovanej forme. B-DNA môže byť forma užitočná skôr na skladovanie než na expresiu genetického obsahu, hoci enzýmy môžu tiež využívať jej špeciálnu plasticitu pri interakciách „indukovaného prispôsobenia“. Ľavostranná Z-forma existuje len v špecifických sekvenciách a je v jemnej rovnováhe s pravotočivou B-formou, ľahko sa posúva v podmienkach riešenia. Z-DNA môže byť obzvlášť dôležitá pri regulácii torzného napätia v superšpirálovej DNA.

Súčasná adresa: Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California at San Francisco, San Francisco, California.

Súčasná adresa: Katedra chémie, Kalifornská univerzita v Berkeley, Berkeley, Kalifornia.

Súčasná adresa: Katedra chémie, Syracuse University, Syracuse, New York.


Utorok 20. novembra 2012

Veda a správy o SF: Mozgová hudba

Hudba z mozgu a mozgu v hudbe:

Neuroveda + umenie = hudba našej mysle

Obrázok: Ilustrácia partitúry EEG-fMRI hudby od Lu J, Wu D, Yang H, Luo C, Li C, et al. (2012) Hudba bez mozgových vĺn bez mierky zo súčasne nahrávaných záznamov EEG a fMRI. PLoS ONE 7(11): e49773. doi: 10.1371/journal.pone.0049773 Zdieľané pod licenciou CC-BY-2.5.

Ako vyzerá mozog rappera počas freestylingu? Neurovedci z Národného inštitútu zdravia nechali 12 rapperov improvizovať, keď boli v prístroji MRI. Zistili, že mozgová aktivita v mediálnom prefrontálnom kortexe sa zvýšila a aktivita v dorzolaterálnom prefrontálnom kortexe sa znížila. Čo to môže znamenať, že časti mozgu zapojené do kognitívnych „výkonných funkcií“, ako je plánovanie, riešenie problémov, pozornosť a verbálne uvažovanie, môžu byť počas tvorivého procesu uvoľnené.

To by mohlo vysvetľovať, prečo sa zdá, že tvorba hudby plynie počas improvizácie bez akéhokoľvek vedomého premýšľania. Ako uvádza spoluautor štúdie a alternatívny hip-hopový umelec Open Mike Eagle:

Performer Bobby McFerrin a kognitívny neurológ Daniel Levitin sa spojili na Svetovom festivale vedy v roku 2009, aby ukázali, ako sú naše mozgy napojené na hudbu.

V tomto klipe McFerrin „hrá“ publikum s pentatonickou mierkou:


Príbehy pravekého ľudského genómu

Po šialených ťahaniciach výskumníci dokončili hrubý návrh ženského neandertálskeho genómu, ktorý ponúkne nový pohľad na Homo sapiens ako aj naši vymretí bratranci.

Po šialenom súboji vedci dokončili hrubý návrh ženského neandertálskeho genómu, ktorý ponúkne nový pohľad na Homo sapiens rovnako ako naši vyhynutí bratranci

Dve neandertálske ženy, možno podobné tej, ktorá tu bola zrekonštruovaná, požičali svoju starodávnu DNA projektu genómu.

Pol gramu sotva presahuje poštovú váhu. Ale z neandertálskej fosílie je to obrovský kus neoceniteľného materiálu. Chorvátsky geológ Ivan Gušić sa však ochotne vzdal hazardu, že 38 000 rokov staré kosti z jaskyne v severozápadnom Chorvátsku by mohli pomôcť nahliadnuť do neandertálskeho genómu. Tento týždeň vedci oznámili, že Gušićov hazard sa vyplatil: Prvýkrát sa pozreli na 3 miliardy báz neandertálskej DNA a pohľad, aj keď je stále hmlistý, je veľkolepý. Paleogenetik Svante Pääbo z Inštitútu Maxa Plancka pre evolučnú antropológiu v nemeckom Lipsku a jeho kolegovia zostavili veľmi hrubý návrh tohto genómu, uviedli na tlačovej konferencii v Lipsku a v príhovore na výročnom stretnutí Americkej asociácie pre rozvoj vedy (Veda's publisher) v Chicagu, Illinois, tento týždeň.

