Informácie

Môžem peletovať DNA späť z rozpusteného stavu?

Môžem peletovať DNA späť z rozpusteného stavu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mám rozpustený plazmidový pelet vo vode. Môžem to znova peletovať odstredením pri 13 000 otáčkach za minútu? Ak nie, prečo?


Nie, nemôžete rozpustiť DNA rozpustenú v ultracentrifugácii.

Áno„Peletu môžete získať ďalším ošetrením, podobne ako ste to urobili na prvom mieste; len namiesto toho, aby vašim vstupom boli homogenizované bunky alebo tkanivá alebo extrakty alebo čokoľvek, čo ste použili na získanie svojej DNA, teraz by to bol len váš vodný roztok DNA.

Môžete napríklad vykonať extrakciu TRIzol na oddelenie DNA do vodnej fázy a potom ju roztočiť cez minipreparačné kolóny, aby sa purifikovaná DNA eluovala vo vode. Tento postup by ste mohli zopakovať a po poslednom kroku zrážania alkoholom (etanolom alebo izopropanolom) by ste mali svoju peletu ešte raz.

Kľúčovou myšlienkou pri peletovaní DNA (alebo akejkoľvek nukleovej kyseliny) je urobiť ju nerozpustnou; to sa dosiahne použitím alkoholov a solí. Ak je rozpustný, nukleové kyseliny nemôžu „vyjsť z roztoku“ a vytvoriť pelety.


Čo je to zrážanie DNA? (s obrázkami)

Precipitácia deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) je kľúčovým krokom pri izolácii a čistení genetického materiálu vo vede. Vo všeobecnosti vzorka biologického tkaniva obsahuje DNA alebo RNA spolu so zvyškom tela organizmu. Na testovanie DNA musí vedec oddeliť DNA od všetkých ostatných látok. Precipitácia DNA sa špecificky týka kroku, ktorý zahŕňa oddelenie rozpustenej DNA od kvapaliny, v ktorej je rozpustená. Bežné metódy zrážania DNA zahŕňajú pridanie etanolu, ispropanolu alebo glykogénu do kvapaliny, vďaka čomu DNA stuhne do hrudiek a spadne do dno kvapalnej vzorky.

Počiatočné kroky na čistenie DNA zo vzorky môžu byť také jednoduché, ako rozdrvenie listov v miske na rozbitie časti štruktúry. Potom sa rmut môže rozložiť pomocou chemikálií alebo enzýmov, ktoré ponechajú DNA neporušenú. Genetici bežne používajú odstredivku na rozdelenie rôznych zložiek vzorky. Toto je stroj, ktorý roztočí vzorku tak, aby najťažšia časť klesla ku dnu a najľahšia hore.

Odstránením rôznych nežiaducich zložiek bežne genetikovi zostane číra tekutina, ktorá obsahuje genetický materiál. Potom musí odstrániť DNA rozpustenú v tejto kvapaline a zlikvidovať kvapalinu a ostatné látky v kvapaline. Zrážanie DNA je spôsob, akým sa to dosahuje. Vedec najčastejšie potrebuje pridať chemikáliu do kvapaliny na zrážanie DNA.

Etanol alebo izopropanol, ktoré sú obidvomi formami alkoholu a patria do skupiny rozpúšťadiel chemikálií, sú najbežnejšími chemickými látkami používanými na zrážanie DNA. Glykogén je ďalšou látkou, ktorá môže zrážať DNA, ale okrem zrážania nízkych koncentrácií genetického materiálu sa používa menej často. Keď sa tieto chemikálie zmiešajú s rozpustenou DNA, ich chémia im umožní zmeniť spôsob, akým DNA zapadá do svojho prostredia. Zatiaľ čo predtým sa DNA ľahko zmiešala s kvapalinou, po chemickom pridaní sa prestane viazať s kvapalinou a namiesto toho sa vytvorí tuhá látka.

Táto pevná látka je zvyčajne belavá a zhlukuje sa. Pretože časť tuhej látky je stále v malých časticiach, vedec však obvykle umiestni vzorku do odstredivky, aby všetky pevné látky roztočil do pelety na dne skúmavky. Toto je purifikovaná forma DNA pôvodne prítomná vo vzorke, ktorá je užitočná na testovanie. Tekutina, v ktorej je peleta suspendovaná, sa spravidla odstráni zo skúmavky a peleta sa môže tiež vysušiť, aby sa chemikálie odparili, aby bola peleta čo najčistejšia.


DNA: základné informácie

Čo znamená DNA?

DNA znamená deoxyribonukleovú kyselinu.

DNA je dlhá molekula v tvare dvojitej špirály - dvoch špirál, ktoré sa navzájom krútia. Tieto špirály sú chrbticou DNA a sú zložené z cukrov a fosfátov. Špirály sú spojené chemikáliami známymi ako základne, ktoré sa medzi špirálami tiahnu ako priečky rebríka. DNA má štyri typy báz: adenín (A), tymín (T), guanín (G) a cytozín (C). A a T sa vždy spájajú, rovnako ako G a C.

Čo robí DNA?

Naše gény sú tvorené DNA a DNA obsahuje náš jedinečný genetický kód.
Rovnako ako kniha receptov alebo pokyny pre lego, DNA obsahuje pokyny na výrobu všetkých našich bielkovín, ktoré v našom tele vykonávajú všetky práce.

Spoločné gény

Nevyzeráš ako mucha ani červ. Ale verte tomu alebo nie, zdieľate gény s oboma a so všetkými ostatnými živými tvormi. Vedci skúmajú gény v baktériách, zebrach a ďalších živých veciach, aby sa dozvedeli viac o ľuďoch.

Koľko DNA zdieľate s týmito živými bytosťami?


Prečo používame prostriedok na umývanie riadu?

