Informácie

Aké sú požiadavky na sekundárnu štruktúru peptidov prenikajúcich do buniek AKA proteínových transdukčných domén

Aké sú požiadavky na sekundárnu štruktúru peptidov prenikajúcich do buniek AKA proteínových transdukčných domén


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Peptidy prenikajúce do buniek.

Bunkové penetračné peptidy (CPP) sú triedou krátkych aminokyselinových sekvencií, ktoré sú dostatočné na kríženie bunkových membrán a dodanie sa spolu s akýmkoľvek naviazaným nákladom do cytoplazmy buniek. Nedávno boli označené ako CPP, zatiaľ čo termín „doména transdukcie proteínov“ (PTD) sa používal v prvých dňoch ich štúdie, keď sa potrebné sekvencie izolovali z natívnych proteínov s aktivitou prenikajúcou bunkami (najmä HIV-1 Tat) .

Väčšina vedeckej literatúry, ktorú som našiel o CPP, sa zameriava na ich potenciálny význam pre cielené dodávanie liečiva a väčšinou diskutuje o dodávke proteínov a nanočastíc prostredníctvom fúzie CPP na N-koniec cieľového proteínu. Jediná otázka a odpoveď tohto webu na CPP tiež poukazuje na diskusiu o N-koncovej fúzii CPP s nákladným peptidom. Od článku z roku 2005, na ktorý sa v tomto príspevku odkazuje, prešiel však výskum peptidov prenikajúcich bunkami dlhej cesty.

Prehľad Milletti z roku 2012 zdôrazňuje, že došlo k dramatickému zvýšeniu počtu rôznych tried peptidov prenikajúcich do buniek, vrátane hydrofóbnych CPP, primárnych amfipatických CPP, alfa-helikálnych amfipatických CPP, beta-listových amfipatických CPP a CPP bohatých na prolín. . A to len medzi rokmi 2005 a 2012! Článok Milletti 2012 zahŕňa aj niektoré CPP izolované z iných vírusov.

Odvtedy sa mi nepodarilo nájsť recenziu na podobný detail, ako som napísal, aj keď som si istý, že v tejto oblasti došlo k veľkému pokroku.

Aj keď to nie je moja hlavná otázka, ocenil by som akékoľvek citácie na novšie recenzie, ktoré sa podrobne venujú molekulárnemu mechanizmu bunkovej penetrácie jednej alebo viacerých tried CPP - najmä prehľad funkcie PTD v ich natívnych proteínoch.

Začal som skúmať CPP a PTD v ich natívnych proteínoch a v prostredí podávania liekov, pretože sa ukázalo, že proteín, ktorý študujem v rámci bakalárskej práce, môže mať interné PTD, ktoré je nevyhnutné pre jeho funkciu. Nie som odborník na túto tému a ocenil by som informácie o CPP/PTD vrátane ďalších synoným pre CPP/PTD, ktoré mi pomôžu pri hľadaní literatúry – najmä synonymá špecifické pre natívne proteíny s funkciami podobnými CPP.

Aké sú požiadavky na sekundárnu štruktúru peptidov prenikajúcich do buniek?

Moja otázka je, či predtým popísané pozitívne nabité CPP a/alebo nové triedy CPP popísané v Milletti 2012 fungujú iba ako fúzie na N-termináloch, alebo či spravidla efektívne fungujú, keď sú začlenené do vnútornej slučky. (pokiaľ ide o primárnu sekvenciu, ale stále vystavené rozpúšťadlu). V článku z roku 2005 citovanom v predchádzajúcej otázke na túto tému na tejto stránke sa uvádza, že CPP odvodený od HIV-1 Tat je založený na zvyškoch 47-57, ktoré sú vnútornými zvyškami proteínu s 86 aminokyselinami-proteínu, ktorý má aktivitu prenikajúcu bunkami. vo svojej pôvodnej úlohe pri infekcii HIV-1.

Preto moja otázka nie je, či k tomu niekedy dôjde - jednoznačne áno - ale do akej miery majú CPP izolované z vnútorných sekvencií natívnych proteínov funkcie podobné CPP v ich natívnych proteínoch?

Systém, ktorý študujem pre moju diplomovú prácu, je vírus, takže akékoľvek informácie konkrétne o funkcii CPP a PTD v natívnych proteínoch vírusov by boli obzvlášť užitočné.


Referencie

Jones, S. W., Christison, R., Bundell, K., Voyce, C. J., Brockbank, S. M. V., Newham, P., & Lindsay, M. A. (2005). Charakterizácia dodania peptidu sprostredkovaného bunkami prenikajúceho peptidu. British Journal of Pharmacology, 145(8), 1093-1102. http://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706279

Milletti, F. (2012). Recenzia: Peptidy prenikajúce bunkami: triedy, pôvod a súčasná krajina. Drug Discovery Today, 17850-860. doi: 10.1016/j.drudis.2012.03.002

Vivès, E., Brodin, P., & Lebleu, B. (1997). Skrátená základná doména proteínu HIV-1 Tat sa rýchlo translokuje cez plazmatickú membránu a akumuluje sa v bunkovom jadre. The Journal Of Biological Chemistry, 272 (25), 16010-16017.

Ak niekto, kto má záujem o odpoveď na túto otázku, nie je odborníkom, najlepší zdroj, ktorý môžem v súčasnosti poskytnúť pre zoznam CPP odvodených z prírodných bielkovín (okrem vyššie uvedeného článku Milletti 2012), je:

Hallbrink, M., Kilk, K., Elmquist, A., Lundberg, P., Lindgren, M., Jiang, Y., & ... Langel, U. (n.d). Predikcia bunkami prenikajúcich peptidov. International Journal of Peptide Research And Therapeutics, 11 (4), 249-259.


Budem pokračovať vo výskume tejto témy pre svoju diplomovú prácu, takže ak vás zaujíma odpoveď na túto otázku, ale potrebujete viac informácií, neváhajte sa vyjadriť a požiadať o konkrétne informácie, ktoré by vám pomohli.

Ďakujem!


Na vašu otázku nemôžem poskytnúť vysvetlenie ako na jednu odpoveď, ale som si istý, že nižšie uvedené články vaše pochybnosti objasnia.

