Informácie

Reštrikčné endonukleázy sa nachádzajú v?

Reštrikčné endonukleázy sa nachádzajú v?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Citácia z: Scientific American Júl 1975 Manipulácia s génmi Stanley Cohen:

Reštrikčné endonukleázy (a modifikačné metylázy) sú rozšírené v mikroorganizmoch; gény pre tvorby boli nájdené na vírusové chromozómy a extrachromozomálna plazmidová DNA, ako aj na mnohých bakteriálnych chromozómoch.

Prečo by sa gény na tvorbu RE nachádzali na vírusových chromozómoch? Tiež by ste mohli uviesť niekoľko príkladov, kde sa nachádzajú na plazmidoch?


Existuje mnoho návrhov na ekologickú úlohu systémov reštrikčných modifikácií (RM) a prečo by existovali na mobilných genetických prvkoch (napríklad plazmidoch a vírusoch). V tomto prípade konkrétne hovorím o vírusoch, ktoré infikujú baktérie (aka bakteriofág).

1) RM systémy môžu mať antivírusovú funkciu. Normálne by sme o takýchto systémoch mysleli, že sú súčasťou hostiteľského chromozómu, ale ako naznačil Alan Boyd, akonáhle sa mierny fág integruje do chromozómu, jeho spôsobilosť je viazaná na jeho hostiteľa. Preto by RM systém nachádzajúci sa v profágu mohol zabrániť infekciám ďalším fágom. Diskusiu k tomuto problému nájdete tu: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23471617

2) RM systémy môžu mať „návykové“ vlastnosti tým, že pôsobia ako systémy toxín-antitoxín. V zásade to znamená, že ak sa stratia gény pre systém RM, hostiteľská bunka zomrie. To môže poskytnúť selekciu na udržanie plazmidov a profágovanie vo vnútri hostiteľskej bunky. Diskusiu k tomuto problému nájdete tu: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3874152/

3) Nakoniec, vírusy potrebujú zničiť hostiteľský genóm – ako na potlačenie akejkoľvek antivírusovej reakcie, tak aj na uvoľnenie živín na replikáciu vírusu. Aj keď sa to typicky dosahuje inými nukleázami ako reštrikčnými endonukleázami, existuje aspoň jedna situácia, v ktorej sa zdá, že je zapojená RE. Toto je diskutované v prvom odkaze vyššie (pozri časť s názvom "Úloha vo výžive")


Ak máte genóm dsDNA a replikujete ho valcovaním kruhov, ako to robí väčšina bakteriofágov a mnohé plazmidy, je endonukleáza do značnej miery nevyhnutnosťou.


Známy reštrikčný enzým EcoRI je kódovaný plazmidom.

Betlach a kol. (1976) Analýza restrikčných endonukleáz bakteriálneho plazmidu riadiaca restrikciu EcoRI a modifikáciu DNA. Fed. Proc. 35:2037 - 43.

Príklad systému kódovaného fágom nájdete v:

Dempsey a kol. (2005) Sau421, restrikčný modifikačný systém podobný BcgI kódovaný štvornásobne konvertujúcim fágom Phi42 Staphylococcus aureus. Microbiology 151: 1301-1311

Tento druhý dokument navrhuje odpoveď na otázku, prečo by fág mal mať takýto systém: lyzogény Phi42 sú odolné voči infekcii všetkými 23 členmi štandardného súboru S. aureus fágy. Akonáhle je fág lysogenizovaný, je v jeho záujme zabrániť lýze svojho hostiteľa.


Systém modifikácie obmedzenia

The systém modifikácie obmedzení (RM systém) sa nachádza v baktériách a iných prokaryotických organizmoch a poskytuje obranu pred cudzou DNA, ako je tá, ktorú nesú bakteriofágy.

Baktérie majú reštrikčné enzýmy, tiež nazývané reštrikčné endonukleázy, ktoré štiepia dvojvláknovú DNA v špecifických bodoch na fragmenty, ktoré sú potom ďalej degradované inými endonukleázami. To zabraňuje infekcii účinným zničením cudzej DNA zavedenej infekčným agensom (napr. Bakteriofágom). Približne jedna štvrtina známych baktérií má systémy RM a z tých asi polovica má viac ako jeden typ systému.