Pretože Homo neanderthalensis je členom ľudskej rodiny, je nám oveľa bližší ako šimpanzi, porovnanie neandertálskej DNA s našou vlastnou odhalí genetické zmeny, ktoré definujú, kým sme, a tiež iný spôsob, ako byť človekom. Pääbo hovorí, že sa nevie dočkať, kedy sekvenciu prechladí prostredníctvom svojich počítačov. "Budeme mať v rukách tvrdé údaje o tom, aké zmeny nukleotidov nastali v našej [línii]." Tieto zmeny sú genetickým základom toho, čo robí náš druh jedinečným, alebo „tým, čo skutočne robí moderných ľudí modernými“, ako uvádza paleoantropológ Jean-Jacques Hublin z Maxa Plancka. Počiatočné porovnania s našimi vlastnými 3 miliardami báz naznačujú, že túto prácu robí iba 1000 až 2000 rozdielov v aminokyselinách, ako aj zatiaľ neznámy počet nekódujúcich zmien. Na porovnanie nás a šimpanzov delí asi 50 000 rozdielov aminokyselín.

Viac než len ďalší genóm, ktorý možno pridať k genómu šimpanza, makaka a niekoľkých moderných ľudí, tento staroveký genóm predstavuje „filozofický bod obratu v našom chápaní nás samých a našej evolúcie,“ hovorí Carles Lalueza-Fox, paleogenetik z univerzity. z Barcelony v Španielsku. Čin, ktorý by pred 5 rokmi vyžadoval veľa gramov materiálu a mnohonásobok 6,4 milióna dolárov, ktoré stálo jeho dosiahnutie, projekt sekvenovania „upozorňuje na takmer neobmedzené príležitosti, ktoré vytvárajú moderné metódy sekvenovania“, dodáva genetik populácie Montgomery Slatkin z Kalifornská univerzita (UC), Berkeley.

Oznámenie prichádza viac ako desať rokov po tom, čo Pääbo prvýkrát ukázal, že je možné získať DNA z fosílií vyhynutých neandertálcov, ktorí žili v Európe pred najmenej 350 000 až 30 000 rokmi. „Len pred desiatimi rokmi sme dúfali, že možno niekedy uvidíme genóm šimpanza. V tej dobe sme si ani nepredstavovali možnosť vidieť neandertálsky genóm, “hovorí Ajit Varki z UC San Diego. "Je fascinujúce získať prvý pohľad na genóm našich najbližších vyhynutých evolučných bratrancov, ktorí boli tak podobní a predsa tak odlišní od nás."

Genóm je zostavený z troch úlomkov kostí končatín z jaskyne Vindija, ktoré sa ukázali ako z dvoch samíc. So zverejnením a zverejnením údajov, ktoré sa očakáva v nasledujúcich 6 mesiacoch, naša schopnosť skúmať molekulárne detaily ľudskej evolúcie môže explodovať. Nové údaje zatiaľ naznačujú, že sa ľudské a neandertálske línie začali líšiť pred 800 000 rokmi, v súlade s najnovšími odhadmi čiastočných genomických údajov, informoval Pääbo na tlačovej konferencii. Skoré analýzy nepriniesli žiadne známky introgresie moderných génov do neandertálskej sekvencie, čo podporuje myšlienku, že neandertálci sa nekrížili s modernými ľuďmi počas tisícok rokov, keď tieto dva druhy zdieľali územie v Európe (pozri str. 870).

V súčasnej dobe nie je dostatok sekvencie na to, aby ste urobili viac, ako urobiť hrubý náčrt neandertálcov. „Očakáva sa veľa medzier a chýb,“ hovorí Lalueza-Fox. Aby si boli sekvencia sekvencií istá, sekvencéry musia určiť každú bázu na každom mieste viackrát - a Pääbo má iba dostatok sekvencií na jednorazové pokrytie genómu. Celkovo tím sekvenoval 3 miliardy báz, čo nie je dĺžka celého genómu. Niektoré bázy boli však sekvenované opakovane a niektoré miesta boli úplne vynechané. Spolu Pääbo odhaduje, že pokryli 60 % celého genómu.

