Informácie

Môžem na svoje vzorky RNA použiť komerčné farbivo na nanášanie DNA bez toho, aby som ich degradoval?

Môžem na svoje vzorky RNA použiť komerčné farbivo na nanášanie DNA bez toho, aby som ich degradoval?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zaujímalo by ma, či musím použiť špeciálne farbivo na nanášanie RNA alebo môžem spustiť vzorky RNA s bežným farbivom, ktoré sa používa na DNA?


Manipulácia s RNA vyžaduje zvýšenú opatrnosť, najmä pri použití špičiek, skúmaviek a reagencií bez RNázy, aby sa zabránilo kontaminácii RNázou. Bežný laboratórny materiál a činidlá zvyčajne uvádzajú, či sú certifikované bez RNázy. Ak na škatuľke alebo štítku nie je taká zmienka, mali by ste predpokladať, že neobsahuje RNázu a nemali by ste ju používať na spracovanie svojej RNA.

Skontrolujte, či je vaše plniace farbivo certifikované bez RNázy (malo by to byť napísané na skúmavke alebo sa to dá ľahko zistiť na webovej stránke výrobcu pomocou referenčného čísla produktu). Ak je to tak a počas celej cesty ste používali výhradne certifikované nástroje a činidlá bez obsahu RNázy, potom je možné, že zavádzaciu skúmavku s farbivom alebo niečo iné kontaminoval jeden z vašich spolupracovníkov.


Súčasná izolácia vysokokvalitnej DNA, RNA, miRNA a bielkovín z tkanív pre genómové aplikácie

Genomické technológie spôsobili revolúciu v našom chápaní komplexných Mendelových chorôb a rakoviny. Pevné nádory predstavujú niekoľko problémov pre genómové analýzy, ako je heterogenita nádoru a kontaminácia nádoru okolitou strómou a infiltrujúcimi lymfocytmi. Vyvinuli sme protokol na (i) výber tkanív s vysokou bunkovou čistotou na základe histologických analýz bezprostredne priľahlých rezov a (ii) simultánnu extrakciu genómovej DNA (gDNA), mRNA, nekódujúcej RNA (ncRNA obohatenej o miRNA) a proteínu z rovnaké tkanivá. Po selekcii tkaniva je možné získať asi 12 - 16 extrakcií DNA, RNA alebo proteínu denne. V porovnaní s inými podobnými prístupmi nám táto rýchla a spoľahlivá metodológia umožnila identifikovať mutácie v nádoroch s pozoruhodnou citlivosťou a vykonávať integračné analýzy súborov údajov celého genómu a exómu, počtu kópií DNA (podľa polí jednonukleotidového polymorfizmu (SNP)), údaje o génovej expresii (profilovaním transkriptómu a kvantitatívnou PCR (qPCR)) a hladiny proteínov (prostredníctvom Western blotting a imunohistochemickej analýzy) z rovnakých vzoriek. Hoci sme sa zamerali na karcinóm obličkových buniek, tento protokol môže byť upravený s malými zmenami na akékoľvek ľudské alebo zvieracie tkanivo, aby sa získali vysokokvalitné a vysoko výťažné nukleové kyseliny a proteíny.


Overenie dizajnu základného náteru

Validácia konštrukcie primérov je obzvlášť dôležitá pri preberaní primerov z predchádzajúcej publikácie alebo pri použití komerčne dodávaného testu. Dizajn priméru sa môže prehodnotiť s ohľadom na pokyny k návrhu testu uvedené v návrhu testu PCR/qPCR/dPCR. Je dôležité zabezpečiť, aby:

  • Priméry sú homológne s požadovanou cieľovou sekvenciou.
  • Reverzný primér komplementu je správny. Starostlivo skontrolujte reverzné základné poradie komplementu (pomocou http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).
  • Zistia sa vhodné varianty zostrihu.
  • SNP sa zabránilo, pokiaľ to test nevyžaduje.
  • Oligo a amplikón nepreberajú sekundárnu štruktúru.
  • Existuje malý potenciál pre vzájomnú hybridizáciu oligonukleotidov reakcie.

Primerový dimér

Schopnosť primérov vzájomne sa hybridizovať, najmä na 3'-konci, môže viesť k predĺženiu priméru počas PCR a tvorbe produktov nezávislých od cieľa, známych ako primérové ​​diméry. Kedykoľvek sa vyrábajú a amplifikujú produkty dimérov primérov, odvádzajú reakčné zložky od syntézy požadovaného produktu, čím sa znižuje účinnosť a citlivosť testu. Diméry primérov sú preto problémom v reakciách využívajúcich detekciu na báze sond aj na báze farbiva SYBR Green I. Pri detekcii na báze farbiva, ako je napríklad SYBR Green I, diméry primérov tiež ovplyvňujú špecificitu testu, pretože nešpecifické farbivo viažuce sa na DNA sa bude viazať na priméry a bude detegované spolu s požadovaným produktom. Preto by sa malo vyhnúť primérom, ktoré pravdepodobne tvoria diméry primérov.

Predikcia diméru primeru

Na stanovenie potenciálu tvorby priméru a diméru použite software na návrh priméru na analýzu tvorby duplexu. OligoArchitect poskytuje podrobnosti o sile hybridizácie autodiméru a krížového diméru (Obrázok 9.1). Akékoľvek 3'-koncové diméry tvorené primérom hybridizujúcim so sebou alebo so svojim partnerom musia byť veľmi slabé (ΔG ≥ –2,0 kcal, Obrázok 9.1).

Ako môžete znížiť dimér priméru?

Malo by sa zabrániť akémukoľvek primeru s koncovým ΔG <-2,0 kcal a predĺžiteľným 3'-koncom (5'-prekrývaním). Najsilnejší celkový dimér by mal byť nestabilný (ΔG ≥ –6,0 kcal). Aby ste sa vyhli silným 3’-koncovým dimérom pri zachovaní špecificity, zvoľte priméry, ktoré majú 2 G alebo C zvyšky v posledných 5 bázach, 1 G alebo C v posledných 3 bázach a A alebo T na 3’-konci (Obrázok 9.1).

Obrázok 9.1. Analýza primerov pre potenciál primer-dimér. Sekvencie primérov sa analyzovali pomocou návrhového softvéru OligoArchitect, aby sa určila ich schopnosť vytvárať duplexy. Je ukázaný potenciál vlastného diméru a krížového diméru pre najlepšiu možnosť primeru. Multiplexná qPCR poskytne najlepšie výsledky, ak všetky priméry v reakcii majú podobné teploty topenia (rozdiel Tm ≤ 2 °C) a netvoria silné 3’-duplexy (ΔG ≥ –2,0 kcal).

Optimalizácia koncentrácií primerov a teploty žíhania (Ta)

Pri optimalizácii podmienok testu pomocou koncentrácie priméru sa fixný Ta (zvyčajne 60 ° C) sa vyberie a optimálne podmienky pre každý základný náter sa určia nezávisle. Toto je rozhodujúce pri navrhovaní testu, ktorý sa má spustiť v multiplexe, pretože všetky reakcie musia prebiehať pri rovnakej teplote žíhania a je to taktika, ktorú možno použiť aj na záchranu slabo fungujúcich testov, pre ktoré nie je dostupný alternatívny dizajn. Technicky jednoduchším prístupom je vybrať fixnú koncentráciu priméru a potom optimalizovať Ta výber najlepšieho výsledku pre tieto priméry v kombinácii. Toto je preferovaný prístup pri použití niekoľkých testov a detekcie farbiva viažuceho dsDNA, ako je napríklad SYBR ® Green I. Tento prístup však vyžaduje nástroj, ktorý dokáže súčasne vykonávať reakčné programy využívajúce rôzne Ta možnosti.

Optimalizácia koncentrácií základného náteru

Pri použití qPCR na báze sondy sa často dosiahnu uspokojivé výsledky s použitím konečných koncentrácií oboch primérov pri 500 nM a sondy pri 250 nM, najmä ak je cieľ PCR bohatý a nie je potrebná maximálna citlivosť. O niečo nižšie koncentrácie priméru, medzi 200 nM a 400 nM, sú typicky lepšie pri použití detekcie založenej na farbive SYBR Green I na minimalizáciu nešpecifickej amplifikácie a pri optimalizácii multiplexných reakcií. Aby ste si overili, či sú štandardné podmienky vhodné na použitie, vykonajte analýzu štandardných kriviek (pozri Vyhodnotenie testu). Ak je detekcia lineárna, reprodukovateľná a gradient je v rozmedzí –3,2 až –3,5 v rozsahu cieľových koncentrácií očakávaných vo vzorkách, nemusí byť potrebné ďalej optimalizovať koncentrácie priméru a sondy.

Niektoré z náznakov, že test nie je dobre optimalizovaný, sú, že chýba reprodukovateľnosť medzi replikátmi a je vo všeobecnosti neefektívny a necitlivý. Účinnosť testu sa zvyčajne testuje v rozsahu koncentrácií primérov, napríklad od 50 do 800 nM, s použitím každého primeru pri každej koncentrácii (Obrázok 9.2 úplný protokol nájdete v prílohe A, Optimalizácia protokolov protokolov).

Obrázok 9.2. Príklad optimalizácie základného náteru. Usporiadanie 8-skúmavkových prúžkov (horná a ľavá strana) a PCR platne na riedenie a dávkovanie primerov.