Pretože sekvencie rozpoznávané reštrikčnými enzýmami sú veľmi krátke, baktéria samotná bude takmer určite obsahovať nejaké vo svojom genóme. Aby sa zabránilo deštrukcii vlastnej DNA reštrikčnými enzýmami, sú pridané metylové skupiny. Tieto modifikácie nesmú interferovať s párovaním báz DNA, a preto je na každom vlákne obvykle modifikovaných iba niekoľko špecifických báz.

Endonukleázy štiepia vnútorné/nekoncové fosfodiesterové väzby. Robia tak až po rozpoznaní špecifických sekvencií v DNA, ktoré sú zvyčajne dlhé 4-6 párov báz a sú často palindromické.


Reštrikčné endonukleázy sa používajú na in vitro syntézu DNA syntetizovanú baktériami ako súčasť ich obranného mechanizmu.

Reštrikčné endonukleázy sa používajú na in vitro syntézu DNA syntetizovanú baktériami ako súčasť ich obranného mechansimu prítomného v bunkách cicavcov na degradáciu DNA, keď bunka zomrie, použitá v genetickom inžinierstve na ligáciu dvoch molekúl DNA

Biotechnológia: Princípy a procesy

d. Produkt con 143. Prvá klinická génová terapia bola poskytnutá v roku 1990 štvorročnému dievčaťu trpiacemu SCID. Proces zahŕňal a. Prenos génu ADA do krvi b. Liečba enzýmovou substitučnou terapiou c. Zavedenie funkčnej ADAC-DNA (pomocou retrovírusového vektora) do lymfocytov pacienta, ktoré sa následne vrátia pacientovi d. Prenos génu ADA metódou DNA vakcíny

Biotechnológia: Princípy a procesy

S 36. Ktoré enzýmy/enzýmy budú produkované v bunke, v ktorej je v géne lac Y nezmyselná mutácia? (1) Laktózová permeáza a transacetyláza (2) ß-galaktozidáza (3) Laktózová permeáza (4) Transacetyláza

Biotechnológia: Princípy a procesy

Ktoré z nasledujúcich iónov stimulujú rýchle uvoľňovanie elektrónov z vody? (1) Mg++ (2) Cat+ (4) Mn++ (3) CH-


Obmedzenie a modifikácia DNA

Rozmanitosť a evolúcia

Enzýmy R-M je možné rozdeliť do modulov. MTáza typu II obsahuje TRD a modul, ktorý je zodpovedný za katalyzáciu prenosu metylovej skupiny z AdoMet do definovanej polohy na príslušnej báze. Katalytické domény zdieľajú sekvenčné podobnosti a tieto sú najpodobnejšie, keď je katalytická reakcia rovnaká, to znamená, že poskytuje rovnaký produkt (napr. 5 mC). Vzhľadom na zodpovedajúce špecifickosti príbuznej ENázy a MTázy by sa dalo očakávať, že ich TRD budú mať podobnú sekvenciu aminokyselín. Nie je to tak, zdá sa pravdepodobné, že tieto dva enzýmy používajú rôzne stratégie na rozpoznanie svojej cieľovej sekvencie. Každá podjednotka dimérnej ENázy musí rozpoznať jednu polovicu rotačne symetrickej sekvencie, zatiaľ čo monomérna MTáza musí rozpoznať celú sekvenciu. Absencia podobnosti medzi TRD ENázy a jej príbuznej MTázy naznačuje, že sa mohli vyvinúť z rôzneho pôvodu.

Reštrikčné enzýmy, ktoré rozpoznávajú rovnakú cieľovú sekvenciu, sa označujú ako izoschizoméry. Jednoduché očakávanie je, že TRD dvoch takýchto enzýmov by boli veľmi podobné. Nemusí to tak byť. Okrem toho sa nezdá, že by pozorované podobnosti korelovali s taxonomickou vzdialenosťou. Aminokyselinové sekvencie izoschizomérov HaeIII a NgoPII, ktoré sú izolované z baktérií v tom istom kmeni, vykazujú malú alebo žiadnu podobnosť, zatiaľ čo izoschizoméry FnuDI a NgoPII, ktoré sú izolované z baktérií v rôznych kmeňoch, sú veľmi podobné (59% identita).