Prostriedok na umývanie riadu roztrhne bunky jahôd a uvoľní DNA.

Prečo používame soľ?

Zabezpečuje, že proteíny v bunke sú oddelené od DNA.

Čo robí alkohol?

Keď sú molekuly nerozpustné (nemožno ich rozpustiť), zhlukujú sa a stávajú sa viditeľnými. DNA nie je rozpustná v alkohole, preto spôsobuje, že sa vlákna DNA zhlukujú a sú viditeľné voľným okom.


Referencie

Amann, R.I., Ludwig, W. & Schleifer, K.-H. Fylogenetická identifikácia a in situ detekcia jednotlivých mikrobiálnych buniek bez kultivácie. Microbiol. Rev. 59, 143–169 (1995).

Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. & amp Murrell, J. Stabilné izotopové sondovanie ako nástroj v mikrobiálnej ekológii. Príroda 403, 646–649 (2000).

Dumont, M.G. & amp Murrell, J. C. Stabilné izotopové sondovanie-mikrobiálna identita spájajúca funkciu. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499–504 (2005).

Neufeld, J.D., Dumont, M.G., Vohra, J. & amp Murrell, J.C. Metodologické úvahy o použití stabilného izotopového sondovania v mikrobiálnej ekológii. Microb. Ecol. (doi: 10.1007/s00248-006-9125-x).

Evershed, R. P. a kol. 13 C-označenie lipidov na skúmanie mikrobiálnych spoločenstiev v životnom prostredí. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 72–82 (2006).

Friedrich, M. W. Sonda stabilných izotopov DNA: pohľady na funkciu nekultivovaných mikroorganizmov z izotopicky značených metagenomov. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 59–66 (2006).

Madsen, E.L. Použitie stabilných techník sondovania izotopov v bioreaktore a terénnych štúdiách o bioremediácii. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 92–97 (2006).

Prosser, J.I., Rangel-Castro, J.I. & Killham, K. Štúdium interakcií medzi rastlinami a mikróbmi pomocou technológií stabilných izotopov. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 98–102 (2006).

Wagner, M., Nielsen, P.H., Loy, A., Nielsen, J.L. & Daims, H. Spojenie štruktúry mikrobiálnej komunity s funkciou: fluorescencia in situ hybridizácia-mikroautorádiografia a izotopové polia. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 83–91 (2006).

Whiteley, A.S., Manefield, M. & amp Lueders, T. Odblokovanie „mikrobiálnej čiernej skrinky“ pomocou technológií stabilného izotopového sondovania na báze RNA. Curr. Opin. Biotechnol. 17, 67–71 (2006).

Whitely, A.S., Thomson, B., Leuders, T. & amp Manefield, M. RNA stabilné izotopové sondovanie. Nat. Protokoly (v tlači). DOI: 10.1038/nprot.2007.115.

Dumont, M.G., Radajewski, S.M., Miguez, C.B., McDonald, I.R. a Murrell, J.C. Identifikácia kompletného operónu metánmonooxygenázy z pôdy kombináciou stabilného izotopového sondovania a metagenomickej analýzy. Environ. Microbiol. 8, 1240–1250 (2006).

Manefield, M., Whiteley, AS, Griffiths, R.I. & Bailey, M.J. RNA stabilné izotopové sondovanie, nový spôsob prepojenia funkcie mikrobiálnej komunity s fylogenézou. Appl. Okolie. Microbiol. 68, 5367–5373 (2002).

Lueders, T., Manefield, M. & Friedrich, M. W. Zvýšená citlivosť sondovania stabilných izotopov na báze DNA a rRNA frakcionáciou a kvantitatívnou analýzou izopyknických centrifugačných gradientov. Environ. Microbiol. 6, 73–78 (2004).

Cadisch, G. a kol. Technické úvahy o použití 15 N-DNA stabilných izotopových sond na funkčnú mikrobiálnu aktivitu v pôdach. Rapid Commun. hmotnostné spektrum. 19, 1424–1428 (2005).

Cupples, A.M., Shaffer, E.A., Chee-Sanford, J.C. & Sims, G.K. Pohyby hustoty DNA počas sondovania stabilného izotopu 15 N-DNA. Microbiol. Res. (doi: 10.1016/j.micres.2006.01.016).

Sambrook, J. & amp. Maniatis, T. Molekulárne klonovanie: laboratórna príručka (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Rickwood, D. (ed.) Centrifugácia: praktický prístup (IRL, Oxford, 1983).


  • Bunky, ktoré sa majú študovať, sa musia zbierať.
  • Rozbitím bunkových membrán sa odhalí DNA spolu s cytoplazmou vo vnútri (lýza buniek).
    • Lipidy z bunkovej membrány a jadra sa rozložia detergentmi a povrchovo aktívnymi látkami.
    • Rozloženie bielkovín pridaním proteázy (voliteľné).
    • Rozloženie RNA pridaním RNázy (voliteľné).
      zvyčajne ľadovo chladným etanolom alebo izopropanolom. Keďže DNA je v týchto alkoholoch nerozpustná, bude sa agregovať, čím vznikne a peleta pri odstreďovaní. Zrážanie DNA je zlepšené zvýšením iónovej sily, zvyčajne pridaním octanu sodného. v ktorom fenoldenaturujú proteíny vo vzorke. Po centrifugácii vzorky denaturované proteíny zostanú v organickej fáze, zatiaľ čo vodná fáza obsahujúca nukleovú kyselinu sa zmieša s chloroformom, aby sa z roztoku odstránili fenolové zvyšky. ktorý sa spolieha na skutočnosť, že nukleové kyseliny sa môžu viazať (adsorpcia) na pevnú fázu (oxid kremičitý alebo iný) v závislosti od pH a koncentrácie soli pufra.
  • Bunkové a histónové proteíny naviazané na DNA možno odstrániť buď pridaním proteázy alebo vyzrážaním proteínov octanom sodným alebo amónnym, alebo ich extrahovaním zmesou fenol-chloroform pred vyzrážaním DNA.