Kombinácia koncentrácií poskytujúca najnižšie Cq, zvolí sa najnižšia variácia replikátov a negatívny NTC (obrázok 9.3) 2.

Obrázok 9.3. Výsledky optimalizácie koncentrácie primerov PCR z testu farbenia SYBR Green I. A) Stanovené smernice odporúčajú testovať rôzne koncentrácie primérov vpred (F) a reverzných (R). V tomto príklade sa testovalo 50 nM až 600 nM v kombinácii, aby sa určila optimálna koncentrácia pre test. V tomto experimente existuje obrovský rozdiel v Cq v dôsledku rôznych koncentrácií primérov, čo ukazuje, ako to môže ovplyvniť konečné údaje (údaje od Jens Stolte, EMBL). B) Tento experiment ukazuje optimalizáciu dobre navrhnutého testu a variabilitu v dôsledku koncentrácie priméru. Kombinácia 400 nM dopredného a reverzného priméru bola zvolená ako optimálna, pretože táto kombinácia predstavovala najnižšie koncentrácie primérov, ktoré reprodukovateľne poskytli najskoršie hodnoty Cq pri zachovaní sigmoidálnej krivky.

Ak je jeden cieľ v multiplexnej reakcii výrazne hojnejší ako druhý(e), alebo ak jeden primérový pár poskytuje oveľa nižší Cq ako druhý(é), amplifikácia tohto cieľa môže dominovať reakcii, pričom sa spotrebúvajú zložky reakcie skôr, ako sú detekovateľné iné ciele. Úprava koncentrácií primérov môže umožniť vyváženejšiu amplifikáciu všetkých cieľov. Aby ste určili, či budú takéto úpravy prospešné, pripravte štandardné krivky (pozri Vyhodnotenie testu), ktoré pokrývajú rozsah cieľov očakávaných pre každý pár primérov samotný (singleplex) a so všetkými kombinovanými primermi (multiplex). Ak multiplexné a singleplexové reakcie poskytujú podobné výsledky, sú vhodné koncentrácie primérov. Na druhej strane, optimalizácia koncentrácií primérov pravdepodobne zlepší výsledky, ak je citlivosť pri multiplexných reakciách neprijateľná. Znížte koncentrácie primérov pre tie páry primérov, ktoré vedú k nízkej Cq hodnoty a/alebo zvýšenie koncentrácií pre tie, ktoré poskytujú vysoké Cq hodnoty v rozmedzí 50–500 nM.

Optimalizácia teploty žíhania základného náteru

Kvantitatívne PCR testy sa vo všeobecnosti vykonávajú pomocou dvoj- alebo trojstupňových programov teplotného cyklovania, typicky s 35–40 cyklami. Dvojfázové reakcie cyklujú medzi dvoma teplotami, zvyčajne 95 °C (zvyčajne 10–15 sekúnd) a 60 °C (zvyčajne 30–60 sekúnd alebo 5–10 sekúnd pri rýchlych podmienkach). Pri testovaní s dvojitou značenou sondou (TaqMan alebo hydrolýza) sa zvolia dvojstupňové teplotné reakcie, pretože predĺženie pri nižšej teplote podporuje aktivitu exonukleázy DNA polymerázy a odrádza od vytesnenia sondy. Toto by bol preferovaný protokol o cyklických podmienkach na vykonávanie mnohých rôznych testov s rovnakými parametrami. Nevýhodou použitia dvojstupňovej metódy je však to, že znižuje potenciálne možnosti pre návrh priméru a obmedzuje optimalizáciu testu na koncentráciu priméru samotnú, pretože neexistuje žiadna teplota nasadenia (Ta) je možná optimalizácia.

Trojstupňový cyklovací protokol je výhodný vtedy, ak sú cieľové sekvencie komplexné a buď je ťažké optimalizovať vybrané priméry, alebo použitý detekčný systém nezávisí od použitia hydrolýznej sondy. Trojstupňový strategický cyklus medzi: 95 ° C (typicky 10 s), teplotou žíhania (medzi 55 ° C a 65 ° C, typicky 10-20 s alebo 5 s v rýchlych podmienkach) a 72 ° C (typicky pre 20–30 sekúnd alebo 15–20 sekúnd pri rýchlych podmienkach). V tomto prípade Ta môže byť optimalizovaný na ďalšie zlepšenie výkonu testu pomocou nasledujúceho protokolu:

  • Začnite na dolnom konci T.a testovaný rozsah, ktorý je určený Ta primerov a postupne zvyšujte teplotu v postupných prírastkoch (zvyčajne sa testuje medzi 55 °C a 65 °C). Niektoré nástroje majú gradientové bloky, ktoré uľahčujú optimalizáciu teploty v jednom cykle.
  • Testujte špecifickosť každého reakčného produktu, buď analýzou krivky taveniny po PCR alebo elektroforézou na agarózovom géli, ako je popísané nižšie.
  • Optimálna teplota žíhania je taká, ktorá má za následok najnižšie Cq, negatívny NTC, analýza krivky taveniny odhaľujúca detekciu špecifického produktu a vysokú reprodukovateľnosť medzi replikačnými reakciami.

Ak je teplota žíhania príliš nízka, reakcia bude nešpecifická. Ak je však teplota príliš vysoká, prísnosť môže ovplyvniť účinnosť reakcie, čo má za následok nedostatok zosilnenia alebo veľmi vysokú teplotu Cq hodnoty, veľmi slabé výťažky a nízka reprodukovateľnosť.

Príklad optimalizácie teploty je uvedený v Obrázok 9.4. V tomto prípade (Obrázok 9.4A), identické reakcie sa uskutočňovali na gradientovom bloku PCR tak, že teplota žíhania bola medzi 47, 8 ° C a 71, 7 ° C. Žíhanie pri 64,8 ° C a 61,7 ° C vedie k identickému Cq hodnoty, ale mierne nižšia teplota produkuje vyšší výťažok produktu, o čom svedčí vyššia fluorescencia koncového bodu a reakcia so zjavne vyššou účinnosťou (indikovaná gradientom amplifikačného grafu). Absolútne určenie účinnosti si vyžaduje posúdenie štandardnej krivky (pozri Vyhodnotenie testu) alebo použitie algoritmov na stanovenie účinnosti jednej skúmavky 3,4. Druhá časť obrázku (Obrázok 9.4B) ukazuje porovnanie správania sa primerov za rovnakých reakčných podmienok, ale v rôznych zmesiach reagencií. Tu je zrejmé, že zloženie pufra ovplyvňuje reprodukovateľnosť testu a rozsah teplôt, pri ktorých sa dosahujú stabilné údaje. Nakoniec boli navrhnuté dva nezávislé testy na rovnaký cieľový gén a tieto boli optimalizované v každom pufri. Ako je ukázané Obrázok 9.4C, každý pufer vyžadoval inú optimálnu teplotu, aby sa získal porovnateľný Cq údaje z dvoch párov primérov (61,7 °C v LuminoCt a 58,4 °C v KiCqStart).

Obrázok 9.4. Optimalizácia primeru pomocou Ta. A) Pre identické reakcie sa testoval rozsah teplôt žíhania. Žíhanie pri 64,8 °C a 61,7 °C má za následok identické hodnoty Cq a vysokú reprodukovateľnosť medzi replikátmi, ale mierne nižšia teplota viedla k vyššiemu výťažku produktu. B) Dve identické reakcie sa pripravili v rôznych zmesiach reagencií (LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix ™ alebo KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix ™) a spustil sa gradient teplotného gradientu. Optimálna teplota sa líšila v každej zmesi a boli menšie rozdiely medzi údajmi, keď reakcie prebiehali v činidlách KiCqStart. C) Dva páry primérov na rovnaký cieľ (KS a navrhnuté pomocou Beacon Designer, BD) sa nechali bežať v rôznych reakčných zmesiach. Je možné vidieť, že optimálna teplota žíhania je odlišná v rôznych činidlách (61,7 °C v LuminoCt a 58,4 °C v KiCqStart), aby sa dosiahli podobné výsledky z primérov.

Hoci väčšina komerčných testov sa dodáva so štandardnými podmienkami testu PCR, jednotlivé testy môžu mať prospech z ďalšej optimalizácie na identifikáciu podmienok, ktoré sú špecifické pre konkrétnu kombináciu primérov. To môže byť spôsobené dimérmi priméru, nešpecifickou amplifikáciou alebo suboptimálnou účinnosťou reakcie za zvolených predvolených podmienok. Po dokončení optimalizácie by sa mala účinnosť testu vypočítať tak, že sa zvolené podmienky použijú na meranie série štandardov a pripraví sa štandardná krivka (hodnotenie testu). Je možné, že aj po optimalizácii môže byť účinnosť stále nedostatočná a v najhoršom prípade môže byť potrebný nový test.

Rozsah prípustných hodnôt účinnosti by mal definovať používateľ pred začatím procesu optimalizácie. V ideálnom prípade by účinnosť mala byť> 95%. Je však možné vykonávať presné merania s testami, ktoré majú účinnosť <90% a ako pri návrhu priméru, cieľová sekvencia môže diktovať, že cieľ nemožno amplifikovať s vyššou účinnosťou. Napriek tomu pri použití testu s nižšou účinnosťou je pravdepodobné, že bude ovplyvnená presnosť a limit detekcie. Za týchto okolností je nevyhnutné pri interpretácii a vykazovaní údajov postupovať podľa vlastného uváženia 1 .