Systémy R-M typu I sú komplexné v zložení a ťažkopádne vo svojom spôsobe účinku, ale sú vhodné na diverzifikáciu sekvenčnej špecifickosti. Jedna podjednotka (HsdS alebo S) udeľuje špecifickosť celému komplexu R-M a ďalšiemu menšiemu komplexu, ktorým je MTáza. Akákoľvek zmena špecifickosti súčasne ovplyvňuje obmedzenie a modifikáciu. V súlade s ich potenciálom vyvinúť nové špecifickosti existujú systémy typu I ako rodiny, v rámci ktorých sa členovia, napríklad EcoKI a EcoBI, líšia iba svojimi podjednotkami S. V súčasnej dobe sú alelické gény identifikované pre najmenej sedem členov jednej rodiny, pričom každý člen má inú špecificitu. Prekvapujúcejšie je zistenie, že alelické gény v E. colia jeho príbuzní tiež špecifikujú aspoň dve ďalšie rodiny enzýmov typu I. Zatiaľ čo členovia rodiny obsahujú vo svojich S polypeptidoch iba veľké sekvenčné rozdiely, v rôznych rodinách majú veľmi obmedzené sekvenčné identity (zvyčajne 18 - 30%). Rozdiely medzi génovými sekvenciami pre systémy R-M typu I očividne nenaznačujú fylogenetickú príbuznosť kmeňov, ktoré ich kódujú. Je zaujímavé poznamenať, že napriek všeobecnej absencii sekvenčných podobností medzi členmi rôznych rodín enzýmov typu I boli identifikované výrazné podobnosti pre TRD z rôznych rodín, keď poskytujú rovnakú sekvenčnú špecificitu.

Informácie zo sekvencií génov pre systémy typu I a typu II, ako uviedli Raleigh a Brooks v roku 1998, „poskytujú obraz skupiny génov, ktoré cirkulujú s niekoľkými taxonomickými obmedzeniami veľmi dlhú dobu“.

Alelická variabilita je jednou z najvýraznejších vlastností systémov typu I R-M. Bipartitná aj asymetrická povaha cieľovej sekvencie ponúka väčší priestor pre diverzitu sekvenčnej špecifickosti ako symetrické rozpoznávacie sekvencie systémov typu II. Podjednotka S enzýmov typu I obsahuje dve TRD, z ktorých každá špecifikuje jednu zložku cieľovej sekvencie. Táto organizácia domén robí podjednotku vhodnou na generovanie nových špecifík ako dôsledkov buď nových kombinácií TRD alebo menších zmien v medzere medzi TRD. V prvom prípade rekombinácia iba preskupí oblasti špecifikujúce TRD a v druhom prípade nerovnaké prekríženie v rámci krátkej duplicitnej sekvencie vedie k zmene rozstupu medzi TRD. Oba tieto procesy sa vyskytli v laboratóriu náhodou, ako aj zámerne. Ochrana nemodifikovaných cieľových sekvencií v hostiteľskom chromozóme zmiernením reštrikcie zvyšuje príležitosť na zmeny v špecifickosti.

Zatiaľ čo mnoho baktérií zachováva úzke prepojenie troch génov systémov R-M typu I (hsdR, hsdMa hsdS Obrázok 2 ), bolo opísaných množstvo baktérií, ktoré obsahujú viacero kópií hsdS ktoré sú fázovo premenné. Miešanie sekvencií DNA, ktoré kódujú TRD rôznych proteínov HsdS, poskytuje dynamický spôsob rôznej špecifickosti. V Mycoplasma pulmonis, existujú dva príklady „shufflonov“, systémov, ktoré sa rekombinujú hsdS gény. Oba šufflony obsahujú hsdR a hsdM gény lemované dvoma hsdS gény, ktoré sú navzájom obrátené. Rekombinácia medzi týmito dvoma kópiami hsdS môže generovať štyri rôzne cieľové špecifickosti. V genóme ľudského komenzálu existuje zložitejší šufflon Bacteroides fragilis, ktorý obsahuje an hsd lokus so schopnosťou generovať osem proteínov HsdS s rôznymi špecifickosťami.

V prípade systémov R-M typu I môže zámena alebo premiestnenie domén vytvoriť enzýmy s novými špecifickosťami, ale vývoj nových TRD s rôznymi špecifickosťami nebol svedkom. V jednom experimente silná selekcia na zmenu, ktorá umožnila degeneráciu v jednej zo siedmich polôh v cieľovej sekvencii, nepriniesla mutanty s uvoľnenou špecificitou.