"Existujú podstatné obmedzenia užitočnosti genómu s nízkym pokrytím," hovorí Chris Ponting, genomik z Oxfordskej univerzity v Spojenom kráľovstve. "[Poskytuje] iba lákavé výskumné zvody, ktoré bude vždy potrebné overiť podrobnejším sekvenovaním, často z iných fosílií." To je dôvod, prečo iné skupiny hľadajú neandertálsku DNA pre svoje vlastné projekty (pozri str. 868). Pretrvávajú tiež obavy z kontaminácie modernou ľudskou DNA, ktorá sa môže ľahko maskovať ako neandertálsky materiál, pretože tieto dva genómy sú si veľmi podobné.

Pääbo hovorí, že práve začína. "1 × je skutočne len míľnik," poznamenáva. "Našou ambíciou je pokračovať a produkovať neandertálsky genóm v kvalite porovnateľnej napríklad s genómom šimpanza, počas niekoľkých nasledujúcich rokov."


3. Výsledky a diskusia

3.1 Kinetika inaktivácie

Obr Inaktivačné krivky pre MS2 (červené kruhy), ΦX174 (zelené diamanty), T4 (žlté štvorce) a HAdV (modré trojuholníky) v uloženom moči (U12), kale (S2) a hnoji (M4). Kompletný súbor inaktivačných kriviek získaných v tejto štúdii je uvedený v ESI † (obr. S2 a S3).

Kinetika inaktivácie prvého poriadku pozorovaná v tomto texte naznačuje, že podmienky roztokov boli v priebehu inaktivačných experimentov stabilné. Zodpovedajúcim spôsobom charakterizácia zloženia skladovaného moču v priebehu času ukázala, že koncentrácie pH aj iónov boli stabilné pri skladovaní pri 20 ° C alebo 35 ° C. V prípade kalov a hnoja sa však pozorovali zmeny v podmienkach roztoku (ESI,† tabuľka S3). Napríklad v prípade kalu (S2) sa koncentrácia TAN zdvojnásobila v priebehu 14 dní a koncentrácie Ca 2+ , Mg 2+ , SO4 2− klesol viac ako dvojnásobne, zatiaľ čo pH a ďalšie ióny boli v prípade hnoja (M1) stabilné, pH sa zvýšilo zo 7,58 na 8,0 a TIC sa zdvojnásobil, zatiaľ čo ostatné ióny boli stabilné. Účinok meniacich sa podmienok roztoku na inaktiváciu však zostal malý: predpokladané konštanty rýchlosti inaktivácie MS2 (pozri časť 2.6) sa počas trvania experimentu líšili o menej ako faktor 1,4 pre väčšinu matríc (pozri ESI, † tabuľka S3 ). V dôsledku toho sa pre akúkoľvek následnú analýzu použil priemer počiatočného a konečného zloženia pre S2, S3, M1, M2 a M3 (tabuľky 1 a S1†) pre S1 a M4, hodnotilo sa iba zloženie v počiatočnom čase.

3.2 Validácia predpovede inaktivácie MS2 v uskladnenom moči, kaloch a hnoji

Obr Porovnanie nameraných a predpovedaných konštánt rýchlosti deaktivácie MS2 pre uskladnený moč, kal a hnoj. Na porovnanie sú zobrazené aj údaje z laboratórnych roztokov (Decrey et al. 15 sivých krúžkov). Hodnoty k pred boli určené z rovnice (3) a (4). Plná čiara predstavuje vzťah 1: 1 medzi meraním a predikciou (k pred/ k obs = 1). Prerušované čiary označujú 80% a 120% k pred/ k obs (t.j. k pred/ k obs = 0,8, respektíve 1,2). Vložka zobrazuje k pred oproti k obs na rôzne riedenia moču. Pre každý údajový bod je uvedený pomer moč:voda.