  1. Peptidy prenikajúce do buniek: Stratégie dizajnu nad rámec primárnej štruktúry a amfipatie - Molecules 2017, 22(11), 1929; doi: 10,3390/molekuly22111929. PMID: 29117144

  2. Peptidy prenikajúce do buniek a ich využitie pri modifikáciách funkcie genómu (Prehľad). Int J Mol Med. 2017 december;40(6):1615-1623. doi: 10.3892/ijmm.2017.3172. Epub 2017 4. októbra PMID: 29039455

  3. Kvantitatívna fluorescenčná spektroskopia a analýzy prietokovej cytometrie dráh internalizácie peptidov prenikajúcich bunkami: optimalizácia, úskalia, porovnanie s kvantifikáciou hmotnostnej spektrometrie. Scientific Reports volume 6, Article number: 36938 (2016). doi: 10,1038/srep36938


Peptidy prenikajúce bunkami: od molekulárnych mechanizmov k terapeutikám

Nedávny objav nových účinných terapeutických molekúl, ktoré sa nedostanú na kliniku kvôli zlému dodaniu a nízkej biologickej dostupnosti, urobil z dodávania molekúl kľúčový kameň v terapeutickom vývoji. Na zlepšenie absorpcie terapeutických molekúl bunkami bolo navrhnutých niekoľko, vrátane CPP (peptidy prenikajúce bunkami), ktoré predstavujú nový a inovatívny koncept na obídenie problému biologickej dostupnosti liečiv. CPP predstavujú veľmi sľubné nástroje a boli úspešne žiadané in vivo. Doteraz boli opísané dve stratégie CPP, prvá vyžaduje chemické spojenie medzi liečivom a nosičom na internalizáciu liečiva do bunky a druhá je založená na tvorbe stabilných komplexov s liečivami v závislosti od ich chemickej povahy. Rodiny Pep a MPG sú krátke amfipatické peptidy, ktoré tvoria stabilné nanočastice s proteínmi a nukleovými kyselinami. Nanočastice na báze MPG a Pep vstupujú do buniek nezávisle od endozomálnej dráhy a účinne dodávajú náklad v plne biologicky aktívnej forme do veľkého množstva bunkových línií, ako aj do zvieracích modelov. Tento prehľad sa zameriava na vzťah medzi štruktúrou a funkciou nekovalentných stratégií MPG a Pep-1 a ich požiadavku na bunkovú absorpciu biomolekúl a aplikácie v kultivovaných bunkách a zvieracích modeloch.

Použité skratky:


Abstraktné

Peptidy prenikajúce do buniek (CPP) môžu transportovať rôzne náklady cez membrány živých buniek. Pretože prvé generácie CPP trpeli nedostatočnou selektivitou buniek a tkanív, stabilitou voči proteázam a únikom z endozómov, bola vyvinutá nová generácia peptidov s optimalizovanými vlastnosťami. Buď sú odvodené z prírodných zdrojov, alebo sú vytvorené kombináciou multivalentných štruktúr. Druhý spôsob umožňuje dosiahnuť vysokú internalizačnú účinnosť, vysokú selektivitu buniek a tkanív a uvoľnenie z endozómov prostredníctvom hybridných štruktúr, pričom sa kombinujú sekvencie na endozomálne uvoľnenie, navádzacie sekvencie a sekvencie na aktiváciu v cieľovom tkanive a na lokálne dodanie nákladov. CPP s vrodenou nádorovou selektivitou zahŕňajú azurín, krotamín, maurokalcín, lykozín-I, byvolí katelicidín a peptid CB5005. Niektoré z nich môžu preniknúť cez membrány živých buniek a ovplyvniť intracelulárne signálne dráhy, čím pôsobia cytotoxicky proti nádorovým bunkám. Aby sa získala viacvrstvová penetrácia a stabilizácia proti proteolytickej degradácii, ako aj kvôli lepšej manipulácii, CPP sa často konjugujú s nanočasticami. Zvláštnym problémom pri liečbe nádorov je účinnosť transportu liečiva cez trojrozmerné bunkové kultúry. Schopnosť CPP dodávať liečivo aj do najvnútornejších tkanív má preto zásadný význam. Schopnosť niektorých CPP preniknúť cez bariéry, ako je koža, hematoencefalická bariéra (BBB) ​​a rohovka alebo spojivka očí, umožnila nahradenie nebezpečných a bolestivých injekcií upokojujúcimi sprejmi, krémami a kvapkami. Je však ťažké hodnotiť účinnosť CPP, pretože účinnosť transportu a selektivita tkaniva závisí nielen od samotného CPP, ale aj od cieľového tkaniva alebo orgánu, ako aj od nákladu a spôsobu spájania CPP s nákladom. Tento prehľad preto popisuje niekoľko príkladov CPP novej generácie a jeho cieľom je poskytnúť rady, ako nájsť alebo vytvoriť správne CPP pre danú úlohu.


Kapitola 10 - Dodávka peptidu a proteínu s peptidmi prenikajúcimi do buniek

Najbežnejšie používané peptidy prenikajúce bunkami (CPP): Tat, oligoarginín a transportán, bolo ukázané, že uľahčujú vstup nákladu proteínu/peptidu do buniek in vitro aj in vivo. V bunkových systémoch vykazuje transportán väčšie internalizačné vlastnosti ako vyššie uvedené CPP bohaté na arginín a ich účinnosť absorpcie môže byť znázornená nasledovne: transportán > oligoarginín > peptid Tat. Pri výbere „správnej“ sekvencie CPP na doručovanie nákladu je potrebné vziať do úvahy oba tieto aspekty a pri použití nižších koncentrácií by mal byť preferovaný transportér alebo oligoarginín. In vivo však účinnosť vychytávania, špecifickosť a toxicita pre rôzne CPP neboli rozsiahle študované. Napriek tomu je zrejmé, že na cielené dodanie je potrebné pridať do sekvencie CPP nejaké ďalšie motívy. Pomerne sľubným aspektom pre dodávanie peptidov/proteínov sprostredkované CPP je to, že transcytóza v endotelových bunkách vyžaduje kaveolin. Niekoľko CPP, ale najmä transportných, využíva kaveolinovú dráhu na vstup buniek, čo možno dáva transportanu prospešný „náskok“ in vivo. Napriek množstvu prekážok a nevyriešených výziev, s ktorými sa dnes ešte stále stretávame, rastúci počet príkladov in vivo dodávania, Tat-HSP70 na záchranu neurónov a Tat-Bcl-x (L) na zlepšenie prežitia neurónových prekurzorových buniek potvrdzujú, že problémy môžu byť prekonať tak či onak.