11.1: Reštrikčné endonukleázy

  • Príspevok Clare M. O & rsquoConnor
  • Emeritný docent (biológia) na Boston College

Bakteriálne reštrikčné/modifikačné systémy chránia pred útočníkmi

Objav reštrikčných enzýmov alebo reštrikčných endonukleáz (RE) bol kľúčový pre vývoj molekulárneho klonovania. RE sa prirodzene vyskytujú v baktériách, kde špecificky rozpoznávajú krátke úseky nukleotidov v DNA a katalyzujú prerušenia dvojvlákien v alebo v ich blízkosti.
rozpoznávacie miesto (tiež známe ako restrikčné miesto). K dnešnému dňu boli opísané tisíce RE s odlišnými špecifikami. Možno sa čudujete, prečo baktérie obsahujú tieto potenciálne deštruktívne enzýmy. RE sú súčasťou systému bakteriálnej obrany proti cudzej DNA, ako je infekčný bakteriofág. RE miesta v DNA vlastnej baktérie sú chránené pred štiepením, pretože boli modifikované metyltransferázou, ktorá špecificky modifikuje RE miesta. Kombinované aktivity endonukleázy a metyltransferázy sa označujú ako reštrikčný/modifikačný systém. Dnes väčšina komerčne dostupných RE nie je purifikovaná z ich prirodzených zdrojov. Namiesto toho sa RE zvyčajne izolujú z baktérií, ktoré nadmerne exprimujú veľké množstvá RE z plazmidov. Tieto rekombinantné RE boli často navrhnuté molekulárnymi biológmi tak, aby zahŕňali zmeny aminokyselín, ktoré zvyšujú katalytickú aktivitu alebo stabilitu RE.

Aby sme pochopili, ako RE fungujú, použijeme ako príklad EcoRI, jedno z najlepšie preštudovaných RE. Napriek tomu, že názvy jednotlivých RE môžu znieť trochu ako rozprávanie dieťaťa, nomenklatúra je v skutočnosti veľmi systematická a vychádza z jej biologického zdroja. EcoRI sa prirodzene nachádza v kmeni RY13 Escherichia coli. Jeho názov začína rodom a druhom (Eco pre E. coli), za ktorým nasleduje identifikátor kmeňa (R pre RY13) a končí rímskou číslicou, ktorá rozlišuje rôzne RE nachádzajúce sa v kmeni. Kmeň RY13 z E. coli obsahuje viacero RE, ale iba EcoRI a EcoRV sa široko používajú v molekulárnej biológii.

Reštrikčné enzýmy štiepia špecifické miesta v DNA

Reštrikčné enzýmy ako EcoRI sa často nazývajú 6-cutter, pretože rozpoznávajú 6-nukleotidovú sekvenciu. Za predpokladu náhodnej distribúcie A, C, G a Ts v DNA pravdepodobnosť predpovedá, že rozpoznávacie miesto pre 6-cutter by sa malo vyskytnúť približne raz na každých 4096 bp (4 6 ) v DNA. Distribúcia nukleotidov v DNA samozrejme nie je náhodná, takže skutočné veľkosti fragmentov DNA produkovaných EcoRI sa pohybujú od stoviek do tisícov párov báz, ale priemerná veľkosť sa blíži 4000 bp. Fragmenty DNA tejto dĺžky sú užitočné v laboratóriu, pretože sú dostatočne dlhé na to, aby obsahovali kódujúcu sekvenciu pre proteíny a sú dobre rozlíšené na agarózových géloch.

EcoRI rozpoznáva sekvenciu G A A T T C v dvojvláknovej DNA. Táto rozpoznávacia sekvencia je palindróm s dvojnásobnou osou symetrie, pretože čítanie z 5 & rsquo do 3 & rsquo na každom vlákne špirály poskytuje rovnakú sekvenciu. Palindromická povaha reštrikčného miesta je zrejmejšia na obrázku nižšie. Bodka v strede reštrikčného miesta označuje os symetrie. EcoRI katalyzuje hydrolýzu fosfodiesterových väzieb medzi G a A na oboch reťazcoch DNA. Reštrikčné fragmenty generované v reakcii majú krátke jednovláknové konce na 5'-koncoch. Tieto konce sú často označované ako & ldquosticky konce, & rdquo kvôli ich schopnosti vytvárať vodíkové väzby s komplementárnymi sekvenciami DNA.