Referencie

Liang, P. & amp. Pardee, A.B. Diferenciálne zobrazenie eukaryotickej messengerovej RNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. Veda 257, 967–971 (1992).

Liang, P. Dekáda diferenciálneho zobrazenia. Biotechniky 33, 338–346 (2002).

Liang, P. & Pardee, A.B. Analýza diferenciálnej génovej expresie pri rakovine. Nat. Rev. Cancer 3, 869–876 (2003).

Cho, Y.-j. a kol. Viacfarebný fluorescenčný diferenciálny displej. Biotechniky 30, 562–572 (2001).

Bauer, D. a kol. Identifikácia diferencovane exprimovaných druhov mRNA vylepšenou zobrazovacou technikou (DDRT-PCR). Nucleic Acids Res. 21, 4272–4280 (1993).

Liang, P. a kol. Analýza zmenenej expresie génov diferenciálnym zobrazením. Metódy Enzymol. 254, 304–321 (1995).

Liang, P. a kol. Diferenciálne zobrazenie s použitím primérov ukotvených oligo-dT na jednej báze. Nucleic Acids Res. 22, 5763–5764 (1994).

Liang, P., Averboukh, L. & Pardee, A.B. Spôsob diferenciálneho zobrazenia. v Metódy v molekulárnej genetike. (ed. Adolph, K. W.) 3–16 (Academic Press, San Diego, CA, 1994).

Yang, S. & amp. Liang, P. Globálna analýza génovej expresie diferenciálnym zobrazením - matematický model. Mol. Biotechnol. 27, 197–208 (2004).

Meade, J.D. a kol. Automatizácia fluorescenčného diferenciálneho displeja s digitálnym odčítaním. v Diferenčné metódy zobrazenia a protokoly 2. vyd., Zv. 317 (eds. Liang, P., Meade, J.D. & amp Pardee, A.B.) 23–57 (Humana Press, Totowa, NJ, USA, 2005).

Liang, P., Averboukh, L. & amp Pardee, A.B. Distribúcia a klonovanie eukaryotických mRNA pomocou diferenciálneho zobrazenia: spresnenia a optimalizácia. Nucleic Acids Res. 21, 3269–3275 (1993).

Ausubel, F.M. a kol. (eds.) Aktuálne protokoly v molekulárnej biológii (John Wiley & Sons, Somerset, NJ, USA, 2005).

Zhang, H., Zhang, R. & amp. Liang, P. Diferenciálny skríning rozdielu v génovej expresii obohatený o diferenciálne zobrazenie. Nucleic Acids Res. 24, 2454–2455 (1996).

Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. & amp Brown, P.O. Kvantitatívne monitorovanie vzorcov génovej expresie s komplementárnym mikročipom DNA. Veda 270, 467–470 (1995).

Chee, M. a kol. Prístup ku genetickým informáciám pomocou polí DNA s vysokou hustotou. Veda 274, 610–614 (1996).

Velculescu, V.E., Zhang, L., Vogelstein, B. & amp Kinzler, K.W. Sériová analýza génovej expresie. Veda 270, 484–487 (1995).

Liang, P. Génový objav pomocou diferenciálneho zobrazenia. Genet. Ing. Správy 20, 37 (2000).


Vplyv, problémy a riziká

Aký vplyv by podľa vás mohol mať váš produkt? (maximálne 100 slov)

Testovania SARS-CoV-2 je na celom svete nedostatok. Naliehavo sú potrebné nové testovacie metódy, ktoré sú jednoduché, dostupné a široko dostupné. Nadmerné spoliehanie sa na túto komplikovanú techniku ​​molekulárnej amplifikácie bráni ľuďom v mnohých oblastiach sveta vedieť, či je vírus prítomný, a bráni úsiliu verejného zdravia. Ak dokážeme optimalizovať jednoduchú metódu RT-LAMP, ktorá je priaznivá v porovnaní so súčasným testom RT-qPCR, ponúkne rýchlu, presnú a nákladovo efektívnu detekciu SARS-CoV-2, ktorá by mohla byť nasadená kdekoľvek.

Čo si myslíte, že by bol váš projekt úspešný? (Maximálne 100 slov)

Úspechom by bolo splnenie nasledujúcich cieľov:

  1. Vyvinúť optimalizovanú verziu protokolu RT-LAMP od NEB na detekciu SARS-CoV-2, ktorá je citlivá a špecifická.
  2. Ukážte, že protokol možno použiť v laboratóriách s rôznymi zdrojmi a osobami s rôznymi úrovňami predchádzajúceho školenia v oblasti molekulárnej biológie.
  3. Zdokumentujte proces a výsledné údaje, ktoré viedli k 1 a 2 vyššie, jasným a dostupným spôsobom na JOGL.
  4. Vykonajte predbežné testovanie optimalizovanej metódy na ľudských vzorkách v partnerskom laboratóriu s vhodnými opatreniami biologickej bezpečnosti, ktoré ukážu, že funguje rovnako dobre alebo lepšie ako v súčasnosti používané metódy.

Uveďte zoznam známych problémov, potenciálne riziká, šedé oblasti atď. vo vašom projekte

-Optimalizácia syntetickými kontrolami môže mať za následok test, ktorý nebude so vzorkami pacientov fungovať

-Niektoré reagencie sú dostupné iba z jednotlivých zdrojov, musíme naplánovať alternatívy, ako napríklad DIY master mixy. To by tiež platilo, ak by vladári skončili nedosiahnuteľní alebo by ich test stál príliš veľa, aby boli užitoční v oblastiach s malým počtom zdrojov.

-Pri použití surových vzoriek bez extrakcie RNA môže byť nemožné dosiahnuť dobrú citlivosť. Ak je to tak, možno budeme musieť prejsť na alternatívne purifikačné metódy alebo nové vzorkové pufre.

-Test nemusí byť ľahko doručiteľný napriek správam, že tieto typy činidiel možno sušiť mrazom.


Biofyzikálne techniky pre štrukturálnu charakterizáciu makromolekúl

J.D. Cossar, C.H. Arrowsmith v Comprehensive Biophysics, 2012

1.3.3.2 Templátová DNA a PCR klonovanie

Šablónová DNA pre špecifikovaný proteínový cieľ sa môže získať z komerčných alebo iných zbierok jednotlivých klonov cDNA, knižníc cDNA, chemicky syntetizovanej DNA alebo genómovej DNA (pre organizmy s malým počtom intrónov alebo domén kódovaných jediným exónom). cDNA klony sú zdrojom prvej voľby a sú produkované reverznou transkripciou z mRNA populácií buniek primárneho zdroja (natívne tkanivo). cDNA môžu niesť sekvenčné varianty (pokiaľ sú defektné) alebo jednonukleotidové polymorfizmy, v závislosti od zdrojového tkaniva. Proces generovania DNA z mRNA môže tiež zaviesť bezodplatné mutácie. Preto by mali byť sekvencie templátov cDNA pred použitím overené.

Schopnosť synteticky produkovať gény sa teraz ľahko nachádza v komerčnom sektore a technológia je relatívne robustná. Kvôli nákladom a časovým obmedzeniam túto stratégiu vyhradzujeme pre sekvencie, ktoré nie sú dostupné ako cDNA. Syntetická molekula môže byť tiež modifikovaná, aby sa prispôsobila preferovanej frekvencii využitia kodónov hostiteľom (obrázok 2). V rámci štandardných 64 kodónov (tripletové sekvencie DNA zodpovedajúce jednotlivým aminokyselinám v polypeptide) je známe, že rôzne organizmy vykazujú rôzne použitia, keď pre danú aminokyselinu existuje viac ako 1 kodón (napr. Arginín má 6 príbuzných kodónov, prolín má 4, cysteín má 2 a metionín 1). Preto, ak má byť proteín exprimovaný v neprirodzenom hostiteľovi, je možné priradiť využitie kodónov sekvencie DNA k hostiteľskému organizmu. Potenciálny prínos spočíva v predpoklade, že prezentácia vzácneho (málo používaného) kodónu na neprirodzenom mieste na mRNA môže viesť k zastaveniu ribozómov a predčasnému ukončeniu predĺženia polypeptidového reťazca. Na expresiu eukaryotických proteínov v bakteriálnych hostiteľoch možno tieto faktory často prekonať koexpresiou s doplnkovými tRNA pre vzácne kodóny. 14 Prítomnosť vzácnych kodónov sa tiež považuje za zavedenie prestávok v predĺžení rodiaceho sa polypeptidového reťazca, čo môže umožniť nezávislé skladanie štruktúrnych domén. Vzhľadom na trochu neistý prínos optimalizácie kodónov neodporúčame tento prístup pri prvom prechode a syntetická templátová DNA sa normálne pripravuje na poskytnutie natívnej kódujúcej sekvencie.

Obrázok 2. Preferencia (zaujatosť) používania kodónov v genóme H. sapiens, E. colia S. frugiperda.