Prečo používať DDS?

Ľudský organizmus predstavuje mnoho ťažkostí pre bezpečné dodávanie účinných liečiv do cieľovej bunky 14. Systémové podávanie a endovenózne stratégie umožňujú 100% biologickú dostupnosť, čím sa predchádza enterálnej a hepatálnej metabolickej degradácii. Keď sa olovo dostane do krvného obehu, musí prekonať niektoré problémy, vyhnúť sa reakcii imunitného systému (aktivácia komplementu a fagocytóza), ako aj agregácii sérových proteínov a filtrácii obličiek 24 . Akonáhle sa eukaryotická membrána priblíži k cieľovej bunke, bude predstavovať ďalšie prekážky, pretože je nepriepustnou bariérou pre väčšinu xenobiotík 11, 15, 24, 25. Plazmatická membrána umožňuje iba prísun malých zlúčenín, ktoré vyžadujú transportéry pre väčšinu hydrofilných makromolekúl 17.

Potreba DDS pre malé molekuly a terapie na mieru založené na génoch tiež vyplýva z jeho biochemických charakteristík, ako je slabá stabilita, nedostatok bunkovej absorpcie a nedostatočná schopnosť dosiahnuť ciele 18, 19, 26, 27. Toto sú preto nové kľúčové výzvy v medicíne – ako získať účinné terapeutické látky, ktoré pôsobia lokálne s obmedzenými nežiaducimi mimocieľovými účinkami26, bez straty farmaceutickej účinnosti alebo potreby zvyšovania dávok.

Bolo vyvinutých niekoľko DDS 14, 28, 29. Pri predstavovaní takejto technológie by sa malo zvážiť použitie biokompatibilných materiálov pre jednoduché, ale silné montážne procesy. Optimalizácia a doladenie biofyzikálno-chemických parametrov na zvýšenie farmakokinetických a farmakodynamických vlastností DDS sú tiež naliehavými požiadavkami v tejto oblasti 14, 26. Úspešný DDS musí fungovať na rôznych tkanivách, musí mať rýchle uvoľnenie endozómov, musí byť funkčný pri nízkych dávkach, nesmie byť toxický a musí sa dať ľahko podávať v súvislosti s terapeutickými aplikáciami 18.

Bolo vyvinutých niekoľko technológií a niektoré príklady DDS prístupov sú: elektroporácia30, ultrazvukom sprostredkované dodanie plazmidov 31, vírusové dodanie 32, nebulizácia 33, priama chemická modifikácia 34 a spojenie s nevírusovým aplikačným vehikulom, ako sú lipidy 35, lipozómy 36, dendriméry 37 , katiónové polyméry 38, anorganické častice 39, uhlíkové nanorúrky 40, malé molekuly 41, receptorové ligandy 42, v poslednej dobe preplňované proteíny 43, 44 a CPP 18, 45, 46. Tento prehľad sa zameria na jeden konkrétny druh DDS, CPP, hlavne na jeho vlastnosti a aplikáciu na klinické terapie. Obrázok 1 ilustruje stav DDS technológií a nákladov, ktoré už boli dodané do buniek pomocou bunkových endocytových dráh alebo pomocou priamej membránovej translokácie.


Aplikácia stratégií CPP na dodávanie terapeutických molekúl

Počet aplikácií využívajúcich CPP vedome narastá a doteraz sa uskutočnilo viac ako 300 štúdií s použitím kovalentných alebo nekovalentných stratégií založených na CPP od in vitro do in vivo boli hlásené (Dietz a Bähr, 2004 Gros a kol., 2006 Moschos a kol., 2007 Patel a kol., 2007 Foerg a Merkle, 2008). Záujem o CPP je spôsobený predovšetkým ich nízkou cytotoxicitou a skutočnosťou, že pre typ nákladu nie sú žiadne obmedzenia. Aj keď sa CPP používajú na zlepšenie dodávania nákladu, ktorý sa veľmi líši veľkosťou a povahou (malé molekuly, oligonukleotid, plazmidová DNA, peptid, proteín, nanočastice, formulácia na báze lipidov, vírus, kvantové bodky), väčšina aplikácií opisuje doručenie oligopeptid/proteín (Dietz a Bähr, 2004 Gros a kol., 2006 Patel a kol., 2007) a nukleových kyselín alebo analógov (Juliano a kol., 2008) (tabuľka 1).

Stratégie dodávania génov založené na CPP

Zlá priepustnosť plazmatickej membrány eukaryotických buniek pre DNA spolu s nízkou účinnosťou DNA alebo oligonukleotidov na dosiahnutie cieľa v bunkách predstavujú dve hlavné bariéry vývoja týchto terapeutických molekúl. V poslednom desaťročí sa vyvinulo množstvo peptidových nosičov, ktoré kombinujú väzbu DNA, najmä elektrostatickú doménu (polylyzín a polyarginín) a vlastnosti destabilizujúce membránu, aby sa uľahčil prenos génov do kultivovaných buniek a živých zvierat (Niidome a Huang, 2002 Glover a kol., 2005 Morris a kol., 2008). Amfipatické peptidy s fuzogénnymi a endozomolytickými aktivitami závislými od pH, ako je fúzny peptid HA2 podjednotka chrípkového hemaglutinínu alebo syntetických analógov GALA, KALA, JTS1 a peptidov bohatých na histidín preukázateľne zvyšuje účinnosť transfekcie v spojení s poly-L-lyzínom/DNA, kondenzujúcim peptidom/DNA, katiónovými lipidmi, polyetylénimínom alebo polyamidoamínom kaskádové polyméry (na recenziu: Morris a kol., 2008). Jednotlivé peptidové reťazce schopné kondenzovať DNA a podporovať únik endozómov (PPTG1) (Rittner a kol., 2002) alebo zabrániť endozomálnemu vychytávaniu (MPG: Morris a kol., 1999) sa tiež použili na dodanie génov v kultivovaných bunkách. Overených však bolo iba niekoľko CPP in vivo na dodávanie génov a zatiaľ predstavuje sekundárny amfipatický peptid PPTG1 jeden z mála príkladov, ktoré uvádzajú významný in vivo reakcia génovej expresie po intravenóznej injekcii (Rittner a kol., 2002). Tat, Transportan a polyarginín CPP boli spojené s inými metódami dodávania nevírusových génov na báze lipidov, vrátane lipozómov, PEI alebo nanoštruktúr (Branden a kol., 1999 Tung a kol., 2002 Ignatovič a kol., 2003 Rudolf a kol., 2003 Kilk a kol., 2005). Spojenie Tat a okta-arginínu s farmaceutickými nanonosičmi, ktoré sú opísané ako nevírusové aplikačné systémy založené na nových konceptoch balenia „Programované balenie“ Multifunkčné nanozariadenie typu obálky (MEND) (Kogure a kol., 2004 MacKay a kol.(2008), bolo ukázané, že zlepšuje dodávanie génov a ponúka výhodu kombinovania doručovacích, baliacich a zacieľovacích motívov v rámci tej istej častice (Torchilin, 2008 Vivès a kol., 2008 ).