RE sa niekedy označujú ako molekulové nožnice, pretože majú schopnosť vytvárať reštrikčné fragmenty, ktoré končia definovanými sekvenciami. Tieto „lepivé konce“ sú dôležité pre technológiu rekombinantnej DNA, pretože umožňujú výskumníkom konštruovať dizajnérske molekuly DNA. Akékoľvek dve molekuly DNA s kompatibilnými lepivými koncami môžu byť spojené dohromady DNA ligázami, ktoré slúžia ako & ldquopaste & rdquo opätovným uzavretím prerušených fosfodiesterových väzieb. V tejto triede nebudeme generovať rekombinantné molekuly, ale je dôležité pochopiť ich význam pre modernú biológiu. Zvážte plazmidy pBG1805 a pYES2.1. Z plazmidových máp v kapitole 10 môžete vidieť, že tieto komplexné plazmidy boli skonštruované spojením sekvencií DNA z evolučne odlišných zdrojov.


Úvod

Reštrikčné enzýmy sa tiež nazývajú "molekulárne nožnice", pretože štiepia DNA v alebo v blízkosti špecifických rozpoznávacích sekvencií známych ako reštrikčné miesta. Tieto enzýmy urobia jeden rez na každom z dvoch reťazcov DNA a nazývajú sa tiež reštrikčné endonukleázy. 4

Vírusy infikujú hostiteľské bunky injekciou ich DNA do buniek. Táto vírusová DNA unesie mechanizmus hostiteľskej bunky na reprodukciu vírusového potomstva, čo má za následok smrť hostiteľskej bunky. Na prekonanie vírusovej infekcie vyvinulo mnoho baktérií a archea niekoľko mechanizmov. Hlavný ochranný mechanizmus zahŕňa použitie reštrikčných enzýmov na degradáciu inváznej vírusovej DNA jej štiepením na špecifických reštrikčných miestach. Hostiteľská bunka zároveň chráni svoju vlastnú DNA pred štiepením pomocou iných enzýmov nazývaných metylázy, ktoré metylujú adenínové alebo cytozínové bázy v rámci rozpoznávacích sekvencií hostiteľa. Pre každý z reštrikčných enzýmov hostiteľská bunka produkuje zodpovedajúcu metylázu, ktorá metyluje a chráni hostiteľskú DNA pred degradáciou. Tieto enzýmy tvoria systémy obmedzujúcej modifikácie (R-M).

Reštrikčné enzýmy katalyzujú hydrolýzu väzby medzi 3'-atómom kyslíka a atómom fosforu vo fosfodiesterovom hlavnom reťazci DNA. Enzýmy vyžadujú pre svoju aktivitu Mg 2+ alebo iné dvojmocné ióny.


Funkcia reštrikčného enzýmu

Funkciou obmedzujúceho enzýmu v prírodnom svete je obrana baktérií pred špecifickými vírusmi nazývanými bakteriofágy. Tieto vírusy napádajú baktérie vstreknutím vírusovej RNA alebo DNA do bakteriálneho plazmidu (malý, purpurový krúžok na obrázku nižšie) a tam sa replikujú. Ak sa vírusová RNA alebo DNA zistí v prokaryotickej bunke, táto bunka môže často zastaviť proces replikácie prerezaním cudzej genetickej informácie. Vďaka tomu je to zbytočné. Bakteriálna DNA je zároveň chránená pred rezným pôsobením svojich reštrikčných endonukleáz v rámci svojich reštrikčných miest. Tento mechanizmus pridáva metyl (H.3C) skupiny k cytozínu a adenínu bakteriálnej DNA bez ovplyvnenia kódovanej sekvencie DNA.

Doteraz bolo z bakteriálnych plazmidov izolovaných asi 3 500 reštrikčných enzýmov. Každý enzým rozpoznáva špecifickú sekvenciu vírusového genetického kódu a pokúsi sa oddeliť nový, mutovaný reťazec DNA blízko alebo ďalej od rozpoznávacieho miesta. Tento prirodzený separačný mechanizmus sa nazýva aj štiepenie reštrikčnými enzýmami.

Líšiť sa môže nielen miesto a spôsob, ale aj typ rezu. Niektoré RE nechávajú nerovnomerné lepkavé konce (netupé konce) medzi mierne odlišnými oblasťami dvojvlákna, ktoré prečnievajú, iné zanechávajú tupé konce, kde sú páry báz oddelené v rovnakom bode. Napríklad BamHI je reštrikčný enzým typu II získaný z Escherichia coli ktorý rozpoznáva nukleotidovú sekvenciu GGATCC a štiepi tieto úseky DNA zanechávajúc lepkavé konce. Štiepenie, podobne ako štiepanie kmeňa sekerou, je vedecky uznávaný termín na prerezanie vlákna DNA.