    Po izolácii sa DNA rozpustí v mierne zásaditom pufri, zvyčajne v pufri TE, alebo v ultračistej vode.

    Medzi najbežnejšie metódy extrakcie DNA patrí organická extrakcia, extrakcia Chelex a extrakcia v pevnej fáze. [3] Tieto metódy konzistentne poskytujú izolovanú DNA, líšia sa však kvalitou aj množstvom získanej DNA. Pri výbere metódy extrakcie DNA je potrebné zvážiť niekoľko faktorov vrátane nákladov, času, bezpečnosti a rizika kontaminácie.

    Organická extrakcia zahŕňa pridanie a inkubáciu vo viacerých rôznych chemických roztokoch [3] vrátane kroku lýzy, extrakcie fenol -chloroformom, zrážania etanolom a premývania. V laboratóriách sa často používa organická extrakcia, pretože je lacná a poskytuje veľké množstvo čistej DNA. Aj keď je to jednoduché, zahŕňa to mnoho krokov a trvá to dlhšie ako iné metódy. Zahŕňa to aj nepriaznivé používanie toxických chemikálií fenol a chloroform a zvyšuje sa riziko kontaminácie v dôsledku prenosu DNA medzi viacero skúmaviek. [4] Pred desiatkami rokov bolo efektívne vyvinutých niekoľko protokolov založených na organickej extrakcii DNA, [5] hoci v posledných rokoch boli vyvinuté a publikované aj vylepšené a praktickejšie verzie týchto protokolov. [6]

    Extrakčná metóda Chelex zahŕňa pridanie živice Chelex do vzorky, varenie roztoku, následné premiešanie vortexovaním a centrifugáciu. Bunkové materiály sa viažu na guľôčky Chelex, zatiaľ čo DNA je dostupná v supernatante. [4] Chelexova metóda je oveľa rýchlejšia a jednoduchšia ako organická extrakcia a vyžaduje iba jednu skúmavku, čo znižuje riziko kontaminácie DNA. Bohužiaľ, extrakcia Chelex neprináša také množstvo a získaná DNA je jednovláknová, čo znamená, že ju možno použiť iba na analýzy založené na PCR a nie na RFLP. [4]

    Extrakcia na pevnej fáze, ako je napríklad extrakčná metóda založená na spinovej kolóne, využíva skutočnosť, že sa DNA viaže na oxid kremičitý. Vzorka obsahujúca DNA sa pridá do kolóny obsahujúcej silikagél alebo silikagélové guľôčky a chaotropné soli. Chaotropné soli narušujú vodíkové väzby medzi vláknami a uľahčujú väzbu DNA na oxid kremičitý tým, že spôsobujú, že nukleové kyseliny sa stanú hydrofóbnymi. Tým sa odkryjú fosfátové zvyšky, takže sú k dispozícii na adsorpciu. [7] DNA sa viaže na oxid kremičitý, zatiaľ čo zvyšok roztoku sa vymyje etanolom, aby sa odstránili chaotropné soli a ďalšie nepotrebné zložky. [3] DNA môže byť potom rehydratovaná vodnými roztokmi s nízkym obsahom soli, čo umožní elúciu DNA z guľôčok.

    Táto metóda poskytuje vysokokvalitnú, prevažne dvojvláknovú DNA, ktorú je možné použiť na analýzu PCR aj RFLP. Tento postup je možné zautomatizovať [4] a má vysokú priepustnosť, aj keď je nižší ako metóda fenol-chloroform. Jedná sa o jednokrokovú metódu, to znamená, že celý postup je dokončený v jednej skúmavke. To znižuje riziko kontaminácie, čo je veľmi užitočné pre forenznú extrakciu DNA. Komerčné súpravy na extrakciu na pevnej fáze vyrábajú a predávajú rôzne spoločnosti, jediným problémom je, že sú drahšie ako extrakcia organickou alebo extrakciou Chelex.

    Na izoláciu DNA z niektorých vzoriek je potrebné zvoliť špecifické techniky. Typické vzorky s komplikovanou izoláciou DNA sú:

    • archeologické vzorky obsahujúce čiastočne degradovanú DNA, pozri starovekú DNA[8]
    • vzorky obsahujúce inhibítory následných analytických postupov, predovšetkým inhibítory PCR, ako je kyselina humínová z pôdy, indigo a iné tkaninové farbivá alebo hemoglobín v krvi
    • vzorky z mikroorganizmov s hrubou bunkovou stenou, napríklad kvasiniek
    • vzorky obsahujúce zmiešanú DNA z viacerých zdrojov

    Extrachromozomálna DNA sa vo všeobecnosti ľahko izoluje, najmä plazmidy sa dajú ľahko izolovať bunkovou lýzou, po ktorej nasleduje precipitácia proteínov, ktoré zachytávajú chromozomálnu DNA v nerozpustnej frakcii a po centrifugácii je možné plazmidovú DNA purifikovať z rozpustnej frakcie.

    Hirtova extrakcia DNA je izolácia všetkej extrachromozomálnej DNA v cicavčej bunke. Hirtov extrakčný proces zbavuje jadrovú DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou a v bunke zostáva iba mitochondriálna DNA s nízkou molekulovou hmotnosťou a všetky vírusové epizómy.