Druhou hlavnou bariérou nevírusových systémov dodávania génov je ich zlá nukleárna translokácia, ktorá je však zásadná pre transfekciu nedeliacich sa buniek a génovú terapiu. Aby sa zlepšilo dodávanie jadrových plazmidov DNA do jadra, rozsiahle sa používajú syntetické peptidy obsahujúce NLS (Cartier a Reszka, 2002 Escriou a kol., 2003). Väčšina týchto štúdií bola vykonaná so sekvenciou odvodenou z veľkého T antigénu SVL NLS (PKKKRKV). Táto sekvencia bola spojená buď s membránami prenikajúcimi alebo katiónovými peptidmi, ale bola tiež priamo spojená s nákladom alebo kombinovaná s inými transfekčnými metódami na uľahčenie dodania do jadra. Okrem toho boli sekvencie NLS spojené s rôznymi hydrofóbnymi CPP, aby sa podporilo jadrové zacielenie, ako aj väzba a zhutnenie DNA. Ukázalo sa, že doména NLS MPG zlepšuje jadrovú translokáciu nukleových kyselín bez toho, aby sa počas mitózy vyžadoval rozpad jadrovej membrány. Technológia MPG bola aplikovaná na dodávanie plazmidovej DNA aj oligonukleotidov s vysokou účinnosťou do veľkého počtu adherentných a suspenzných bunkových línií (Simeoni a kol., 2003 Morris a kol., 2007b).

Stratégie založené na CPP na dodávanie oligonukleotidových analógov

Sterický blok, malý neutrálny oligonukleotid, vrátane PNA a morfodo-oligomérov fosforodiamidát morfododiamidátu (PMO), tvorí silné molekuly buď pre aplikáciu s antisense, alebo pre stratégiu korekcie zostrihu mRNA. Na dodanie nenabitého PNA a PMO bolo úspešne použitých niekoľko CPP in vitro a in vivo prostredníctvom kovalentnej väzby (Gait, 2003 Moulton a Moulton, 2004 Zatsepin a kol., 2005 Juliano a kol., 2008). Pôvodne hlásené spoločnosťou Transportan pre in vivo dodanie antisense PNA zameranej na galanínové receptory a modifikujúce prenos bolesti (Pooga a kol.(1998), použitie CPP na dodávanie oligonukleotidov sterických blokov bolo rozšírené na Tat, penetratín, TP10 (krátka verzia Transportanu) a peptidy bohaté na arginín. Bolo publikovaných niekoľko kovalentných prístupov založených na CPP na dodávanie antisense PNA (Koppelhus a Nielsen, 2003). Bolo však použitých len niekoľko in vivoa donedávna nebol žiadny z nich aktívny v submikromolárnych koncentráciách (Gait, 2003 Abes a kol., 2007). Podrobná štúdia dodávania PNA sprostredkovaného CPP uvádza, že hlavné obmedzenie je spôsobené ich endozomálnou sekvestráciou (Koppelhus a Nielsen, 2003), a nedávno boli nové CPP opísané skupinami Lebleu a Gait vrátane R6-penetratínu a 6-aminohexánovej kyseliny. kyslý oligoarginín [(R-Ahx-R)4], ktoré vykazujú obmedzené endozomálne sekvestrácie a vedú k submikromolárnej antisense alebo zostrihovej korekčnej odpovedi (Abes a kol., 2006 2007). Tieto CPP boli validované in vivo na opravu zostrihu na dvoch terapeutických modeloch: Duchennova svalová dystrofia (Fletcher a kol.(2007) a replikácia koronavírusu u myší (Burrer a kol., 2007). Nekovalentné stratégie sa tiež použili na dodávanie PNA a mimických molekúl DNA (Nan a kol.(2005). Peptid Pep-3, variant Pep-1, bol úspešne aplikovaný na dodanie PNA a analógov zacielených na regulačný proteín cyklínu B1 bunkového cyklu in vitro a in vivo (Morris a kol., 2004b 2007b). Je zaujímavé, že nanočasticová organizácia komplexu Pep-3/PNA umožňuje funkcionalizáciu povrchovej vrstvy častice a PEGylácia nosiča výrazne zlepšuje účinnosť odozvy stabilizáciou komplexov. Táto štúdia ukazuje, že takáto modifikácia zlepšuje Pep-3 pre systémové podávanie myšiam, čím umožňuje významné zníženie dávky potrebnej na vyvolanie špecifickej a silnej biologickej odpovede, ktorá následne obmedzuje nešpecifické cytotoxické účinky opísané pri liečbe vysokými koncentráciami CPP-PNA konjugátových alebo nekovalentných komplexov (Morris a kol., 2007b).