Genomická DNA je často poslednou možnosťou v prípadoch, keď je sekvencia na syntézu neprijateľne veľká a nie je k dispozícii ako cDNA. Genomická DNA je relatívne ťažko použiteľná kvôli nízkej frekvencii cieľovej sekvencie v celom genóme a následným ťažkostiam pri získavaní čistého produktu PCR. Okrem toho genómová DNA často obsahuje intróny (nekódujúca DNA v rámci požadovaného génu), ktoré musia byť odstránené počas procesu konštrukcie klonu. Potreba viacnásobných manipulácií na získanie DNA z genómového zdrojového materiálu nevyhnutne zvyšuje riziko zavedenia škodlivých mutácií (delécie alebo substitúcie). Takéto šablóny preto musia byť pred použitím sekvenčne overené. Kvôli vysokej intrónovej frekvencii sa cicavčia genómová DNA normálne nepovažuje za templát na klonovanie. Genomická zdrojová DNA sa však bežne a úspešne používa v našom laboratóriu ako templát pre proteíny z Plasmodium falciparum 15 a podobné organizmy.

Hneď ako sa získa požadovaný templát DNA, je vhodné ho vložiť do klonovacieho vektora (plazmid) na účely skladovania, manipulácie (vrátane miestne cielenej mutagenézy), sekvenovania a na použitie ako templát na subklonovanie špecifických oblastí pre ďalšie spracovanie. Táto fáza zdržania sa zvyčajne vykonáva v E. coli systémy kvôli ich ľahkému použitiu a všeobecnej vernosti pri reprodukcii DNA inzertu. K dispozícii je mnoho systémov, vrátane kmeňa DH5a a plazmidov série pBluescript alebo Top10. Aby sa predišlo obavám z toxicity produktu alebo silného skreslenia rýchlosti rastu voči neproduktívnym variantom, expresia proteínového produktu je v takýchto systémoch minimálna alebo vôbec neexistuje.


Multi-Omic analýza

Vyjadrenie génov plnej krvi

Extrakcia RNA sa uskutočnila na krvi odobratej do skúmaviek PAXGene pomocou súpravy na čistenie PAXGene RNA (QIAGEN) podľa protokolu výrobcu. Bioanalyzátor Agilent 2100 (Santa Clara, CA, USA) bol použitý na kvantifikáciu a hodnotenie kvality celkovej RNA. Polyadenylovaná RNA bola izolovaná pomocou magnetického izolačného modulu NEBNext Poly (A) mRNA (NEB, Ipswich, MA, USA). cDNA knižnice boli vytvorené z polyadenylovanej RNA s použitím súpravy na prípravu knižnice KAPA vláknovej RNA-Seq knižnice (Roche, Basel, Švajčiarsko). Vzorky boli sekvenované na HiSeq2500 s čítaním na jednom konci s dĺžkou 100 bp. Vzorky boli kontrolované na dávkové účinky cez analýza teplotnej mapy normalizovaných počtov génov a žiadne sa nenašli. Kvalita sekvencie súborov fastq bola hodnotená pomocou FastQC v0.11.7 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Zarovnanie nespracovaných údajov s referenčným genómom sa uskutočnilo pomocou STAR v2.5.4b (8), aby sa vytvorili súbory BAM s triedenými polohami. Genomický index požadovaný STAR bol vytvorený pomocou ľudského genómu stiahnutého z Ensembl (9), zostava GRCh38 v91, primárna zostava. Počty génov sa generovali pomocou funkcie htseq-count z HTSeq v0.10.0 (10). Výsledky z vyššie uvedených programov (FastQC, STAR a HTSeq) boli skompilované do jednej správy pomocou MultiQC v1.0 (11). Analýza údajov RNA-Seq sa uskutočnila pomocou R v3.5.0 (https://www.R-project.org/) a RStudio v1.1.453 (http://www.rstudio.com/). Počet súborov bol filtrovaný na odstránenie génov s menej ako 10 počtami z 15 vzoriek (počet biologických replikátov). Známe globinové gény boli odstránené, čo zodpovedá nasledujúcim šiestim Ensembl ID: ENSG00000206172, ENSG00000188536, ENSG00000244734, ENSG00000223609, ENSG00000213934 a ENSG00000196565. Po filtrácii a odstránení globínu mali vzorky strednú veľkosť knižnice 4 842 497, s minimom 2 217 471 a maximom 14 755 180. DESeq2 v1.20.0 (12) sa použil na identifikáciu odlišne exprimovaných (DE) génov. Gény DE boli identifikované pomocou Waldovho štatistického testu, po ktorom nasledovala filtrácia na významnosť pomocou kombinovaného prahu upravenej hodnoty p ≤ 0,05 a absolútnych násobných zmien ≥ 1,5. Na analýzu obohatenia dráhy bola použitá Sigora v2.0.1 (13) s databázou Reactome na úrovni hierarchie štyri. Korekcia pre viacnásobné porovnania bola vykonaná pomocou Bonferroniho metódy, filtrovaním výsledkov na základe hodnoty 𢙀,001.

Epigenetická analýza celej krvi

Genomická DNA (gDNA) sa extrahovala z 200 μl vzoriek plnej krvi pomocou súpravy DNeasy Blood & amp Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. Sedemstopäťdesiat nanogramov výsledných vzoriek gDNA bolo cez noc podrobených bisulfitovým konverziám pomocou súpravy EZ DNA Methylation Kit (ZymoResearch, Irvine, CA) v termocykleri PCR (16 cyklov 95 ଌ počas 30 s a 50 ଌ počas 60 a#xa0min ). Na uskutočnenie globálneho profilovania metylácie DNA na guľôčkových čipoch Illumina MethylationEPIC sa použilo 160 ng vzoriek DNA (bcDNA) konvertovanej na bisulfit. Procedúra poľa sa začala cez noc amplifikáciou celého genómu pri 37 ଌ. Amplifikované produkty boli potom enzymaticky fragmentované, vyzrážané izopropanolom a potom resuspendované v hybridizačnom pufri. Po tepelnej denaturácii boli spracované vzorky bcDNA hybridizované na čipoch MethylationEPIC BeadChips v inkubácii cez noc pri 48°C. Nasledujúci deň sa nenaviazaná bcDNA odmyla z čipov, potom sa uskutočnila extenzia na jednej báze s poskytnutými dNTP značenými DNP a biotínom. Po neutralizácii boli označené predĺžené priméry na každom poli zafarbené pri 32ଌ v komorovom stojane s Cy5 označenými anti-DNP protilátkami a Cy3 označeným streptavidínom podľa protokolu výrobcu’ v 90-minútovom postupe farbenia. Zafarbené EPIC čipy sa potom utesnili, vysušili a naskenovali pomocou Illumina iScan na dvojfarebnom kanáli, aby sa detegovali sondy označené Cy3 na zelenom kanáli a sondy označené Cy5 na červenom kanáli. Použitím softvérového balíka Illumina GenomeStudio boli priemerné hodnoty beta vypočítané vydelením intenzity signálu metylovanej sondy súčtom intenzít signálu metylovanej a nemetylovanej sondy. Priemerné hodnoty beta sa pohybujú od 0 (úplne nemetylované) do 1 (úplne metylované) a poskytujú kvantitatívne odčítanie relatívnej metylácie DNA pre každé miesto CpG v rámci vyšetrovanej bunkovej populácie. Údaje o metylácii DNA (DNAm) sa najskôr spracovali kontrolou ich distribúcie beta hodnôt v štatistickom softvéri R. Hodnoty beta poľa EPIC sa použili na vykonávanie hierarchického klastrovania pomocou buď celého poľa EPIC, alebo 58 hodnôt beta sondy SNP a#x2019s. Kvalita údajov o DNAm bola hodnotená filtráciou, pričom EPIC sa uskutočnilo podľa tohto kritéria: ak boli sondy vypočúvané s SNP, mali dôkazy o krížovej hybridizácii s inou oblasťou genómu, ako je určený cieľ (14), mali prítomné SNP CpG cieľ alebo jednobázové rozšírenie sondy (polymorfné sondy) (14). Sondy boli odstránené, ak mali počet zrniek <3 v 5% vzoriek alebo mali 1% vzoriek so zlou detekčnou hodnotou p> 0,05. Vzorky sa potom normalizovali pomocou metódy dasen (15), čím sa hodnota beta priblížila. Korekcia zloženia krviniek sa uskutočnila vo vzorkách plnej krvi pomocou lineárnej regresie počtov z celkového krvného obrazu (16). Účinky šarže medzi Sentrix ID sa pozorovali pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA) a na korekciu Sentrix ID sa použil ComBat (17). Hodnotili sa aj údaje z technických replikátov. Aby sa zlepšila výpočtová účinnosť a znížila korekcia viacnásobných testov, bolo odstránených 101 864 nemenných CpG, ako bolo popísané vyššie (18). Aby sa analyzovali údaje skúmajúce vplyv očkovania, veku alebo pohlavia v súbore, bol spustený lineárny model zmiešaných účinkov s hodnotou DNAm ako výsledkom, ostatné faktory ako hlavné efekty s kovariátom ID subjektu ako náhodnými účinkami.