    Indikátor difenylamínu (DPA) potvrdí prítomnosť DNA. Tento postup zahŕňa chemickú hydrolýzu DNA: pri zahrievaní (napr. Na teplotu ≥ 95 ° C) v kyseline vyžaduje reakcia deoxyribózový cukor, a preto je špecifická pre DNA. Za týchto podmienok sa 2-deoxyribóza prevedie na w-hydroxylevulinylaldehyd, ktorý reaguje so zlúčeninou, difenylamínom, za vzniku modro sfarbenej zlúčeniny. Koncentráciu DNA je možné stanoviť meraním intenzity absorbancie roztoku pri 600 nm spektrofotometrom a porovnaním so štandardnou krivkou známych koncentrácií DNA.

    Na meranie čistoty DNA sa používa meranie intenzity absorbancie roztoku DNA na vlnových dĺžkach 260 nm a 280 nm. DNA možno kvantifikovať rozrezaním DNA reštrikčným enzýmom, jej nanesením na agarózový gél, farbením etídium bromidom (EtBr) alebo iným farbením a porovnaním intenzity DNA s DNA markerom so známou koncentráciou.

    Pomocou metódy Southern blot je možné túto kvantifikovanú DNA izolovať a ďalej skúmať pomocou analýzy PCR a RFLP. Tieto postupy umožňujú diferenciáciu opakovaných sekvencií v genóme. Práve tieto techniky kriminalisti používajú na porovnávanie, identifikáciu a analýzu.

    Pri tejto metóde sú jadrá rastlín izolované fyzickým mletím tkanív a rekonštitúciou neporušených jadier v jedinečnom jadrovom izolačnom pufri (NIB). Plastidové DNA sa uvoľňujú z organel a eliminujú sa osmotickým pufrom premytím a centrifugáciou. Vyčistené jadrá sa potom lyzujú a ďalej čistia organickou extrakciou a genómová DNA sa vyzráža vysokou koncentráciou CTAB. Vysoko čistá gDNA s vysokou molekulovou hmotnosťou sa extrahuje z jadier, rozpustí sa v pufri s vysokým pH, čo umožňuje stabilné dlhodobé skladovanie. [9]


    Biológia symbiózy zvierat a dinoflagelátov

    Nástup, stabilita a rozpad symbiózy

    Zooxanthellae sa nachádzajú v mnohých druhoch koralov, ktoré pokrývajú nespočetné množstvo rodov a rodín. Zhora nadol: Fungia sp. (Fungiidae), Caulastraea sp. (teraz člen Merulinidae) a Trachyphyllia geoffroyi (Trachyphylliidae).

    Kedy Symbiodinium žijú voľne v oceáne, existujú v dvoch zameniteľných formách (Freudenthal 1962). Prvým je pohyblivý zoospór, ktorý sa sám pohybuje dopredu s bičíkom. Druhá forma je vegetatívna cysta a nie je pohyblivá, pretože v nej chýba bičík. Vegetatívne cysty sa môžu reprodukovať nepohlavne, ak žijú voľne alebo v symbióze, delením buniek, ktoré poskytne dve alebo tri dcérske bunky. Existujú náznaky, že Symbiodinium spp. môže sa rozmnožovať aj sexuálne (Stat et al. 2006). Vegetatívna cysta je dominantnou formou, keď dinoflageláty žijú v symbióze so zvieratami, a dôkazy naznačujú, že hostiteľ zvierat používa chemickú signalizáciu, aby ich udržal v tomto nepohyblivom stave (Koike et al. 2004). Vo väčšine prípadov symbiózy žijú zooxanthella vnútri živočíšnej hostiteľskej bunky, ohraničenej živočíšnou membránou, známou ako symbiosomálna membrána (Venn et al. 2008). U mušlí Tridacnid však zooxantely žijú extracelulárne, medzi vlastnými bunkami lastúrnikov (Ishikura et al. 1999). V koraloch sídlia zooxantely v gastroderme, bunkovej vrstve, ktorá pokrýva coelenterón alebo žalúdok polypov. V posledných rokoch sa v laboratóriu študovali mechanizmy, ktoré sú základom nástupu symbiózy koralov a zooxantel. V súčasnej dobe vedci rozdelili symbiózu medzi cnidariánmi a riasami na šesť fáz počiatočný kontakt, pohltenie, triedenie, proliferácia, stabilita a nakoniec dysfunkcia (Davy et al. 2012).

    Prehľad šiestich známych fáz symbiózy cnidarian-rias. 1: počiatočný povrchový kontakt medzi zooxantellou a živočíšnou hostiteľskou bunkou 2: pohltenie symbionta hostiteľskou bunkou 3: triedenie symbiontov, teraz uzavretých membránou hostiteľského pôvodu, čo vedie k odmietnutiu alebo prijatiu symbionta 4: rast symbionta delením buniek v hostiteľskom tkanive 5: stabilita, so stabilnou populáciou symbiontov 6: dysfunkcia a rozpad symbiózy v dôsledku stresu. Prekreslené od Davyho a kol. (2012).