Dodávanie oligonukleotidov a siRNA

Návnadové oligonukleotidy a krátke interferujúce RNA (siRNA) predstavujú výkonné biomedicínske nástroje na kontrolu aktivácie proteínov a/alebo génovej expresie po transkripcii. (Elbashir a kol., 2001 Hannon, 2002). Avšak hlavným obmedzením aplikácií siRNA, ako väčšina stratégií založených na antisense alebo na báze nukleových kyselín, zostáva ich slabý príjem bunkami spojený so slabou permeabilitou bunkovej membrány pre nukleové kyseliny. Bolo navrhnutých niekoľko vírusových a nevírusových stratégií na zlepšenie dodávania buď siRNA-exprimujúcich vektorov alebo syntetických siRNA v kultivovaných bunkách a in vivo (De Fougerolles a kol., 2007 Juliano a kol., 2008). Na zlepšenie dodávania oligonukleotidov boli vyvinuté stratégie založené na CPP in vitro a in vivo. Dodávka nabitého oligonukleotidu a siRNA je náročnejšia, pretože viac aniónové náboje nukleovej kyseliny interagujú so skupinou CPP a inhibujú absorpciu stérickou prekážkou. Dodanie nabitého oligonukleotidu sa dosiahlo použitím buď nekovalentných alebo PNA-hybridizačných stratégií na báze peptidov. V druhom prípade sú CPP kovalentne spojené s PNA, ktorá je schopná hybridizovať s dvojvláknovým návnadovým oligonukleotidom obsahujúcim na jednom vlákne ohraničujúcu sekvenciu komplementárnu k PNA. Stratégie boli aplikované s Transportanom a TP10 CPP na dodanie návnadového oligonukleotidu interagujúceho s NFkB alebo Myc (Fisher a kol., 2004 El-Andaloussi a kol.(2005). Doručovací systém založený na MPG peptide bol úspešne aplikovaný na dodávanie rôznych typov nukleových kyselín, vrátane fosfodiester-oligonukleotidu zacieleného na proteínovú fosfatázu cdc25C (Morris a kol.(1999), fosforotioát-oligonukleotidy zacielené na promótor MDR-1 v ľudských leukemických bunkách CEM (Marthinet a kol.(2000) a antagonisty templátu tio-fosforamidát telomerázy v rakovinových bunkách (Asai a kol., 2003 Gryaznov a kol., 2003). Na dodávanie siRNA do kultivovaných buniek sa použilo niekoľko stratégií založených na CPP. siRNA je kovalentne spojená s Transportanom (Muratovska a Eccles, 2004) a penetratínom (Davidson a kol., 2004) boli spojené s umlčaním. Napriek tomu sa zdá, že nekovalentné stratégie sú vhodnejšie na dodávanie siRNA a poskytujú významnú súvisiacu biologickú odpoveď (Simeoni a kol., 2003 Kim a kol., 2006 Veldhoen a kol., 2006 Crombez a kol., 2007 Kumar a kol., 2007 Lundberg a kol., 2007 Meade and Dowdy, 2007). Uvádza sa, že MPG peptid zlepšuje dodávanie siRNA do veľkého panelu bunkových línií vrátane adherentných bunkových línií, buniek v suspenzii, rakoviny a náročných primárnych bunkových línií (Simeoni a kol., 2003 Morris a kol., 2004a Nguyen a kol., 2006). Bola podaná žiadosť o MPG in vivo dodanie siRNA zacielenej na OCT-4 do myších blastocytov (Zeineddine a kol.(2006) a siRNA zacielenej na esenciálny proteín bunkového cyklu, bolo ukázané, že intravenózna injekcia častíc siRNA MPG/cyklín B1 intravenózne cyklínu B1 účinne blokuje rast nádoru (Crombez a kol., 2007). Ukázalo sa tiež, že variant MPG (MPG-alfa) obsahujúci päť mutácií v hydrofóbnej doméne, aby sa podporila špirálovitá konformácia peptidu, zlepšuje dodávanie siRNA (Veldhoen a kol., 2006). Takéto modifikácie MPG však zvyšujú toxicitu a uprednostňujú príjem endozomálnych buniek (Deshayes a kol., 2004c Veldhoen a kol., 2006). Tento nekovalentný prístup bol rozšírený o ďalšie CPP vrátane polyarginínu (Kim a kol., 2006 Kumar a kol., 2007), penetratin- (Lundberg a kol.(2007) a Tat- (Meade a Dowdy, 2007) odvodené peptidy. Uvádza sa, že Tat peptid spojený s motívom viažucim RNA blokuje in vivo epidermálny rastový faktor (EGF), cholesterol-Arg9 zvyšuje dodanie siRNA in vivo proti vaskulárnym endotelovým rastovým faktorom (Kim a kol.(2006) a nedávno sa ukázalo, že malý peptid odvodený z glykoproteínu vírusu besnoty spojený s polyarginínom R9 dodáva siRNA v CNS (Kumar a kol., 2007 ).


Úvod

Za posledných 5 rokov došlo k dramatickému vzniku nových potenciálnych terapeutických molekúl, predovšetkým v dôsledku vývoja proteomiky a genomiky. Tieto molekuly však stále zostávajú obmedzené svojou slabou schopnosťou vstupovať do buniek. Aby boli lepšie použiteľné pre terapiu in vivo„Rastúci záujem sa prejavuje vo vývoji spôsobov nevírusového dodávania (Niidome a Huang, 2002 Torchilin, 2005). Na tento účel sa CPP (peptidy prenikajúce bunkami) úspešne použili na zlepšenie dodávania biologicky aktívnych makromolekúl vrátane nukleových kyselín, peptidov a bielkovín v bunkovej kultúre a in vivo (Järver a Langel, 2004 Gupta a kol., 2005). Boli vyvinuté dve hlavné stratégie. Prvá je založená na prirodzených alebo chimérických PTD (proteínových transdukčných doménach) kovalentne spojených s nákladom, z ktorých najreprezentatívnejšie sú peptid odvodený z HIV-1 proteínu Tat (Fawell et al., 1994 Vivés et al., 1997 Frankel a Pabo, 1998 Schwarze a kol., 1999), polyarginín (Wender a kol., 2000 Futaki a kol., 2001), tretia špirála pAnt (antennapedia homeodoménový proteín) (Derossi a kol., 1994) a transportan (Poo al., 1998). Druhý je založený na primárnych amfifatických peptidoch, ako je MPG alebo Pep-1, ktoré tvoria stabilné nekovalentné komplexy s nákladmi (Morris et al., 1997, 2001 Simeoni et al., 2003 Gros et al., 2006). Ukázalo sa, že bunkový mechanizmus absorpcie PTD je v podstate spojený s endozomálnymi cestami (Richard a kol., 2003, 2005 Nakase a kol., 2004 Wadia a kol., 2004). Boli však uvedené jasné dôkazy o odlišných cestách bunkového vychytávania, z ktorých niektoré sú nezávislé od endozomálnej dráhy a zahŕňajú transmembránové potenciály (Dom et al., 2003 Terrone et al., 2003 Thoren et al., 2003 Rothbard et al. , 2004 Deshayes a kol., 2005 Pujals a kol., 2006).