Proteomická a lipidomická analýza

Vzorky WBC boli lyžované pomocou publikovaných metód (19). Bielkoviny sa merali pomocou testu Pierce ™ Bradford a 10 μg na vzorku sa digerovalo, ako bolo opísané vyššie (20). Peptidy boli odsolené pomocou STOP-And-Go extrakčných špičiek (STAGE tipy) (21), sušené pomocou Vacufuge Plus (Eppendorf) 45 a#xa0 minút, potom chemicky dimetylované ľahkým, stredným a ťažkým formaldehydom (22) na triplexnú analýzu každý časový bod na jednotlivca (tj. pre každého jednotlivca boli pripravené dve triplexné vzorky, pričom vzorka z jedného z časových bodov bola pridaná do oboch triplexovaných vzoriek, aby sa použila ako referencia). Po označení sa vzorky pre každý triplex spojili, odsolili a opäť vysušili pomocou špičiek STAGE a Vacufuge Plus. Peptidy boli resuspendované v 30 x 3 bcl 0,1 % kyseliny mravčej na kvapalinovú chromatografiu a hmotnostnú spektrometrickú analýzu (LC-MS). Dva mikrogramy na vzorku sa vstrekli do chromatografického systému EasynLC-1000 (Thermo) s 50 cm analytickou kolónou, naplnenou interne s C18, spojenou s hmotnostným spektrometrom Impact II Q-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Nemecko), s podrobnými parametrami, ako bolo popísané vyššie (23). Údaje boli analyzované pomocou MaxQuant (v1.5.5.1) s predvolenými hodnotami a aktivovaným “Match Between Runs”, prehľadané oproti ľudskej databáze Uniprot (prevzaté 15. júla 2017). Proteomické údaje hmotnostnej spektrometrie boli uložené v konzorciu ProteomeXchange Consortium cez the PRIDE (24) partner repository with the dataset identifier PXD020474.

Plasma lipidomics samples were prepared using a variation of a published protocol (25). Aliquots of 10 μl of plasma were mixed with 180 μl of ammonium bicarbonate (150 mM), followed by extraction with 790 μl of a 7:2 mixture of methyl tert-butyl ether and methanol, respectively. Samples were spiked with 21 μl of internal standard (Table 4). Samples were shaken for 15 min at਄ଌ, and then underwent centrifugation at 3000 × g for 5 min, from which 100 μl of the organic portion was taken and dried on a 96-well plate each was resuspended in 20 μl of ammonium acetate (7.5 mM) in a 1:2:4 mixture of chloroform, methanol, and isopropanol, respectively. The samples were loaded using the TriVersa NanoMate (Advion, Ithaca, NY, USA) infusion robot and a 4-mm infusion chip, and analyzed by the Impact II Q-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) in positive and negative ionization mode. Raw data were processed using an in-house script. Batch correction was performed on log2-transformed data using ComBat from the “sva” R package (26). Spárované t-test was used to test for differentially abundant proteins at each post-vaccination time point (Days 1, 3, 7, and 14) compared to the pre-vaccine time point (Day 0). For comparison of non-responders and responders, a t-test and multiple-testing correction were applied cez a custom script in R. For all tests, proteins were filtered for significance using an adjust p-value of 0.05.

Tabuľka 4 Composition of standards used for analysis of plasma lipidomics.

Immune Cell Phenotyping

Fixed cells were stained per manufacturer recommendations with different labeled antibodies (Table 5) to identify specific cell populations. Flow cytometry data were acquired on a LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Flow cytometry raw data were analyzed manually using Flowjo software (version 9.9). In addition, immunophenotyping using automated gating was undertaken on the same samples. This has advantages over manual gating, including increased throughput and identification of specific cell populations with up to 50-dimensional datasets (27). Pre- processing to detect anomalous events obtained during data acquisition was done using the flowCut algorithm (https://rdrr.io/github/jmeskas/flowCut/man/flowCut.htmL). In brief, this approach detects and removes events within time segments for which the fluorescence intensities deviate from the norm. Next, events with either the minimum or maximum value in any of the scatter channels were removed. Singlets were selected using the FSC-A and FCS-W channels. Finally, the data were compensated and transformed using a logical transformation. For each sample, flowDensity (a supervised gating algorithm) (28) was used to determine the thresholds for each marker in each of the biaxial plots in a data-driven manner based on the density distribution of the fluorescence signal. If there were two peaks in the density distribution, the split was located at the minimum between the two peaks. In the case of more than two peaks, the peak-to-peak distance and valley heights was used to determine which split gave the most distinct cut. Otherwise, the algorithm used inflection points. Five challenging populations (live cells, myeloid and plasmacytoid DCs, gamma delta T cells and CD56 bri CD16 lo NK cells) required a second gating step using flowPeaks, an unsupervised clustering algorithm (29). These included populations which were difficult to separate from the background and which could not easily be defined by polygons with sides at pre-defined angles. We defined these cell populations as the union of all of the clusters with centroids inside of the flowDensity-determined boundaries. Cell counts for each of the populations in the gating strategy were obtained and normalized to the bead count, yielding cell counts for a total of 24 immune cell populations (Figure 4). Correlation analysis between antibody titres and cell composition were performed. A Spearman correlation was utilized where antibody data were normally distributed and a Wilcoxon rank sum test when antibody data were skewed.

Table 5 Antibody panel for single cell immunophenotyping.


MATERIÁLY A METÓDY

Protein expression and purification

The gene of KmAgo was amplified by PCR from genomic DNA of K. massiliensis JC30 and cloned into the pET28b expression vector in frame with the N-terminal His6-tag using the NheI–XhoI restriction sites. Escherichia coli BL21(DE3) was transformed with the expression plasmid and the cells were cultivated in the LB medium with 50 μg/ml kanamycin at 25ଌ until OD600 = 0.4, cooled down to 16ଌ, induced with 0.2 mM IPTG and grown at 16ଌ overnight with aeration. The cells were collected by centrifugation and stored at �ଌ. The cell pellet was resuspended in buffer A (30 mM Tris–HCl pH 7.9, 0.3 M NaCl, 5% glycerol) supplemented with 1 mM of PMSF and disrupted using Cell Disruptor CF (Constant Systems). The lysate was cleared by centrifugation, and loaded onto Co 2+ -charged TALON Metal Affinity Resin (Clontech) for 1.5 h with agitation. The beads were washed with buffer A containing 5 mM of imidazole, then with the same buffer with 20 mM of imidazole, and eluted with buffer containing 300 mM imidazole. The eluted protein was diluted 3-fold with a buffer containing 20 mM Tris–HCl pH 7.9 and 5% glycerol. The protein sample was loaded onto a Heparin FF column (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM Tris–HCl pH 7.9, 100 mM NaCl and 5% glycerol, washed with 10 volumes of the same buffer and eluted with a linear NaCl gradient (0.1𠄱.0 M). The purity of the final protein samples was assessed by denaturing PAGE with Coomassie staining. Fractions containing KmAgo were concentrated using Amicon Ultra 50K (Merck Millipore), placed in a storage buffer (40 mM Tris–HCl, 0.3 M NaCl, 50% glycerol, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA, pH 7.9), aliquoted and frozen in liquid nitrogen. The protein concentration was determined by the Qubit protein assay kit (Thermo Fischer Scientific). Catalytically dead mutant variant (D527A D596A) was obtained by site-directed mutagenesis using QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent), expressed and purified in the same way.

Analysis of KmAgo-associated smDNAs

Small nucleic acids were extracted by phenol-chloroform treatment from KmAgo after the first purification step (Co 2+ -resin). Nucleic acids were treated with DNase I or RNase A and analyzed by denaturing PAGE as described previously (15). Small DNA libraries were prepared as described in (16). Briefly, extracted nucleic acids were ethanol-precipitated, treated with RNase A (ThermoFisher), ligated with adaptor oligonucleotides and sequenced using the HiSeq2500 platform (Illumina) in the rapid run mode (50-nucleotide single-end reads). Analysis of smDNA sequences was performed as described previously (16).

Analysis of cell growth

Overnight culture prepared from E. coli BL21(DE3) transformed with the expression plasmid pET28-KmAgo or the empty vector was diluted to OD 0.015 in the LB medium containing 50 μg/ml kanamycin and 0.2 mM IPTG or 0.2% glucose and aliquoted in a 24-well plate, 1 ml per well. The plate was incubated at 30ଌ with agitation at 200 rpm and OD was measured each 10 min in a Tecan microplate reader. Data from three independent biological replicates were used to plot the growth curves.