Bola vykonaná analýza citlivosti modelu na vyhodnotenie vplyvu pH a teploty a zahrnutia nameraných koncentrácií iónov do modelu na presnosť predikcie (obr. S4 †). Konkrétne sme prehodnotili predikciu modelu pre všetkých 22 vzoriek buď pri hodnotách pH 0,1 jednotky okolo nameranej hodnoty, alebo pri teplotách 1 °C okolo nameranej teploty. Okrem toho sa uskutočnili predpovede, ktoré zahŕňali iba TAN alebo TIC a TAN, ale žiadny z ostatných iónov v roztoku. Táto analýza odhalila podobnú citlivosť na posuny vyplývajúce zo zmien pH o 0,1 jednotky a zo zmien teploty o 1 ° C (obr. S4 a tabuľka S2 †). Relatívne malá chyba v meraní môže teda viesť k nepresnému k pred. Je zaujímavé, že ak boli v predikcii zohľadnené všetky ióny, neboli pozorované žiadne relevantné rozdiely v porovnaní iba s TIC a TAN (obr. S4 a tabuľka S2 †). Merania teploty, pH, TIC a TAN sú teda dostatočné na získanie primerane presnej predpovede rýchlostných konštánt MS2. Odstránenie TIC z predikcie viedlo k nižšej presnosti (obr. S4 a tabuľka S2 †). To zdôrazňuje dôležitosť uhličitanu pri inaktivácii MS2 v HEAM. Uhličitan a bikarbonát sa podieľali na celkovom k medzi 15 až 40% obs v uloženom moči, kale a hnoji (obr. 3). Príspevok druhov uhličitanov bol ešte vyšší (> 50%) v kale S2, ktorý mal pH <8,0 a ekvivalentné množstvá TIC a TAN.

Obr Príspevok hlavných zásad prítomných v uskladnenom moči, kaloch a hnoji ku k pred MS2. Nameraná k obs je znázornená červenou hviezdičkou.

3.3 Vplyv parametrov spojených s HEAM na inaktiváciu MS2

Obr Konštanty rýchlosti inaktivácie MS2 určené pri 35 ° C v zriedenom, surovom alebo upravenom moči 1: 9. Modifikáciami boli filtrácia a zahrievanie na odstránenie mikrobiálnej alebo enzymatickej aktivity (zelená) a pridanie EDTA ku komplexným kovovým iónom (oranžová). Tiež sú uvedené rýchlostné konštanty v surovom moči k obs (žltá) a predpokladaná rýchlostná konštanta k pred (sivá). k normou zodpovedá pomeru k obs stanovené v upravených vzorkách moču a k obs v surovom zriedenom moči 1: 9 (žltý). Chybové úsečky zobrazujú 95 % interval spoľahlivosti spojený s k norma.

Úloha kovových iónov nebola explicitne študovaná v kaloch a hnoji. Napriek tomu literárne správy uvádzajú, že najmä hnoj obsahuje katióny kovov až do mmol L −1 rozsah koncentrácie. 38, 39 Je teda rozumné dospieť k záveru, že kovové ióny v týchto matriciach tiež prispievajú k inaktivácii MS2.

3.4 Vplyv typu genómu a mikrobiálnej aktivity na kinetiku inaktivácie vírusu v moči, kaloch a hnoji

Ako sa očakávalo, vírus ssRNA MS2 bol inaktivovaný rýchlejšie ako DNA vírusy vo väčšine matríc (obr. 1 a ESI † tabuľka S2). To potvrdilo vyššiu citlivosť ssRNA vírusov na NH3 a mierne zásadité pH. V nezriedenom skladovanom moči pri 35 °C (U12) štyri log10 (99,99%) inaktivácia bola dosiahnutá do jedného dňa pre MS2, pričom dosiahnutie rovnakej úrovne inaktivácie pre T4 trvalo viac ako 100 dní. V kale a hnoji boli rozdiely medzi ssRNA a DNA vírusmi menšie, so štyrmi logaritmami10 strata bola dosiahnutá do 15 a 207 dní v kale (S2) a 3,5 a 40 dní v hnoji (M4) pri 35 ° C pre MS2 a T4. Možným dôvodom užšieho rozsahu kinetiky inaktivácie medzi vírusmi ssRNA a DNA v kaloch a hnoji je príspevok mikrobiálnej alebo enzymatickej aktivity k inaktivácii. Hoci mikrobiologická inaktivácia nie je relevantná pre MS2 v porovnaní s jeho rýchlou chemickou inaktiváciou (pozri časť 3.3.1), môže urýchliť inaktiváciu DNA vírusov nad rámec kinetiky pomalej chemickej inaktivácie v HEAM, najmä v matriciach s vysokou mikrobiologickou aktivitou.