K prvému kontaktu CPP s bunkami dochádza prostredníctvom zložiek extracelulárnej matrice, proteoglykánov, ktoré potom spúšťajú absorpciu bunkami. Proteoglykány sú heterogénne proteíny, ktoré nesú jeden alebo viacero GAG (glykozaminoglykánových) bočných reťazcov a ktoré sa líšia veľkosťou a tvarom (Kjellen a Lindahl, 1991 Esko a Selleck, 2002). Proteoglykány majú tendenciu vytvárať elektrostatické interakcie s molekulami, ktoré sú primárne sprostredkované nábojom a závisia od počtu nábojov (Ruoslahti, 1998). Preto predstavujú „kotvu“ membrány prostredníctvom svojich reťazcov GAG pre veľké množstvo ligandov (Sawitsky et al., 1996 Esclatine et al., 2001 Juliano, 2002 Couchman, 2003). Uvádza sa, že proteoglykány sú zapojené do rôznych dráh riadiacich pohyblivosť, tvar alebo bunkovú proliferáciu buniek, ktoré sú priamo spojené s dynamikou siete cytoskeletov a aktínov (Ruoslahti, 1988 Sawitsky a kol., 1996 Esclatine a kol., 2001 Juliano, 2002 Couchman, 2003 Beauvais a Rapraeger, 2004 Iozzo, 2005). HSPG (heparán sulfátové proteoglykány), syndekán a glykán interagujú s aktínovou sieťou prostredníctvom ich cytoplazmatického chvostového aktín viažuceho proteínu a obe sa podieľajú na regulácii membránových „receptorov“ a bunkovej absorpcii makromolekúl (Couchman, 2003 Yoneda a Couchman, 2003 Beauvais a Rapraeger, 2004). GAG a HSPG hrajú ústrednú úlohu v translokačnom mechanizme polykatiónových nosičov, lipozómov (Mislick a Baldeschwieler, 1996 Kopatz a kol., 2004) a PTD (Belting, 2003). Bolo navrhnuté, že GAG ​​predstavuje receptor na povrchu bunky pre molekuly nosiča extracelulárnych peptidov, ktoré sú alebo nie sú spojené s nákladom (Rusnati a kol., 1999, 2001 Belting, 2003). Počiatočný krok pre niekoľko CPP, vrátane peptidov Tat a pAnt bohatých na arginín, je spojený so silnými elektrostatickými interakciami s negatívne nabitými GAG, ktoré spúšťajú ich internalizáciu rôznymi cestami endocytózy v závislosti od prítomnosti a povahy nákladu a schopnosti CPP interagovať s lipidmi (Suzuki et al., 2002 Console et al., 2003 Nakase et al., 2004 Wadia et al., 2004 Richard et al., 2005).

Nosiče MPG sú amfipatické peptidy nesúce hydrofóbnu doménu odvodenú z fúznej domény HIV-1 gp41 (glykoproteín 41) a NLS (sekvenciu jadrovej lokalizácie) s 5 pozitívnymi nábojmi. MPG sú schopné vytvárať stabilné komplexy s nukleovými kyselinami a zlepšovať ich absorpciu v bunkách, a teda aj s nimi spojenú biologickú odpoveď. Vo veľkej miere sa používajú na zlepšenie dodania antisense oligonukleotidov (Morris et al., 1997), plazmidovej DNA (Morris et al., 1999a), siRNA (malé interferujúce RNA) (Simeoni et al., 2003 Morris et al., 2004 Langlois et al., 2005) a peptidy (Morris et al., 1999b). Boli vyvinuté dva MPG peptidy nazývané MPG-a a MPG-p, ktoré sa líšia svojou sekundárnou štruktúrou, pokiaľ sú v lipidovej membráne (Deshayes a kol., 2004a, 2004b). Uvádza sa, že mechanizmus vychytávania biologicky aktívnych komplexov MPG-náklad je nezávislý od endozomálnej dráhy a súvisí so schopnosťou MPG interagovať s lipidmi a indukovať lokálnu destabilizáciu membrány (Deshayes et al., 2004a, 2004b). Napriek tomu sú parametre spojené s iniciáciou mechanizmu bunkového vychytávania týchto CPP stále nedostatočne pochopené. V tejto práci sme skúmali prvý krok mechanizmu bunkovej absorpcie MPG-β aj MPG-α. Preukázali sme, že komplexy MPG aj MPG-náklad interagujú s negatívne nabitým GAG extracelulárnej matrice. Väzba MPG na GAG spúšťa špecifickú aktiváciu Rac1 GTPázy, ktorá je spojená s prestavbou aktínovej siete, čím predstavuje „nástup“ bunkového vychytávania a podporuje vstup komplexov MPG alebo MPG - DNA do bunky a napr. väčšina CPP, zvýšenou tekutosťou membrány. Naše výsledky naznačujú, že aj keď bunkový vstup CPP môže prebiehať rôznymi cestami, existuje niekoľko bežných počiatočných krokov, ktoré zahŕňajú platformu GAG a aktiváciu GTPázy.


Peptidy a peptidomimetiká ako regulátory interakcií proteín -proteín

Interakcie proteín -proteín sú nevyhnutné pre takmer všetky bunkové procesy.

Peptidy sú ideálnymi kandidátmi na zacielenie interakcií proteín -proteín (PPI).

Analyzujeme skríningové a racionálne návrhové metódy na identifikáciu peptidov na inhibíciu PPI.

Rastúca popularita peptidov ako terapeutík môže priniesť novú éru objavovania liekov.