    Po prvé, voľne žijúce zooxantely sa musia stretnúť s potenciálnymi hostiteľmi, ako sú koraly. Aj keď niektoré druhy koralov prenášajú svoje zooxanthella na svoje potomstvo prostredníctvom vajíčok, tento proces sa nazýva vertikálny prenos, mnoho druhov potrebuje každú generáciu získať nových symbiontov. Larvy koralov a polypy to robia tak, že ich vyberú z vodného stĺpca, ktorý sa nazýva horizontálny prenos. Rozpoznanie zooxantel ako potenciálnych symbiontov koralmi nie je úplne pochopené, vyžaduje si však nespočetné množstvo signálnych molekúl prítomných na povrchu buniek oboch partnerov. Keď bunky koralov úspešne rozpoznajú potenciálne kompatibilné zooxantely, bunky ich pohltia procesom nazývaným fagocytóza (z gréčtiny fageínalebo zožrať, kytosalebo bunka a osis, čo znamená proces). Ďalej sa spustí proces triedenia, ktorý vedie k tráveniu nechcených zooxantel a k pretrvávaniu ostatných. Preferencia koralov pre konkrétny typ zooxanthellae alebo klad závisí od mnohých faktorov vrátane druhov. Keď koral narazí na nekompatibilné zooxantely, spustí sa imunitná odpoveď a dinoflageláty sa zničia a vypudia. Vhodné zooxanthellae sa budú množiť v korodovom gastroderme a dôjde k stabilnej symbióze. Akonáhle je vytvorená stabilná symbióza, zooxanthellae a koraly môžu vzájomne ťažiť zo spolupráce výmenou živín (pozri tiež nižšie). Keď je však korál namáhaný, napríklad zvýšenými teplotami vody alebo vysokou intenzitou svetla, môže nastať jav známy ako bielenie koralov. Je to spôsobené dysfunkciou symbiózy, šiestej a poslednej známej fázy. Predpokladá sa, že k dysfunkcii počas tepelného alebo svetelného stresu dochádza v dôsledku poškodenia spôsobeného fotosyntetickým mechanizmom (alebo fotosystémami) zooxanthellae, ktoré spôsobuje tok toxických molekúl do tkaniva koralov (Venn et al. 2008). Tieto toxické molekuly sú takzvané reaktívne formy kyslíka a zahŕňajú superoxidové radikály (O2 –) a peroxid vodíka (H.2O2). V reakcii na tieto toxíny sú zooxantely pravdepodobne zničené a vyvrhnuté z gastrodermálnych buniek a ďalej ústami koralu.

    Mechanizmus, o ktorom sa predpokladá, že je základom rozpadu koralovej symbiózy. Tepelné a svetelné napätie spôsobuje poškodenie fotosystémov v zooxantele, čo vedie k produkcii superoxygénových radikálov (O2-) a peroxidu vodíka (H2O2). To spôsobuje poškodenie zooxanthelly a hostiteľskej bunky koralov, čo spôsobuje zničenie a vypudenie zooxanthelly a nakoniec bielenie. Prekreslené od Venna a kol. (2008).

    Narušenie symbiózy zviera-dinoflagelát faktormi prostredia nie je nič triviálne. Keď sú koraly v bielenom stave, už ich neudržiavajú životne dôležité živiny z ich zooxanthelly a musia rýchlo znova získať svojich symbiontov, aby zostali nažive. Žiaľ, dlhé a teplé letá často bránia koralom práve v tom a dochádza k masívnej koralovej úmrtnosti. V akváriách boli urobené podobné pozorovania. Mnoho akvaristov zažilo účinky tepla a svetelného stresu doma, počas teplých letných mesiacov alebo po aktualizácii svetiel v akváriu. Po niekoľkých dňoch zvýšenej teploty vody alebo intenzity svetla môžu koraly a sasanky úplne vybieliť, čo má za následok bledé bezfarebné akvárium. Preto je dôležité udržiavať stabilnú teplotu v akváriu a pomaly zvyšovať intenzitu svetla, aby sa zooxanthellae mohli prispôsobiť.

    Je známe, že citlivosť zooxantel na teplo a svetelný stres sa líši medzi kladmi, pričom kladivo D je najviac tolerantné voči teplu (Baker et al. 2004). Je to pravdepodobne spôsobené tým, že tieto zooxantely majú fotosyntetické membrány, ktoré zostávajú stabilné aj pri teplotách okolo 32 ° C a pri tejto zvýšenej teplote neuvoľňujú toxické reaktívne druhy kyslíka do tkaniva koralov (Tchernov et al. 2004) ). To vysvetľuje, prečo niektoré koraly počas horúceho leta bielia a iné nie.

    Výmena živín v rámci symbiózy

    Pokiaľ je symbióza medzi zooxanthellae a koralmi neporušená, obaja partneri ťažia zo zložitej výmeny živín. Koralové bunky poskytujú zooxanthelám anorganický uhlík a dusík (oxid uhličitý, amónium), ktoré vznikajú rozkladom organických zlúčenín získaných zo zooxantel (glycerol, glukóza, aminokyseliny, lipidy) a okolitej vody (planktón, detritus, rozpustené organické látky). záležitosť). Zooxantely zase využívajú anorganické zlúčeniny získané z koralov a morskej vody (oxid uhličitý, hydrogénuhličitan, amónny, dusičnan, hydrogenfosforečnan) na výrobu organických molekúl prostredníctvom procesu fotosyntézy. Väčšina týchto organických molekúl, teraz nazývaných fotosyntáty, sa potom prenesie späť do hostiteľa. Táto výmena živín medzi koralmi a zooxanthellami im umožňuje efektívne využívať málo dostupné živiny v oceáne. Translokácia energeticky bohatých zlúčenín zo zooxanthellae na ich hostiteľa umožnila koralom vybudovať obrovské útesy prostredníctvom sekrécie kostier uhličitanu vápenatého.

    Prehľad výmeny živín medzi jednou bunkou koralu a zooxantely. Koraly prijímajú organické zlúčeniny ako planktón, detritus (alebo častice organickej hmoty, POM), močovinu, aminokyseliny a glukózu (alebo rozpustenú organickú hmotu, DOM) z morskej vody. Okrem toho prijíma organické molekuly zo zooxantel, napríklad glycerol. Bunka koralov ich rozloží na amoniak a oxid uhličitý, ktoré sú následne absorbované zooxantelou. Zooxanthella tiež prijíma z vody anorganické zlúčeniny ako amoniak (NH4+), dusičnan (NO3-), hydrogenfosforečnan (HPO42-), bikarbonát (HCO3-) a oxid uhličitý (CO2) a prevádza ich na organické molekuly, hlavne prostredníctvom fotosyntézy. Väčšina týchto zlúčenín je opäť vylučovaná do koralovej hostiteľskej bunky. Tento cyklus živín medzi koralovými hostiteľskými bunkami a ich symbiotickými zooxanthellae umožňuje koralom rásť v prostredí chudobnom na živiny. Prekreslené od Davyho a kol. (2012).