Na obrázku nižšie reštrikčný enzým nazývaný HindIII štiepi DNA v rôznych bodoch na dvoch vláknach, aby vytvoril lepkavý koniec.


História reštrikčných enzýmov

Na začiatku päťdesiatych rokov minulého storočia niekoľko výskumných tímov pozorovalo rozdiely v účinnosti bakteriofágovej infekcie na rôznych kmeňoch bakteriálnych hostiteľov rovnakého druhu [2,3]. Toto opísali Grasso a Paigen: Keď sa fág λ rozmnožil v jednom kmeni baktérií (napr. E. coli C) sa použil na infikovanie iného kmeňa rovnakého druhu baktérií (napr. E. coli K), bol zaznamenaný výrazný pokles rýchlosti infekcie v porovnaní s reinfekciou hostiteľského kmeňa (E. coli C). Nový hostiteľ (E. coli K) Zdá sa, že vyberá proti alebo „obmedzuje“ prichádzajúci fág. Výskumníci tiež poznamenali, že to nie je dedičný jav, pretože fág, ktorý rástol na novom kmeni, mohol infikovať tento kmeň typickejšou rýchlosťou po jednom kole infekcie. Pozorovaný jav bol definovaný ako „variácia kontroly hostiteľa“ a stal sa oblasťou intenzívneho výskumu s cieľom objaviť základné mechanizmy [4].

Až v 60. rokoch 20. storočia boli stanovené mechanizmy, ktoré sú základom variácií kontroly hostiteľa, aby zahŕňali enzymatické štiepenie fágovej DNA, čo viedlo k objavu a izolácii reštrikčných enzýmov. Začiatkom 60. rokov 20. storočia Werner Arber pozoroval, že determinant hostiteľského rozsahu sídli na fágovej DNA a následné experimenty ukázali, že metionín sa podieľa na ochrane hostiteľa [5]. Tieto zistenia v konečnom dôsledku viedli k návrhu systému reštrikčnej modifikácie (RM), v ktorom reštrikčný enzým a metyláza z hostiteľa spolupracujú na štiepení cudzej vírusovej (nemetylovanej) DNA, pričom hostiteľskú DNA chránia metyláciou [6. ].

Je zaujímavé, že väčšina skorých prác na systémoch R-M sa týkala skupín reštrikčných enzýmov typu I a III, klasifikovaných na základe aspektov ich štruktúry a funkcie (pozri Klasifikácia reštrikčných enzýmov). Úplná užitočnosť reštrikčných enzýmov však nebola zrejmá, kým Kent Wilcox a Hamilton Smith neobjavili HindII, prvý reštrikčný enzým triedy II [7]. HindII rozpoznáva špecifickú symetrickú sekvenciu DNA a štiepi sa definovaným spôsobom v rámci tejto rozpoznávacej sekvencie. Táto vlastnosť, ktorá sa nachádza vo väčšine raných reštrikčných enzýmov typu II, viedla Kathleen Danna a Daniel Nathans k použitiu HindII pri fyzickom mapovaní DNA opičieho vírusu 40 [8], čo je proces známy ako mapovanie reštrikčných enzýmov.

Daniel Nathans, Hamilton Smith a Werner Arber získali za priekopnícku prácu s reštrikčnými enzýmami Nobelovu cenu za fyziológiu alebo medicínu v roku 1978. S objavom DNA ligázy v kombinácii s rastúcou rodinou miestne špecifických rezacích reštrikčných enzýmov sa zrodila technológia rekombinantnej DNA.


Metylácia

Metylácia DNA je jedným z najbežnejších typov modifikácií DNA, ktoré sa nachádzajú v eukaryotoch aj prokaryotoch. V baktériách je súčasťou obranného systému reštrikčnej modifikácie (R-M) proti fágovej infekcii (pozri základy restrikčných enzýmov), pričom hostiteľské baktérie chránia vlastnú DNA pred štiepením svojimi endogénnymi reštrikčnými enzýmami. Metylácia sa bežne vyskytuje na zásadách cytozínu (C) a adenínu (A) a tvorí prevažne deriváty 5 -metylcytozínu (m5C), N4 -metylcytozínu (m4C) a N6 -metyladenínu (m6A).