Interakcie proteín -proteín sú nevyhnutné pre takmer všetky intracelulárne a extracelulárne biologické procesy. Regulácia interakcií proteín -proteín je jednou zo stratégií na reguláciu bunkového osudu vysoko selektívnym spôsobom. Konkrétne sú peptidy ideálnymi kandidátmi na inhibíciu interakcií proteín-proteín, pretože môžu napodobňovať povrch proteínu, aby účinne súťažili o väzbu. Peptidy sú navyše synteticky dostupné a môžu byť stabilizované chemickými modifikáciami. In this review, we survey screening and rational design methods for identifying peptides to inhibit protein–protein interactions, as well as methods for stabilizing peptides to effectively mimic protein surfaces. In addition, we discuss recent applications of peptides to regulate protein–protein interactions for both basic research and therapeutic purposes.


1 Cell-penetrating peptides: what are they?

The identification of proteins that can enter cells was first reported in the late eighties, contradicting the acknowledged understanding that the plasma membrane is impermeable to hydrophilic molecules. Thus, it has been demonstrated that the Trans-Activator of Transcription (Tat) protein of the Human Immunodeficiency Virus was able to efficiently enter tissue-cultured cells and promote the viral gene expression [1, 2] . Moreover, Antennapedia homeodomain, a transcription factor of Drosophilia melanogaster, was also shown to enter nerve cells and regulate neural morphogenesis [3] . The interesting spontaneous entry of both proteins led to extensive structure/function studies to find the shortest amino acid sequence necessary for the uptake. This resulted in the identification of the first CPPs: Tat peptide, corresponding to the basic domain of HIV-1 Tat protein [4, 5] and penetratin, corresponding to the third helix of the Antennapedia homeodomain [6] . Ever since, various peptides showing the same penetrating capacities have been discovered or rationally designed.

1.1 Definition and classification of CPPs

The field of CPPs evolved rapidly, ever since the first sequences were described. This makes it hard to have a general definition covering the characteristics of the different CPPs discovered. So far, one can say that CPPs are short peptides (generally not exceeding 30 residues) that have the capacity to ubiquitously cross cellular membranes with very limited toxicity, via energy-dependent and/or independent mechanisms, without the necessity of a chiral recognition by specific receptors. Most common CPPs are positively charged peptides, though the presence of few anionic or hydrophobic CPPs was also demonstrated. A primary or secondary amphipathic character is also implicated but not strictly required for the internalization.

According to their origin, we can distinguish three main classes of CPPs: peptides derived from proteins, chimeric peptides that are formed by the fusion of two natural sequences, and synthetic CPPs which are rationally designed sequences usually based on structure–activity studies (Table 1). Other attempts to classify CPPs, in spite of their diversity, were based on the physico-chemical characteristics of the sequences (e.g., their amphipathicity [7] , or their hydrophobicity [8] ). A recent review summarizes the different classifications and the physico-chemical properties of the so-far described CPPs [9] .

Peptid Pôvod Sequence Referencie
Protein-derived
Penetratin Antennapedia (43–58) RQIKIWFQNRRMKWKK [6]
Tat peptide Tat(48–60) GRKKRRQRRRPPQ [5]
pVEC Cadherin(615–632) LLIILRRRIRKQAHAHSK [10]
Chimeric
Transportan Galanine/Mastoparan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL [11]
MPG HIV-gp41/SV40 T-antigen GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV [12]
Pep-1 HIV-reverse transcriptase/SV40 T-antigen KETWWETWWTEWSQPKKKRKV [13]
Syntetický
Polyarginines Based on Tat peptide (R) n 6 < n < 12 [14, 15]
MAP de novo KLALKLALKALKAALKLA [16]
R.6W3 Based on penetratin RRWWRRWRR [17]

1.2 Applications

CPPs can transport inside living cells a variety of covalently or non-covalently linked cargoes, as has been reviewed for nanoparticles [18] , peptides [18, 19] , proteins [20, 21] , antisense oligonucleotides [20, 22] , small interfering RNA [23] , double stranded DNA [18] and liposomes [18] .

The transport of the smallest cargo to large 120 kDa proteins had been successfully carried out both in vitro and in vivo. For instance, activable CPPs (ACPPs) were recently employed in vivo to target cancer cells over-expressing metalloproteinase-2 [24] , while treatment of various inflammatory diseases by inhibition of NF-κB was also effective in vivo by coupling the inhibitors to different CPPs [25] . Tumor-targeting was also achieved in vivo for the (D)R.8–doxorubicin conjugate [26] . It is difficult to keep track of the various applications because the field is emerging rapidly. Recently, a novel class of intrinsically bioactive CPPs, baptized bioportide, made an appearance with the description of a CPP sequence derived from cytochrome c that mimicked the apoptotic role of the entire protein once it entered inside cells [27, 28] . Another in vitro study on mouse neuronal hypothalamic cells revealed that the N-terminal sequence derived from the prion protein could penetrate cells and disabled the formation of prions [29] .


Metódy

Cell Culture

All cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and passaged using standard techniques. The HeLa cell line was maintained and tested in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) high glucose, 10% fetal calf serum (FCS), and 1% antibiotic𠄺ntimycotic (ABAM) solution. The MDA-MB-231 cell line culture medium was Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium 1640 (Gibco) supplemented with 9.5% FCS, 0.25 IU mL 𠄱 human insulin (Actrapid Penfill), and 20 mM HEPES (Gibco). The MCF-10A culture medium consisted of DMEM/F12 (Gibco) supplemented with 5% horse serum, human insulin (10 μg mL 𠄱 ), hydrocortisone (0.5 μg mL 𠄱 ), EGF (20 ng mL 𠄱 ), and cholera toxin (100 ng mL 𠄱 ).

Peptide Synthesis

All peptides were prepared, either commercially (Purar Chemicals, Australia) or in-house, by solid-phase peptide synthesis using Fmoc chemistry and Rink amide resin (except for FITC-labeled peptides, which utilized Fmoc-Val-Wang resin) and cleavage from the resin using standard procedures. The solution concentration of the peptides was determined spectrophotometrically at 280 nm using extinction coefficients determined from the amino acid content, 36 except for FITC-labeled peptides that were quantitated on the basis of the absorbance of fluorescein at 498 nm. 37

Biotinylated Penetratin Biotin-P16 (biotin-ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK, where ahx = 1,6-aminohexanoic acid) was prepared with biotin linked N-terminally via the ahx group that served as a spacer. The peptide was purified to homogeneity using reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), and its identity was confirmed using mass spectrometry (calcd m/z (C.120H194N.38O22S2) 5+ : 517.7 found (C120H194N.38O22S2) 5+ : 518.1).