    Je zrejmé, že zooxanthella jednoducho neprenášajú prebytočné látky na svojho koralového hostiteľa. Uvoľňovanie fotosyntátov zo zooxanthel je šikovne vyvolané koralmi pomocou takzvaného “hostiteľského uvoľňovacieho faktora” alebo HRF. Tento HRF je látka produkovaná koralmi, pravdepodobne kokteilom špecifických aminokyselín, ktorá zooxanthellae spúšťa uvoľňovanie výživného glycerolu a glukózy (Gates a kol. 1995 Wang a Douglas 1997). Skutočne, keď sa kvapka kaše z koralového tkaniva pridá do a Symbiodinium kultúre, rýchlo vyvolá uvoľňovanie živín dinoflagelátmi (Trench 1971). Avšak Davy a kol. (2012) poukazujú na to, že HRF sa nesmie generalizovať medzi hostiteľskými druhmi, pretože dôkazy naznačujú, že rôzne druhy môžu používať rôzne typy HRF ’s.

    Napriek tomu, že koraly zo svojich zooxantel získavajú značné množstvo organických zlúčenín, výskum silne naznačuje, že na udržanie optimálneho rastu je potrebný externý zdroj potravy (prehľad Houlbrèque a Ferrier-Pagès 2009). Je to preto, že koraly vyžadujú dodatočné bielkoviny a lipidy na rast tkaniva a organickej matrice, bielkovinového skeletu, ktorý poskytuje miesta pre vyzrážanie kryštálov uhličitanu vápenatého. Poskytovanie dennej dávky zooplanktónu koralom, ako sú veslonôžky alebo nauplie žiabronôžky, im nielenže poskytuje výživu, ale mierne zvýšenie anorganických živín tiež nakŕmi zooxantely. Okrem toho sa stimuluje kolobeh živín v rámci symbiózy. Niektorým akváriám tak chýbajú živiny v dôsledku použitia ťažkej filtrácie spojenej s obmedzeným kŕmením, že zooxantely prestanú rásť a uhynú. To spôsobuje, že koraly vyzerajú vybielené, a keď k tomu dôjde, je nevyhnutné znížiť rýchlosť filtrácie a/alebo zvýšiť kŕmenie.

    Korál je zavesený na drôte na váženie pod vodou alebo na hladine.


    ÚVOD

    Nedávny pokrok vo výskume genómových porúch si vyžiadal zber veľkého množstva kvalitnej DNA, ktorú je potrebné získať z rôznych zdrojov vzoriek. Typizácia DNA je v súčasnosti najviac overenou metódou na osobnú identifikáciu škvŕn ľudských telesných tekutín nájdených na miestach činu. V širokej škále genetických štúdií je bežne používanou metódou získanie genómovej DNA z jadrových buniek periférnej krvi v dôsledku invazívnosti tohto prístupu, môže byť ťažké získať vzorky od subjektov štúdie. 1, 2 Izolačné schémy boli únavné a celkové časy analýzy boli tiež dosť dlhé. Medzi ďalšie alternatívne zdroje izolácie DNA patria bukálne bunky, vlasy s folikulmi a moč, ktoré sa dajú ľahšie získať neinvazívnym spôsobom ako invazívnym odberom krvi. 2 Odber bukálnych buniek sa dá ľahko vykonať bukálnym tampónom vatovým tampónom alebo použitím postupu na výplach úst. 3 Izolácia DNA pomocou bukálnych tampónov poskytuje mnoho výhod, ako je nákladovo efektívne spracovanie, nižšia požiadavka na objem vzorky, dlhodobá archivácia a vhodnosť vlastného zberu. Pre pacienta je to pohodlnejšie a bukálne výtery poskytujú dostatok DNA pre PCR, pretože vyžadujú len niekoľko nanogramov DNA. 3

    Ľudské vlasy sú jedným z najbežnejších biologických materiálov spojených s právnym vyšetrovaním a používajú sa na štatistickú prácu obyvateľstva a analýzu DNA v kriminalistike. 4 Najcennejšou metódou testovania DNA je krátka tandemová opakovaná analýza jadrovej DNA. 5 To je možné, ak je prítomná koreňová časť vlasov a/alebo priliehajúce tkanivo. Telogénne chĺpky (vypadnuté vlasy), často spojené s miestom činu, však nemusia obsahovať žiadny jadrový materiál. 5 Bunkové mitochondrie a mitochondriálna DNA (mtDNA) stále zostávajú neporušené, 5, 6 zatiaľ čo jadro degraduje, keď sa vlasový kmeň počas keratinizácie vytvrdzuje, a analýza mtDNA je z keratinizovaných vlasov uskutočniteľná. Žiaľ, povaha vzoriek vlasov bohatých na bielkoviny si vyžaduje ďalšie kroky na rozbitie drieku a uvoľnenie DNA (ako je fragmentácia pomocou mikroskopického skleneného mlynčeka, po ktorej nasleduje extrakcia organickým rozpúšťadlom) 7 – 9 , čím sa vzorka vystaví zvýšené riziko kontaminácie. Forenzné vyšetrovanie škvŕn ľudského moču má veľký význam pri identifikácii presného miesta činu a typu smrti. 10 Ľudský moč je vhodnou vzorkou na toxikologickú analýzu dopingových a skríningových testov na lieky. 11