DNA metyltransferázy riadia metylačnú reakciu prenosom metylovej skupiny z darcu na akceptorové bázy (napr. A a C). Medzi najbežnejšie typy DNA metyltransferáz nachádzajúcich sa v laboratórnych kmeňoch baktérií patria:

  • Priehrada: znamenať deoxyadenozín metyltransferáza a prevádza sekvenciu 5'-GATC-3 'na 5'-G (m 6A) TC-3'
  • Dcm: znamenať deoxycytozín metyltransferázu a konvertuje sekvenciu 5′-CCWGG-3′ na 5′-C(m 5C)WGG-3′ (kde W je buď A alebo T)
  • EcoKI: znamená systém Type I R-M v E. coli Kmeň K12 a modifikuje adenozíny v sekvencii 5'-AAC (N)6GTGC-3′
  • EcoBI: znamená systém Type I R-M v E. coli Kmeň B a modifikuje adenozíny v sekvencii 5'-TGA (N)8TGCT-3 '

V cicavčích a rastlinných systémoch je metylácia CpG alebo CpNpG bežnou modifikáciou DNA s implikáciami v biologických procesoch, vďaka čomu je hlavným zameraním epigenetických štúdií.

Citlivosť reštrikčných enzýmov na rozpoznávacie miesta metylovanej DNA závisí od reštrikčných enzýmov. Napríklad, ako je znázornené v Obrázok 4, Metylácia Dam pri GATC úplne blokuje Mbol, ale aktivuje DpnI. Na druhej strane metylácia CpG na 5'-CCGG-3' blokuje aktivitu HpaII, ale nemá žiadny vplyv na MspI. V niektorých prípadoch je aktivita reštrikčného enzýmu len čiastočne inhibovaná metyláciou (napr. Xhol).

Obrázok 4. Rôzna citlivosť reštrikčných enzýmov na metyláciu substrátovej DNA.

Pri množení plazmidov v baktériách je potrebné vziať do úvahy účinky metylácie na požadované reštrikčné enzýmy. Aby sa zabránilo metylácii na 5′-GATC-3′ a 5′-CCWGG-3′, kompetentné bunky, ktorým chýbajú Dam a Dcm metylázy (priehrada – /dcm -) by sa mali zvoliť na transformáciu plazmidu. Väčšina E. coli bunky nemajú CpG metylačný systém, takže CpG metylácia nie je problémom pre DNA izolovanú z baktérií. Ak sa genómová DNA extrahuje z rastlín a cicavcov, môže dôjsť k metylácii na miestach CpG a ovplyvniť priame reštrikčné štiepenie niektorými enzýmami citlivými na metyláciu.


Typy obmedzujúceho a modifikačného systému (R-M):

Enzýmy typu I:- Reštrikčné enzýmy typu I vykazujú reštrikčné aj DNA modifikačné aktivity. Pre svoju aktivitu vyžadujú kofaktory ako Mg2+ ióny, S-adenosylmetionín (SAM) a ATP. Rozpoznávacie sekvencie sú dosť dlhé bez rozpoznateľných znakov, ako je symetria. Reštrikčné endonukleázy typu I štiepia DNA na nešpecifických miestach, ktoré môžu byť 1000 párov báz alebo viac od rozpoznávanej sekvencie. Avšak, pretože metylačná reakcia je uskutočňovaná rovnakým enzýmom, ktorý sprostredkúva štiepenie, cieľová DNA môže byť modifikovaná pred tým, než je štiepená. Vďaka týmto vlastnostiam majú systémy typu I malú hodnotu pre génovú manipuláciu.

Enzýmy typu II :- Enzýmy typu II a im zodpovedajúce modifikované metyltransferázy pôsobia ako samostatné proteíny. Oproti systémom typu I a III majú množstvo výhod. Po prvé, reštrikcia a modifikácia sú sprostredkované oddelenými enzýmami, takže je možné štiepiť DNA bez modifikácie. Po druhé, reštrikčné aktivity nevyžadujú kofaktory, ako je ATP alebo S-adenosylmetionín, čo uľahčuje ich použitie. Ako kofaktory vyžadujú iba ióny Mg2+. Tieto enzýmy sú miestne špecifické, pretože hydrolyzujú špecifické fosfodiesterové väzby v oboch reťazcoch DNA. Reštrikčné endonukleázy triedy II sa všeobecne používajú ako kľúčový materiál v molekulárnej biológii a technikách rekombinantnej DNA, vrátane mapovania genómu, analýzy RFLP, sekvenovania DNA a klonovania.