Single strand nucleic acid cleavage

The cleavage assays were performed using synthetic guide and target DNAs and RNAs (see Supplementary Table S1 for oligonucleotide sequences). For some experiments 5′-Cy3- or 5′- 32 P-labeled targets were used. The 6S RNA gene was PCR-amplified from the genomic DNA of E. coli strain MG1655 including the T7 RNA polymerase promoter in the forward primer. 6S RNA was synthesized by T7 RNA polymerase (Thermo Fisher Scientific), purified by 8% denaturing PAGE, treated with DNase I and ethanol precipitated. The cleavage reactions were performed in low adhesion tubes at 37ଌ in a buffer containing 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10% glycerol and 10 mM MnCl2. To analyze the effect of various divalent cations 10 mM MgCl2, CoCl2, CuCl2 or ZnCl2 were added instead of MnCl2. 500 nM of KmAgo was mixed with 500 nM guide DNA or RNA and incubated for 10 min at 37ଌ for guide loading. All guides were 5′-phosphorylated using T4 PNK (New England Biolabs) except for experiments with 5′-OH guides. Target DNA or RNA was then added to the final concentration of 100 nM. For analysis of temperature dependence of ssDNA cleavage, KmAgo was loaded with guide DNA for 10 min at 37ଌ, the samples were transferred to indicated temperatures in a dry block heater (BioSan, CH-100), target DNA or RNA was added and the samples were incubated for 4 minutes with G-DNA and T-DNA, 40 min with G-DNA and T-RNA and 60 minutes for G-RNA with T-DNA or T-RNA. For experiments on multiple turnover cleavage (Supplementary Figure S4A), an excess of target DNA (200 nM) was incubated with 100 nM KmAgo-guide complex (equimolar KmAgo and guide ratio) at 37ଌ or 60ଌ. For experiments in Supplementary Figure S4B, 50 or 100 nM of the KmAgo-guide complex was incubated for 30 min with 200 nM of label-free target DNA and then 5′-Cy3 labeled target DNA was added to 200 nM concentration. For analysis of 6S RNA cleavage, the reactions were performed for 30 minutes with corresponding DNA guides. All reactions were carried out at 37 or 60ଌ as indicated. The reactions were stopped after indicated time intervals by mixing the samples with equal volumes of stop solution (8 M urea, 20 mM EDTA, 0.005% Bromophenol Blue, 0.005% Xylene Cyanol). The cleavage products were resolved by 19% denaturing PAGE, stained with SYBR Gold (Invitrogen) or visualized with a Typhoon FLA 9500 scanner (GE Healthcare) in the case of 5'- 32 P-labeled targets, and analyzed by the ImageQuant (GE Healthcare) software. For reactions containing Cy3-labels, the gels with the reaction products were first scanned in the Cy3 channel and then stained with SYBR Gold. In the case of 6S RNA, the cleavage products were resolved by 10% denaturing PAGE and stained with SYBR Gold.

Plasmid DNA cleavage

For analysis of plasmid DNA cleavage, the final pAgo and guide concentrations were 500 nM. When using two or four guide molecules, the samples of KmAgo were independently loaded with the guides (at the 1:1 KmAgo:guide ratio) and then mixed together to the final concentration of 500 nM. The sequences of all guide oligonucleotides are shown in Supplementary Table S1. The target plasmids used in the assays are pJET1.2 derivatives (Thermo Fisher Scientific) containing short inserts shown in Supplementary Table S1. The plasmid was added to the reaction mixtures to the final concentration of 2 nM, followed by incubation for indicated time intervals at 37 or 60ଌ. SSB proteins (E. coli SSB purified as described before (6) or thermostable ET SSB purchased from New England BioLabs) were added to the reaction mixtures to the final concentration of 1 μM 10 min prior to the addition of KmAgo, when indicated. The reactions were stopped by treatment with Proteinase K for 20 min at 25ଌ, the samples were mixed with 6× SDS-free Purple Loading Dye (New England Biolabs) supplemented with SYBR Gold and the cleavage products were resolved by native 1.2% agarose gel electrophoresis. The relaxed plasmid in control samples was generated by treatment of the supercoiled plasmid with RNase H2 (New England Biolabs) for 2 h at 37ଌ, the linear plasmid was obtained by treatment with a single cut restriction endonuclease (XhoI, Thermo Fisher Scientific).


Hlavné body

  1. Characterization of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-induced mutant alleles and fluorescent protein reporter constructs of entire MIR172 rodina.
  2. microRNA172 activity at the shoot apical meristem (SAM) is crucially important for floral transition under short-day (SD) conditions.
  3. Coordinated transcriptional and posttranscriptional mechanisms repress the activity of APETALA2-LIKE (AP2-LIKE) transcription factors (TFs) during flowering.

12.2 Visualizing and Characterizing DNA, RNA, and Protein

The sequence of a DNA molecule can help us identify an organism when compared to known sequences housed in a database. The sequence can also tell us something about the function of a particular part of the DNA, such as whether it encodes a particular protein. Comparing protein signatures —the expression levels of specific arrays of proteins—between samples is an important method for evaluating cellular responses to a multitude of environmental factors and stresses. Analysis of protein signatures can reveal the identity of an organism or how a cell is responding during disease.

The DNA and proteins of interest are microscopic and typically mixed in with many other molecules including DNA or proteins irrelevant to our interests. Many techniques have been developed to isolate and characterize molecules of interest. These methods were originally developed for research purposes, but in many cases they have been simplified to the point that routine clinical use is possible. For example, many pathogens, such as the bacterium Helicobacter pylori , which causes stomach ulcers , can be detected using protein-based tests. In addition, an increasing number of highly specific and accurate DNA amplification-based identification assays can now detect pathogens such as antibiotic-resistant enteric bacteria, herpes simplex virus , varicella-zoster virus , and many others.

Molecular Analysis of DNA

In this subsection, we will outline some of the basic methods used for separating and visualizing specific fragments of DNA that are of interest to a scientist. Some of these methods do not require knowledge of the complete sequence of the DNA molecule. Before the advent of rapid DNA sequencing, these methods were the only ones available to work with DNA, but they still form the basic arsenal of tools used by molecular geneticists to study the body’s responses to microbial and other diseases.

Nucleic Acid Probing

DNA molecules are small, and the information contained in their sequence is invisible. How does a researcher isolate a particular stretch of DNA, or having isolated it, determine what organism it is from, what its sequence is, or what its function is? One method to identify the presence of a certain DNA sequence uses artificially constructed pieces of DNA called probes. Probes can be used to identify different bacterial species in the environment and many DNA probes are now available to detect pathogens clinically. For example, DNA probes are used to detect the vaginal pathogens Candida albicans , Gardnerella vaginalis a Trichomonas vaginalis .

To screen a genomic library for a particular gene or sequence of interest, researchers must know something about that gene. If researchers have a portion of the sequence of DNA for the gene of interest, they can design a DNA probe , a single-stranded DNA fragment that is complementary to part of the gene of interest and different from other DNA sequences in the sample. The DNA probe may be synthesized chemically by commercial laboratories, or it may be created by cloning, isolating, and denaturing a DNA fragment from a living organism. In either case, the DNA probe must be labeled with a molecular tag or beacon, such as a radioactive phosphorus atom (as is used for autoradiography ) or a fluorescent dye (as is used in fluorescent in situ hybridization, or FISH), so that the probe and the DNA it binds to can be seen (Figure 12.13). The DNA sample being probed must also be denatured to make it single-stranded so that the single-stranded DNA probe can anneal to the single-stranded DNA sample at locations where their sequences are complementary. While these techniques are valuable for diagnosis, their direct use on sputum and other bodily samples may be problematic due to the complex nature of these samples. DNA often must first be isolated from bodily samples through chemical extraction methods before a DNA probe can be used to identify pathogens.

Clinical Focus

Časť 2

The mild, flu-like symptoms that Kayla is experiencing could be caused by any number of infectious agents. In addition, several non-infectious autoimmune conditions, such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus (SLE), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also have symptoms that are consistent with Kayla’s early symptoms. However, over the course of several weeks, Kayla’s symptoms worsened. She began to experience joint pain in her knees, heart palpitations, and a strange limpness in her facial muscles. In addition, she suffered from a stiff neck and painful headaches. Reluctantly, she decided it was time to seek medical attention.

  • Do Kayla’s new symptoms provide any clues as to what type of infection or other medical condition she may have?
  • What tests or tools might a health-care provider use to pinpoint the pathogen causing Kayla’s symptoms?

Jump to the next Clinical Focus box. Go back to the previous Clinical Focus box.

Agarose Gel Electrophoresis

There are a number of situations in which a researcher might want to physically separate a collection of DNA fragments of different sizes. A researcher may also digest a DNA sample with a restriction enzyme to form fragments. The resulting size and fragment distribution pattern can often yield useful information about the sequence of DNA bases that can be used, much like a bar-code scan, to identify the individual or species to which the DNA belongs.

Gel electrophoresis is a technique commonly used to separate biological molecules based on size and biochemical characteristics, such as charge and polarity. Agarose gel electrophoresis is widely used to separate DNA (or RNA) of varying sizes that may be generated by restriction enzyme digestion or by other means, such as the PCR (Figure 12.14).

Due to its negatively charged backbone, DNA is strongly attracted to a positive electrode. In agarose gel electrophoresis, the gel is oriented horizontally in a buffer solution. Samples are loaded into sample wells on the side of the gel closest to the negative electrode, then drawn through the molecular sieve of the agarose matrix toward the positive electrode. The agarose matrix impedes the movement of larger molecules through the gel, whereas smaller molecules pass through more readily. Thus, the distance of migration is inversely correlated to the size of the DNA fragment, with smaller fragments traveling a longer distance through the gel. Sizes of DNA fragments within a sample can be estimated by comparison to fragments of known size in a DNA ladder also run on the same gel. To separate very large DNA fragments, such as chromosomes or viral genomes, agarose gel electrophoresis can be modified by periodically alternating the orientation of the electric field during pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) . In PFGE , smaller fragments can reorient themselves and migrate slightly faster than larger fragments and this technique can thus serve to separate very large fragments that would otherwise travel together during standard agarose gel electrophoresis. In any of these electrophoresis techniques, the locations of the DNA or RNA fragments in the gel can be detected by various methods. One common method is adding ethidium bromide , a stain that inserts into the nucleic acids at non-specific locations and can be visualized when exposed to ultraviolet light. Other stains that are safer than ethidium bromide, a potential carcinogen, are now available.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis

Restriction enzyme recognition sites are short (only a few nucleotides long), sequence-specific palindromes, and may be found throughout the genome. Thus, differences in DNA sequences in the genomes of individuals will lead to differences in distribution of restriction-enzyme recognition sites that can be visualized as distinct banding patterns on a gel after agarose gel electrophoresis. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis compares DNA banding patterns of different DNA samples after restriction digestion (Figure 12.15).