    Vzhľadom na praktické ťažkosti a metodologické dôvody je však nevyhnutné optimalizovať podmienky na maximalizáciu výťažku a čistoty DNA získanej z rôznych druhov vzoriek pomocou rôznych metód. Zjednodušená metóda demonštrovaná v tejto štúdii na extrakciu DNA z vlasových stôp, ktorá redukuje zbytočné kroky, prakticky eliminuje kontamináciu DNA a tiež výrazne šetrí časové trvanie analýzy, ktorá by bola užitočná pre forenznú komunitu, ako aj pre výskumná komunita založená na populácii. Okrem toho požiadavka na nižší objem vzorky spojená so zberom vzoriek neinvazívnym spôsobom umožňuje odber detských vzoriek, ktoré sa ľahko prejavujú v širšom nábore do populačných prípadových štúdií. Ďalej je možné uvažovať o vývoji tejto zjednodušenej metódy, pretože ju možno použiť ako lekársky diagnostický nástroj s analýzou DNA, ktorú je možné vykonať v primerane krátkom časovom meradle (𢏈 h) na detekciu chorobných stavov, ktoré súčasná diagnostická medicína pole dychtivo túži.


    Dusíkatý odpad u vtákov a plazov: Kyselina močová

    Vtáky a plazy si vyvinuli schopnosť premieňať toxický amoniak na kyselinu močovú alebo guanín, a nie na močovinu.

    Učebné ciele

    Porovnajte hlavný vedľajší produkt metabolizmu amoniaku u cicavcov s vtákmi a plazmi

    Kľúčové poznatky

    Kľúčové body

    • Dusíkaté odpady v tele majú tendenciu vytvárať toxický amoniak, ktorý sa musí vylúčiť.
    • Cicavce, ako sú ľudia, vylučujú močovinu, zatiaľ čo vtáky, plazy a niektoré suchozemské bezstavovce produkujú kyselinu močovú ako odpad.
    • Uricotelové organizmy majú tendenciu vylučovať odpad kyseliny močovej vo forme bielej pasty alebo prášku.
    • Premena amoniaku na kyselinu močovú je energeticky náročnejšia ako premena amoniaku na močovinu.
    • Výroba kyseliny močovej namiesto močoviny je výhodná, pretože je menej toxická a znižuje straty vody a následnú potrebu vody.

    Kľúčové pojmy

    • močovina: vo vode rozpustná organická zlúčenina, CO (NH2) 2, vznikajúca metabolizmom bielkovín a vylučovaná močom
    • guano: exkrementy morských vtákov, netopierov žijúcich v jaskyniach, plutvonožcov alebo vtákov všeobecnejšie
    • purín: ktorákoľvek z triedy organických heterocyklických báz obsahujúcich kondenzované pyrimidínové a imidazolové kruhy sú zložkami nukleových kyselín
    • xantín: prekurzor kyseliny močovej nachádzajúcej sa v mnohých orgánoch tela
    • hypoxantín: medziprodukt v biosyntéze kyseliny močovej
    • kyselina močovábicyklická heterocyklická fenolová zlúčenina, ktorá vzniká v tele metabolizmom bielkovín a vylučuje sa močom

    Dusíkatý odpad v vtákoch a plazoch: kyselina močová

    Zo štyroch hlavných makromolekúl v biologických systémoch obsahujú dusík aj proteíny a nukleové kyseliny. Počas katabolizmu alebo rozkladu makromolekúl obsahujúcich dusík sa uhlík, vodík a kyslík extrahujú a ukladajú vo forme uhľohydrátov a tukov. Nadbytočný dusík sa z tela vylučuje. Dusíkaté odpady majú tendenciu vytvárať toxický amoniak, ktorý zvyšuje pH telesných tekutín. The formation of ammonia itself requires energy in the form of ATP and large quantities of water to dilute it out of a biological system.

    While aquatic animals can easily excrete ammonia into their watery surroundings, terrestrial animals have evolved special mechanisms to eliminate the toxic ammonia from their systems. The animals must detoxify ammonia by converting it into a relatively-nontoxic form such as urea or uric acid.

    Nitrogen excretion: Nitrogenous waste is excreted in different forms by different species. These include (a) ammonia, (b) urea, and (c) uric acid.

    Birds, reptiles, and most terrestrial arthropods, such as insects, are called uricothelic organisms because they convert toxic ammonia to uric acid or the closely-related compound guanine (guano), rather than urea. In contrast, mammals (including humans) produce urea from ammonia however, they also form some uric acid during the breakdown of nucleic acids. In this case, uric acid is excreted in urine instead of in feces, as is done in birds and reptiles.

    Uric acid is a compound similar to purines found in nucleic acids. It is water insoluble and tends to form a white paste or powder. The production of uric acid involves a complex metabolic pathway that is energetically costly in comparison to processing of other nitrogenous wastes such as urea (from the urea cycle) or ammonia however, it has the advantages of reducing water loss and, hence, reducing the need for water.

    Uric acid is also less toxic than ammonia or urea. It contains four nitrogen atoms only a small amount of water is needed for its excretion. Out of solute, it precipitates and forms crystals. The enzyme xanthine oxidase makes uric acid from xanthine and hypoxanthine, which in turn are produced from other purines. Xanthine oxidase is a large enzyme whose active site consists of the metal, molybdenum, bound to sulfur and oxygen. Uric acid is released in hypoxic conditions.


    Can I pellet DNA back from dissolved state? - Biológia

    A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis .

    Lodhi, Muhammad A., Guang-Ning Ye, Norman F. Weeden and Bruce I. Reisch. 1994.

    Plant Molecular Biology Reporter 12(1): 6-13.

    Department of Horticultural Sciences, New York State Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY 14456.

    Key Words: DNA extraction, Vitis sp., polyphenols, polysaccharides , RAPD, restriction digestion.