Enzýmy typu III:- Podobne ako enzýmy triedy I, aj enzýmy typu III majú reštrikčné aj modifikačné aktivity. Rozpoznávajú špecifické sekvencie a štiepia 25 až 27 párov báz mimo rozpoznávacej sekvencie v 3'akútnom smere. Pre svoju činnosť vyžadujú Mg2+ ióny.

Enzýmy typu IIs, majú podobné kofaktory a makromolekulárnu štruktúru ako systémy typu II, skutočnosť, že k obmedzeniu dochádza vo vzdialenosti od rozpoznávacieho miesta, obmedzuje ich užitočnosť.


Reštrikčné endonukleázy typu II - historická perspektíva a ďalšie

Tento článok pokračuje v sérii prieskumov a zhrnutí o reštrikčných endonukleázach (REázach), ktoré sa začali tento rok vo výskume nukleových kyselín. Tu rozoberáme REázy typu II, ktoré sa používajú na analýzu a klonovanie DNA. Zameriavame sa na ich biochémiu: čo sú, čo robia a ako to robia. REázy typu II sú produkované prokaryotmi na boj proti bakteriofágom. S extrémnou presnosťou každý rozpoznáva konkrétnu sekvenciu v dvojvláknovej DNA a štiepi sa v pevnej polohe v rámci alebo v blízkosti. Objavy týchto enzýmov v 70. rokoch minulého storočia a spôsoby použitia, ktoré je možné využiť, majú odvtedy vplyv na všetky oblasti vied o živote. Stali sa podpornými nástrojmi molekulárnej biológie, genetiky a biotechnológie a robili analýzu na najzákladnejších úrovniach rutinou. Boli objavené stovky rôznych REáz, ktoré sú komerčne dostupné. Ich gény boli klonované, sekvenované a nadmerne exprimované. Väčšina z nich bola do určitej miery charakterizovaná, ale len málo z nich bolo podrobne študovaných. Tu popisujeme pôvodné objavy v tejto oblasti a skúmame vlastnosti prvých REAS typu II. Diskutujeme o mechanizmoch rozpoznávania a katalýzy sekvencií a rôznych oligomérnych režimoch, v ktorých pôsobia REázy typu II. Popisujeme prekvapivú heterogenitu odhalenú porovnaním ich sekvencií a štruktúr.

© Autor(i) 2014. Publikované Oxford University Press v mene Nucleic Acids Research.

Figúrky

Počet publikácií pre EcoRI…

Počet publikácií pre EcoRI a EcoRV za rok od roku 1972 do roku 2012.…

Hamilton Smith a Daniel Nathans…

Hamilton Smith a Daniel Nathans na tlačovej konferencii o Nobelovej cene 12. októbra…

Schematické znázornenie krokov ...

Schematická ilustrácia krokov zahrnutých v rozpoznávaní a štiepení DNA pomocou REases…

Kokryštálové štruktúry so špecifickým obmedzením ...

Kokryštálové štruktúry špecifických reštrikčných enzýmov a komplexov DNA určené v rokoch 1990 až 1999.

Schematické znázornenie interakcie ...

Schematické znázornenie interakcie EcoRI s jeho rozpoznávacou sekvenciou. Pre prehľadnosť,…

Schematické znázornenie interakcie ...

Schematické znázornenie interakcie EcoRV s jeho rozpoznávacou sekvenciou. Interakcie s…

Všeobecný mechanizmus pre DNA...

Všeobecný mechanizmus štiepenia DNA pomocou EcoRI a EcoRV. Aktivovaná voda…

Aktívna stránka (PD… D/ExK) z…

Aktívne miesto (PD… D/ExK) EcoRI a EcoRV.

Príklad katalytického miesta REase (Mval, pdb: 2OAA). Nukleofilná voda ...

Alternatívne mechanizmy prenosu fosforu…

Alternatívne mechanizmy reakcií prenosu fosforu: asociatívne (hore) a disociatívne (dole). Mechanizmy…

Porovnanie aktívnych stránok ...

Porovnanie aktívnych miest dvoch štruktúrne veľmi podobných reštrikčných enzýmov BglII…

Zloženie a štiepenie podjednotky…

Zloženie podjednotiek a mechanizmus štiepenia vybraných podtypov REáz typu II.…

Spôsob väzby DNA proteínmi zinkového prsta: každý prst rozpoznáva približne tri…


Pozri si video: Regulácia génovej expresie u eukaryotov, Peter Račay (November 2022).