V súlade s našimi predchádzajúcimi zisteniami bol HAdV najľahšie inaktivovaný spomedzi DNA vírusov a bol odolnejší ako MS2 v skladovanom moči (U4) pri pH 8,2 a približne 20 mmol L. −1 NH3 a v hnoji (M4) (obr. 1 a ESI † tabuľka S2). Avšak v skladovanom moči s vyšším pH a NH3 obsahu (U12) a v kaloch (S2) sa inaktivácia HAdV zvýšila, čo viedlo k podobným väčším konštantám rýchlosti inaktivácie v porovnaní s MS2 (obr. 1 a ESI† tabuľka S2). Porovnanie s kontrolovanými roztokmi podobných fyzikálno -chemických vlastností odhalilo, že pH by mohlo zodpovedať za rýchlu inaktiváciu pozorovanú v U12 (obr. 5). Na rozdiel od toho inaktiváciu v S2 nebolo možné vysvetliť známymi fyzikálno-chemickými parametrami, čo naznačuje potenciálny príspevok mikrobiologických procesov.

Obr Porovnanie inaktivácie vírusu v laboratórnom roztoku (sivé stĺpce), uskladneného moču (U4 [pH 8,0, 20 mmol L −1 NH3], U12 [pH 9,0, 80 mmol L −1 NH3]), kal (S2) a hnoj (M4) pri 35 °C. Kinetika v laboratórnom roztoku (zľava doprava: tlmivý roztok fosfátového uhličitanu [pH 8,0, 50 mmol L −1 uhličitan, 60 mmol L −1 fosfát] a uhličitan amónny [pH 8,0, 50 mmol L −1 uhličitan, 20 mmol L −1 NH3]) boli odvodené od Decrey et al. , 16 okrem HAdV pri pH 9,0 (fosfátový pufer [pH 9,0, 50 mmol L −1 uhličitan, 40 mmol L −1 fosfát]). Presné rýchlostné konštanty pre U4, U12, S2 a M4 sú uvedené v tabuľke S2. † Pre ΦX174 a T4 v M4 stĺpce s diagonálnymi vzormi znázorňujú k obs_slow. Chybové pruhy zobrazujú 95% interval spoľahlivosti spojený s k obs.

Rýchlejšia inaktivácia, ako sa očakávalo, bola tiež pozorovaná pre ΦX174 a T4 v hnoji. Konkrétne tieto dva fágy vykazovali dvojfázové inaktivačné správanie v hnoji s počiatočnou rýchlou inaktiváciou, po ktorej nasledovala sekundárna, pomalšia fáza (ekv. (2) ESI,† Obr. S6). Pre oba fágy platí, že k obs_fast bol 4-5 krát väčší ako k obs_slow (Obr. 5, zelené pruhy) a k obs_slow spravidla zodpovedal k obs v kontrolovanom roztoku s rovnakými fyzikálno -chemickými vlastnosťami (obr. 5, sivé stĺpce). Prvý, rýchly pokles infekčného vírusu je teda spôsobený parametrami spojenými s maštaľným hnojom, ktoré nie sú prítomné v laboratórnych roztokoch, zatiaľ čo druhú, pomalšiu fázu možno pripísať iba účinku podmienok roztoku. Navrhujeme, aby dvojfázová kinetika inaktivácie bola spojená s adsorpciou vírusu na hnoj. Konkrétne, zatiaľ čo ireverzibilnú adsorpciu je možné vylúčiť ako mechanizmus odstraňovania (vzhľadom na vysokú výťažnosť infekčného vírusu v našom experimentálnom protokole nájdete v časti Materiály a metódy), adsorpcia na pevné látky môže viesť k ochrane vírusov pred mikrobiálnou a enzymatickou aktivitou. V rýchlej počiatočnej inaktivácii by teda mohla dominovať mikrobiologická inaktivácia suspendovaných vírusov, zatiaľ čo pomalšia fáza je dôsledkom fyzikálno -chemickej inaktivácie vírusov adsorbovaných na pevné látky. Táto hypotéza je v súlade so zisteniami iných, ktoré demonštrujú rýchlejšiu inaktiváciu v kvapalnej ako v pevnej frakcii vírusu počas anaeróbnej digescie 42 a v odpadovej vode. 43