RFLP analysis has many practical applications in both medicine and forensic science . For example, epidemiologists use RFLP analysis to track and identify the source of specific microorganisms implicated in outbreaks of food poisoning or certain infectious diseases. RFLP analysis can also be used on human DNA to determine inheritance patterns of chromosomes with variant genes, including those associated with heritable diseases or to establish paternity .

Forensic scientists use RFLP analysis as a form of DNA fingerprinting , which is useful for analyzing DNA obtained from crime scenes, suspects, and victims. DNA samples are collected, the numbers of copies of the sample DNA molecules are increased using PCR , and then subjected to restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis to generate specific banding patterns. By comparing the banding patterns of samples collected from the crime scene against those collected from suspects or victims, investigators can definitively determine whether DNA evidence collected at the scene was left behind by suspects or victims.

Southern Blots and Modifications

Several molecular techniques capitalize on sequence complementarity and hybridization between nucleic acids of a sample and DNA probes. Typically, probing nucleic-acid samples within a gel is unsuccessful because as the DNA probe soaks into a gel, the sample nucleic acids within the gel diffuse out. Thus, blotting techniques are commonly used to transfer nucleic acids to a thin, positively charged membrane made of nitrocellulose or nylon. In the Southern blot technique, developed by Sir Edwin Southern in 1975, DNA fragments within a sample are first separated by agarose gel electrophoresis and then transferred to a membrane through capillary action (Figure 12.16). The DNA fragments that bind to the surface of the membrane are then exposed to a specific single-stranded DNA probe labeled with a radioactive or fluorescent molecular beacon to aid in detection. Southern blots may be used to detect the presence of certain DNA sequences in a given DNA sample. Once the target DNA within the membrane is visualized, researchers can cut out the portion of the membrane containing the fragment to recover the DNA fragment of interest.

Variations of the Southern blot—the dot blot, slot blot, and the spot blot—do not involve electrophoresis, but instead concentrate DNA from a sample into a small location on a membrane. After hybridization with a DNA probe, the signal intensity detected is measured, allowing the researcher to estimate the amount of target DNA present within the sample.

A colony blot is another variation of the Southern blot in which colonies representing different clones in a genomic library are transferred to a membrane by pressing the membrane onto the culture plate. The cells on the membrane are lysed and the membrane can then be probed to determine which colonies within a genomic library harbor the target gene. Because the colonies on the plate are still growing, the cells of interest can be isolated from the plate.

In the northern blot , another variation of the Southern blot, RNA (not DNA) is immobilized on the membrane and probed. Northern blots are typically used to detect the amount of mRNA made through gene expression within a tissue or organism sample.

Microarray Analysis

Another technique that capitalizes on the hybridization between complementary nucleic acid sequences is called microarray analysis . Microarray analysis is useful for the comparison of gene-expression patterns between different cell types—for example, cells infected with a virus versus uninfected cells, or cancerous cells versus healthy cells (Figure 12.17).

Typically, DNA or cDNA from an experimental sample is deposited on a glass slide alongside known DNA sequences. Each slide can hold more than 30,000 different DNA fragment types. Distinct DNA fragments (encompassing an organism’s entire genomic library) or cDNA fragments (corresponding to an organism’s full complement of expressed genes) can be individually spotted on a glass slide.

Once deposited on the slide, genomic DNA or mRNA can be isolated from the two samples for comparison. If mRNA is isolated, it is reverse-transcribed to cDNA using reverse transcriptase. Then the two samples of genomic DNA or cDNA are labeled with different fluorescent dyes (typically red and green). The labeled genomic DNA samples are then combined in equal amounts, added to the microarray chip, and allowed to hybridize to complementary spots on the microarray.

Hybridization of sample genomic DNA molecules can be monitored by measuring the intensity of fluorescence at particular spots on the microarray. Differences in the amount of hybridization between the samples can be readily observed. If only one sample’s nucleic acids hybridize to a particular spot on the microarray, then that spot will appear either green or red. However, if both samples’ nucleic acids hybridize, then the spot will appear yellow due to the combination of the red and green dyes.

Although microarray technology allows for a holistic comparison between two samples in a short time, it requires sophisticated (and expensive) detection equipment and analysis software. Because of the expense, this technology is typically limited to research settings. Researchers have used microarray analysis to study how gene expression is affected in organisms that are infected by bacteria or viruses or subjected to certain chemical treatments.

Odkaz na Učenie

Explore microchip technology at this interactive website.

Check Your Understanding

  • What does a DNA probe consist of?
  • Why is a Southern blot used after gel electrophoresis of a DNA digest?

Molecular Analysis of Proteins

In many cases it may not be desirable or possible to study DNA or RNA directly. Proteins can provide species-specific information for identification as well as important information about how and whether a cell or tissue is responding to the presence of a pathogenic microorganism. Various proteins require different methods for isolation and characterization.

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

A variation of gel electrophoresis, called polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) , is commonly used for separating proteins. In PAGE , the gel matrix is finer and composed of polyacrylamide instead of agarose. Additionally, PAGE is typically performed using a vertical gel apparatus (Figure 12.18). Because of the varying charges associated with amino acid side chains, PAGE can be used to separate intact proteins based on their net charges. Alternatively, proteins can be denatured and coated with a negatively charged detergent called sodium dodecyl sulfate (SDS) , masking the native charges and allowing separation based on size only. PAGE can be further modified to separate proteins based on two characteristics, such as their charges at various pHs as well as their size, through the use of two-dimensional PAGE . In any of these cases, following electrophoresis, proteins are visualized through staining, commonly with either Coomassie blue or a silver stain.

Check Your Understanding

Clinical Focus

Časť 3

When Kayla described her symptoms, her physician at first suspected bacterial meningitis , which is consistent with her headaches and stiff neck. However, she soon ruled this out as a possibility because meningitis typically progresses more quickly than what Kayla was experiencing. Many of her symptoms still paralleled those of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and systemic lupus erythematosus (SLE) , and the physician also considered Lyme disease a possibility given how much time Kayla spends in the woods. Kayla did not recall any recent tick bites (the typical means by which Lyme disease is transmitted) and she did not have the typical bull’s-eye rash associated with Lyme disease (Figure 12.19). However, 20–30% of patients with Lyme disease never develop this rash, so the physician did not want to rule it out.

Kayla’s doctor ordered an MRI of her brain, a complete blood count to test for anemia, blood tests assessing liver and kidney function, and additional tests to confirm or rule out SLE or Lyme disease. Her test results were inconsistent with both SLE and ALS, and the result of the test looking for Lyme disease antibodies was “equivocal,” meaning inconclusive. Having ruled out ALS and SLE, Kayla’s doctor decided to run additional tests for Lyme disease.

  • Why would Kayla’s doctor still suspect Lyme disease even if the test results did not detect Lyme antibodies in the blood?
  • What type of molecular test might be used for the detection of blood antibodies to Lyme disease?

Jump to the next Clinical Focus box. Go back to the previous Clinical Focus box.

Amplification-Based DNA Analysis Methods

Various methods can be used for obtaining sequences of DNA, which are useful for studying disease-causing organisms. With the advent of rapid sequencing technology, our knowledge base of the entire genomes of pathogenic organisms has grown phenomenally. We start with a description of the polymerase chain reaction, which is not a sequencing method but has allowed researchers and clinicians to obtain the large quantities of DNA needed for sequencing and other studies. The polymerase chain reaction eliminates the dependence we once had on cells to make multiple copies of DNA, achieving the same result through relatively simple reactions outside the cell.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Most methods of DNA analysis, such as restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis, or DNA sequencing require large amounts of a specific DNA fragment. In the past, large amounts of DNA were produced by growing the host cells of a genomic library. However, libraries take time and effort to prepare and DNA samples of interest often come in minute quantities. The polymerase chain reaction (PCR) permits rapid amplification in the number of copies of specific DNA sequences for further analysis (Figure 12.20). One of the most powerful techniques in molecular biology, PCR was developed in 1983 by Kary Mullis while at Cetus Corporation. PCR has specific applications in research, forensic, and clinical laboratories, including:

  • determining the sequence of nucleotides in a specific region of DNA
  • amplifying a target region of DNA for cloning into a plasmid vector
  • identifying the source of a DNA sample left at a crime scene
  • analyzing samples to determine paternity
  • comparing samples of ancient DNA with modern organisms
  • determining the presence of difficult to culture, or unculturable, microorganisms in humans or environmental samples

PCR is an in vitro laboratory technique that takes advantage of the natural process of DNA replication. The heat-stable DNA polymerase enzymes used in PCR are derived from hyperthermophilic prokaryotes. Taq DNA polymerase , commonly used in PCR, is derived from the Thermus aquaticus bacterium isolated from a hot spring in Yellowstone National Park. DNA replication requires the use of primers for the initiation of replication to have free 3ʹ-hydroxyl groups available for the addition of nucleotides by DNA polymerase. However, while primers composed of RNA are normally used in cells, DNA primers are used for PCR. DNA primers are preferable due to their stability, and DNA primers with known sequences targeting a specific DNA region can be chemically synthesized commercially. These DNA primers are functionally similar to the DNA probes used for the various hybridization techniques described earlier, binding to specific targets due to complementarity between the target DNA sequence and the primer.