Biotinylated N-terminal seven residues of Penetratin Biotin-P7 (biotin-βG-RRMKWKK, where βG = β-glycine) was prepared with biotin linked N-terminally via the β-glycine residue that served as a spacer. The peptide was purified to homogeneity using RP-HPLC, and its identity was confirmed using mass spectrometry (calcd m/z (C.59H101N.21O10S2) 4+ : 332.9 found (C59H101N.21O10S2) 4+ : 333.0).

The control peptides Penetratin P16 (RQIKIWFQNRRMKWKK) and G7-18NATE (cyclo-CH2CO-WFEGYDNTFPC) were prepared as reported previously. 35,38

Cargo-containing peptides G7-18NATE-P16 (cyclo-(CH2CO-WFEGYDNTFPC-RQIKIWFQNRRMKWKK)) and G7-18NATE-P7 (cyclo-(CH2CO-WFEGYDNTFPC-RRMKWKK)) were synthesized as a continuous peptide chain and then cyclized via the formation of thioether between the N-terminus and the cysteine side chain post cleavage, as described for G7-18NATE. 38 The peptides were purified to homogeneity using RP-HPLC, and their identities were confirmed using mass spectrometry G7-18NATE-P16 (calcd m/z (C.171H246N.48O38S2) 6+ : 608.3 found (C171H246N.48O38S2) 6+ : 608.6) and G7-18NATE-P7 (calcd m/z (C.113H159N.31O26S2) 5+ : 487.03 found (C113H159N.31O26S2) 5+ : 487.25).

FITC-labeled peptides FITC-P16-NLS (FITC-ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK-PKKKRKV), FITC-P7-NLS (FITC-ahx-RRMKWKK-PKKKRKV), and FITC-NLS (FITC-ahx-PKKKRKV) were prepared with FITC linked N-terminally via the ahx group (1,6-aminohexanoic acid), which served as a spacer. The peptides were purified to homogeneity using RP-HPLC, and their identities were confirmed using mass spectrometry FITC-P16-NLS (calcd m/z (C.171H266N.50O33S2) 6+ : 603.0 found (C171H266N.50O33S2) 6+ : 603.46), FITC-P7-NLS (calcd m/z (C.113H179N.33O21S2) 4+ : 600.59 found (C113H179N.33O21S2) 4+ : 601.03), and FITC-NLS (calcd m/z (C.67H100N.16O14S) 3+ : 462.58 found (C67H100N.16O14S) 3+ : 462.72).

Peptide Internalization Assay

HeLa cells were seeded in 96-well plates (30� cells per well) in a culture medium. After 24 h, the media was replaced with a media containing the peptide of interest (at 1 μM) and incubated for 15 min. The cells were washed three times in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.5% Tween20/PBS. The endogenous alkaline phosphatase activity was neutralized by incubating the plates at 65 ଌ for 60 min. The cells were blocked using 3% bovine serum albumin (BSA)/PBS and treated with streptavidin APase (1 μg mL 𠄱 in 0.1% BSA/PBS) for 30 min at room temperature. Following three times washing with PBS, 50 μL of 100 mg.mL 𠄱 p-nitrophenol phosphate was introduced and incubated for 30 min at room temperature. The enzyme reaction was quenched using 2 M NaOH. The absorbance was measured at 405 nm using FLUOstar Omega. The samples were measured in triplicates, and the background absorbance was determined using untreated cells and subtracted from the test conditions. The statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 (GraphPad Software, CA).

Wound-Closure Migration Assay

The MDA-MB-231 or MCF-10A cells were seeded until confluent in 24-well plates, wounded with a sterile pipette tip to create a cell-free gap and cell debris cleared away with fresh media. Lyophilized peptides were resuspended in sterile MQ, diluted to the appropriate concentration in fresh media, and added to the appropriate wells, with each treatment duplicated. The media also contained 1 ng mL 𠄱 EGF to stimulate migration. The Leica AF6000 LX live-cell-imaging system was used to capture images in real time (at 37 ଌ, 5% CO2), with images collected every 30 min from a minimum of five positions per well. The remaining gap area was measured using ImageJ (Fiji) at 0 and 12 h and averaged from all measured positions across the duplicates. At least three independent experiments were performed. To allow for a direct comparison, the results are displayed as the relative percentage of gap closure compared with the untreated control cells normalized to 100%.

Cellular Uptake Assay

MDA-MB-231 cells were seeded (50�) in 24-well plates and grown until 60�% confluent. The media was replaced with the peptide-treated media (at 20 μM) and incubated for 20 min at 37 ଌ. The cells were washed gently three times with the growth media and incubated with Hoechst-treated media (1 μM) for 5 min at 37 ଌ before being transferred to the Leica AF6000 LX live-cell-imaging system. Here, the cells were maintained at 37 ଌ and 5% CO2, and images were taken within 15 min using a 20× objective lens.

Expression and Purification of the Grb7-SH2 Domain

Grb7-SH2 (415� residues) was incorporated into the pGex2T plasmid and expressed and purified, as described previously. 39

Thermal Shift Assays

The lyophilized peptides of interest were resuspended in 50 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, and 5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) and tested at a final concentration of 50 μM. Grb7-SH2, dialyzed in the same buffer (excluding DMSO), was tested at 40 μM. Using Rotor-Gene 3000 (Corbett Life Science), the temperature was increased in 0.5 ଌ increments from 50 to 70 ଌ with a holding time of 60 s. The wavelength of excitation/emission was measured at 530/555 nm. Each condition was measured in duplicate or triplicate with values averaged. Peptide-only and buffer-only control samples were measured and subtracted from the averaged test measurements. At least three independent experiments were conducted. The statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 (GraphPad Software, CA).


Pozri si video: část 3: Instalace webu - Jak postavit web na WordPressu (Február 2023).