Mikrobiologické príspevky k inaktivácii vírusov boli predtým hlásené pre HAdV, vírus hepatitídy A, norovírus a enterovírusy v rade typov matríc. 33,44–51 In most cases, inactivation could only be partly attributed to biological processes, whereas physical–chemical matrix components also played a role. Unfortunately, the matrix composition was usually poorly characterized, and it is therefore difficult to parameterize its influence in inactivation. It appears, however, that the most important matrix components and their resulting virucidal activities vary widely depending on both the matrix and virus type. For example, it was shown that septic tank effluent digestion was more efficient at inactivating viruses when mixed with dairy cattle or swine manure slurry. 50,51 The same authors observed that among 31 bacterial strains isolated from animal manure, only 10 proved to be efficient at inactivating virus. Here, we propose inactivating microbial or enzymatic activity in sludge but not in manure for HAdV, in manure but not in sludge for T4, and in both for ΦX174 (Fig. 5). The distinct matrix and virus parameters that result in inactivation, however, remain to be determined.

The complex nature of virus inactivation in real matrices is further reflected in the literature, where a large variation in virus inactivation kinetics in excreta is reported. Consequently, results contradicting our data can be found: for example, others have shown ΦX174 to be inactivated as fast as MS2 in stored urine 12 and stored fecal sludge, 14 and HAdV to be inactivated faster than MS2 in fecal sludge. 52 Similarly, ssRNA phage f2 and coxsackievirus exhibited comparable inactivation to rotavirus (dsRNA) during mesophilic anaerobic digestion of sludge with, albeit at low pH (

7.3). 53 On the other hand, other studies provided observations consistent with our data. For example, F-RNA specific coliphages were shown to be more sensitive than somatic (DNA) coliphage and dsDNA Salmonella phage 28B during mesophilic digestion of raw sewage sludge 54 and the organic fraction of municipal solid waste. 55 Furthermore, somatic coliphages were found to exhibit low sensitivity to the addition of urea, calcium carbonate and sodium percarbonate used to sanitize composted sewage sludge, which is consistent with our finding that ΦX174 and T4 are not affected by the main chemical components of stored urine and sludge. 56 Overall, the influence of solids content on the inactivation of different virus types remains poorly understood and needs to be further elucidated. In particular, more research is needed on matrices with lower liquid fractions, such as fecal sludge (solids content between 20–95% (ref. 14)).


Present address: uBiome, San Francisco, CA, USA

Present address: Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA

Present address: University of Toronto, Toronto, Canada

Afiliácie

Systems Biology, Sandia National Laboratories, Livermore, CA, USA

Raga Krishnakumar, Anupama Sinha & Joseph S. Schoeniger

Advanced Systems Engineering & Deployment, Sandia National Laboratories, Livermore, CA, USA

Harikrishnan Jayamohan, Harrison S. Edwards, Kamlesh D. Patel & Michael S. Bartsch

Biomass Science and Conversion Technology, Sandia National Laboratories, Livermore, CA, USA

Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, Livermore, CA, USA

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Tento autor môžete tiež vyhľadať v službe PubMed Google Scholar

Príspevky

R.K. and M.S.B. conceived of the project. R.K. performed the data analysis and generated all the figures. A.S., S.S.B., S.W.B., H.J. and H.S.E. were involved in sample and library preparation and running the experiments. J.S.S. and K.D.P. were involved in establishing nanopore sequencing at Sandia National Labs. R.K. wrote the manuscript with comments from M.S.B., S.S.B. and H.J.

Corresponding authors


Pozri si video: mRNA Modification: Tailing, Capping and Splicing (November 2022).