PCR occurs over multiple cycles, each containing three steps: denaturation , annealing , and extension. Machines called thermal cycler s are used for PCR these machines can be programmed to automatically cycle through the temperatures required at each step (Figure 12.1). First, double-stranded template DNA containing the target sequence is denatured at approximately 95 °C. The high temperature required to physically (rather than enzymatically) separate the DNA strands is the reason the heat-stable DNA polymerase is required. Next, the temperature is lowered to approximately 50 °C. This allows the DNA primers complementary to the ends of the target sequence to anneal (stick) to the template strands, with one primer annealing to each strand. Finally, the temperature is raised to 72 °C, the optimal temperature for the activity of the heat-stable DNA polymerase, allowing for the addition of nucleotides to the primer using the single-stranded target as a template. Each cycle doubles the number of double-stranded target DNA copies. Typically, PCR protocols include 25–40 cycles, allowing for the amplification of a single target sequence by tens of millions to over a trillion.

Natural DNA replication is designed to copy the entire genome, and initiates at one or more origin sites. Primers are constructed during replication, not before, and do not consist of a few specific sequences. PCR targets specific regions of a DNA sample using sequence-specific primers. In recent years, a variety of isothermal PCR amplification methods that circumvent the need for thermal cycling have been developed, taking advantage of accessory proteins that aid in the DNA replication process. As the development of these methods continues and their use becomes more widespread in research, forensic, and clinical labs, thermal cyclers may become obsolete.

Odkaz na Učenie

Deepen your understanding of the polymerase chain reaction by viewing this animation and working through an interactive exercise.

PCR Variations

Several later modifications to PCR further increase the utility of this technique. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is used for obtaining DNA copies of a specific mRNA molecule. RT-PCR begins with the use of the reverse transcriptase enzyme to convert mRNA molecules into cDNA . That cDNA is then used as a template for traditional PCR amplification. RT-PCR can detect whether a specific gene has been expressed in a sample. Another recent application of PCR is real-time PCR , also known as quantitative PCR (qPCR) . Standard PCR and RT-PCR protocols are not quantitative because any one of the reagents may become limiting before all of the cycles within the protocol are complete, and samples are only analyzed at the end. Because it is not possible to determine when in the PCR or RT-PCR protocol a given reagent has become limiting, it is not possible to know how many cycles were completed prior to this point, and thus it is not possible to determine how many original template molecules were present in the sample at the start of PCR. In qPCR, however, the use of fluorescence allows one to monitor the increase in a double-stranded template during a PCR reaction as it occurs. These kinetics data can then be used to quantify the amount of the original target sequence. The use of qPCR in recent years has further expanded the capabilities of PCR, allowing researchers to determine the number of DNA copies, and sometimes organisms, present in a sample. In clinical settings, qRT-PCR is used to determine viral load in HIV-positive patients to evaluate the effectiveness of their therapy.

DNA Sequencing

A basic sequencing technique is the chain termination method , also known as the dideoxy method or the Sanger DNA sequencing method , developed by Frederick Sanger in 1972. The chain termination method involves DNA replication of a single-stranded template with the use of a DNA primer to initiate synthesis of a complementary strand, DNA polymerase, a mix of the four regular deoxynucleotide (dNTP) monomers, and a small proportion of dideoxynucleotides (ddNTPs), each labeled with a molecular beacon . The ddNTPs are monomers missing a hydroxyl group (–OH) at the site at which another nucleotide usually attaches to form a chain (Figure 12.21). Every time a ddNTP is randomly incorporated into the growing complementary strand, it terminates the process of DNA replication for that particular strand. This results in multiple short strands of replicated DNA that are each terminated at a different point during replication. When the reaction mixture is subjected to gel electrophoresis, the multiple newly replicated DNA strands form a ladder of differing sizes. Because the ddNTPs are labeled, each band on the gel reflects the size of the DNA strand when the ddNTP terminated the reaction.

In Sanger’s day, four reactions were set up for each DNA molecule being sequenced, each reaction containing only one of the four possible ddNTPs. Each ddNTP was labeled with a radioactive phosphorus molecule. The products of the four reactions were then run in separate lanes side by side on long, narrow PAGE gels, and the bands of varying lengths were detected by autoradiography. Today, this process has been simplified with the use of ddNTPs, each labeled with a different colored fluorescent dye or fluorochrome (Figure 12.22), in one sequencing reaction containing all four possible ddNTPs for each DNA molecule being sequenced (Figure 12.23). These fluorochromes are detected by fluorescence spectroscopy. Determining the fluorescence color of each band as it passes by the detector produces the nucleotide sequence of the template strand.

Since 2005, automated sequencing techniques used by laboratories fall under the umbrella of next generation sequencing , which is a group of automated techniques used for rapid DNA sequencing. These methods have revolutionized the field of molecular genetics because the low-cost sequencers can generate sequences of hundreds of thousands or millions of short fragments (25 to 600 base pairs) just in one day. Although several variants of next generation sequencing technologies are made by different companies (for example, 454 Life Sciences’ pyrosequencing and Illumina’s Solexa technology), they all allow millions of bases to be sequenced quickly, making the sequencing of entire genomes relatively easy, inexpensive, and commonplace. In 454 sequencing (pyrosequencing) , for example, a DNA sample is fragmented into 400–600-bp single-strand fragments, modified with the addition of DNA adapters to both ends of each fragment. Each DNA fragment is then immobilized on a bead and amplified by PCR, using primers designed to anneal to the adapters, creating a bead containing many copies of that DNA fragment. Each bead is then put into a separate well containing sequencing enzymes. To the well, each of the four nucleotides is added one after the other when each one is incorporated, pyrophosphate is released as a byproduct of polymerization, emitting a small flash of light that is recorded by a detector. This provides the order of nucleotides incorporated as a new strand of DNA is made and is an example of synthesis sequencing. Next generation sequencers use sophisticated software to get through the cumbersome process of putting all the fragments in order. Overall, these technologies continue to advance rapidly, decreasing the cost of sequencing and increasing the availability of sequence data from a wide variety of organisms quickly.

The National Center for Biotechnology Information houses a widely used genetic sequence database called GenBank where researchers deposit genetic information for public use. Upon publication of sequence data, researchers upload it to GenBank, giving other researchers access to the information. The collaboration allows researchers to compare newly discovered or unknown sample sequence information with the vast array of sequence data that already exists.

Odkaz na Učenie

View an animation about 454 sequencing to deepen your understanding of this method.

Case in Point

Using a NAAT to Diagnose a C. difficile Infekcia

Javier, an 80-year-old patient with a history of heart disease, recently returned home from the hospital after undergoing an angioplasty procedure to insert a stent into a cardiac artery. To minimize the possibility of infection, Javier was administered intravenous broad-spectrum antibiotics during and shortly after his procedure. He was released four days after the procedure, but a week later, he began to experience mild abdominal cramping and watery diarrhea several times a day. He lost his appetite, became severely dehydrated, and developed a fever. He also noticed blood in his stool. Javier’s wife called the physician, who instructed her to take him to the emergency room immediately.

The hospital staff ran several tests and found that Javier’s kidney creatinine levels were elevated compared with the levels in his blood, indicating that his kidneys were not functioning well. Javier’s symptoms suggested a possible infection with Clostridium difficile , a bacterium that is resistant to many antibiotics. The hospital collected and cultured a stool sample to look for the production of toxins A and B by C. difficile, but the results came back negative. However, the negative results were not enough to rule out a C. difficile infection because culturing of C. difficile and detection of its characteristic toxins can be difficult, particularly in some types of samples. To be safe, they proceeded with a diagnostic nucleic acid amplification test (NAAT). Currently NAATs are the clinical diagnostician’s gold standard for detecting the genetic material of a pathogen. In Javier’s case, qPCR was used to look for the gene encoding C. difficile toxin B (tcdB). When the qPCR analysis came back positive, the attending physician concluded that Javier was indeed suffering from a C. difficile infection and immediately prescribed the antibiotic vancomycin , to be administered intravenously. The antibiotic cleared the infection and Javier made a full recovery.

Because infections with C. difficile were becoming widespread in Javier’s community, his sample was further analyzed to see whether the specific strain of C. difficile could be identified. Javier’s stool sample was subjected to ribotyping and repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) analysis. In ribotyping, a short sequence of DNA between the 16S rRNA and 23S rRNA genes is amplified and subjected to restriction digestion (Figure 12.24). This sequence varies between strains of C. difficile, so restriction enzymes will cut in different places. In rep-PCR, DNA primers designed to bind to short sequences commonly found repeated within the C. difficile genome were used for PCR. Following restriction digestion, agarose gel electrophoresis was performed in both types of analysis to examine the banding patterns that resulted from each procedure (Figure 12.25). Rep-PCR can be used to further subtype various ribotypes, increasing resolution for detecting differences between strains. The ribotype of the strain infecting Javier was found to be ribotype 27, a strain known for its increased virulence, resistance to antibiotics, and increased prevalence in the United States, Canada, Japan, and Europe. 4


Pozri si video: 10 глупых вопросов ПИАР-СПЕЦИАЛИСТУ (Február 2023).