    A quick, simple and reliable DNA extraction method for grapevine species, hybrids and Ampelopsis ( Vitaceae ) has been developed. This method is a modification of Doyle and Doyle (1990). It is a CTAB-based extraction procedure modified by the use of NaCl to remove polysaccharides and PVP to eliminate polyphenols during DNA purification. The method also has been used successfully for extraction of total DNA from other fruit species such as apple ( Malus domestica ), apricot ( Prunus armeniaca ), cherry ( Prunus avium ), peach ( Prunus persica ), plum ( Prunus domestica ) and raspberry ( Rubus idaeus ). DNA yield from this procedure is high (up to 1 mg/g of leaf tissue). DNA is completely digestible with restriction endonucleases and amplifiable in the polymerase chain reaction (PCR), indicating freedom from common contaminating compounds.

    Vitis vinifera and related species have been the subject of extensive genetic studies due to their worldwide cultivation and importance. Recently this plant has been used for gene mapping (Yamamoto et al., 1991 Mauro et al., 1992 Weeden et al., 1992 Lodhi et al., 1992a 1992b1993 Hain et al., 1993), genetic transformation (Baribault et al., 1989 Baribault et al., 1990 Hébert et al., 1993), and DNA fingerprinting (Striem et al., 1990 Bourquin et al., 1991). The relatively small genome size of Vitis vinifera (0.50 pg/C) compared to many other perennial plant species (Arumuganathan and Earle, 1991) should facilitate molecular genetic studies of Vitis . However, DNA extraction from grapevine has been difficult due to the presence of contaminants such as polyphenols and polysaccharides. These compounds have also been reported to cause difficulty in DNA purification in other plant species polysaccharides (Murray and Thompson, 1980 Fang et al., 1992) polyphenolic compounds (Katterman and Shattuck, 1983 Couch and Fritz, 1990 Howland et al. 1991 Collins and Symons, 1992) and sticky and resinous materials (Webb and Knapp, 1990). The presence of these contaminants in DNA preparations often makes the samples viscous and renders DNA unrestrictable in endonuclease digestion and unamplifiable in PCR. The existing DNA extraction protocols often produce unsatisfactory yields and/or quality (Bourquin et al., 1991 Collins and Symons, 1992).

    Here we report a simple, inexpensive and quick DNA extraction procedure for grapevine Vitis species, hybrids and Ampelopsis . This procedure purifies greater amounts of clean DNA which can be amplified via PCR or digested with endonucleases.

    See Table I for the source of plant material used in this study.

    Extraction buffer: 20 mM sodium EDTA and 100 mM Tris-HCl, adjust pH to 8.0 with HCl, add 1.4 M NaCl and 2.0% (w/v) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide). Dissolve CTAB by heating to π C. Store at 37 C. Add 0.2 % of ß-mercaptoethanol just before use.

    TE buffer: 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, adjust pH to 8.0 and autoclave

    RNAase A (Sigma R9009: 10 mg/mL)

    • Collect unexpanded young leaves in liquid nitrogen or on ice and store at or below -70°C until used. Avoid thawing before grinding the leaf tissue. Grind 0.5 g of leaves using mortar and pestle in the presence of liquid nitrogen. Although leaves should be thoroughly crushed before adding extraction buffer, it is important not to grind the leaves into a very fine powder as it results in shearing of DNA.

    • Add 5 mL of extraction buffer to the ground leaves and mix in the mortar.

    • Pour the slurry into clean 15 mL polypropylene centrifuge tubes (Laboratory Product Sales, Rochester, New York LX 4109), rinse the mortar and pestle with 1 mL of extraction buffer and add to the original extract.

    • Add 50 mg polyvinylpolypyrrolidone (PVP), (Sigma, P6755) and invert the tubes several times to mix thoroughly with the leaf slurry (100 mg PVP/g leaf tissue).

    • Incubate at 60°C for 25 minutes and cool to room temperature.

    • Add 6 mL of chloroform:octanol and mix gently by inverting the tubes 20 to 25 times to form an emulsion.

    • Spin at 6000 rpm for 15 minutes in a table top centrifuge at room temperature.

    • Transfer the top aqueous phase to a new 15 mL centrifuge tube with a wide-bore pipette tip. A second chloroform:octanol extraction may be performed if the aqueous phase is cloudy due to the presence of PVP.

    • Add 0.5 volume of 5M NaCl to the aqueous solution recovered from the previous step and mix well.

    • Add two volumes of cold (-20°C) 95% ethanol and refrigerate (4 to 6°C) for 15-20 minutes or until DNA strands begin to appear. The solution can be left for one hour or more if necessary.

    • Spin at 3000 rpm for three minutes and then increase speed to 5000 rpm for an additional three minutes at room temperature. This differential spinning step helps to keep DNA at the bottom of the centrifuge tube.

    • Pour off supernatant and wash pellet with cold (0 to 4°C) 76% ethanol. Completely remove ethanol without drying the DNA pellet by leaving the tubes uncovered at 37°C for 20 to 30 minutes.

    • Dissolve in 200 to 300 L TE.

    • Treat with 1 L RNAase A per 100 L DNA solution and incubate at 37°C for 15 minutes.

    • Quantify DNA in a spectrophotometer at A 260.

    • Keep DNA at -70 C for long term and -20°C for short term storage.

    We have obtained higher yields of clean DNA from grapevine leaves by using the modified DNA extraction procedure outlined above. The procedure used for DNA extraction is CTAB-based and is modified from Doyle and Doyle (1990). NaCl has been used to remove polysaccharides (Fang et al., 1992), and PVP to purge polyphenols (Maliyakal, 1992). This procedure does not involve CsCl density gradient purification steps.

    DNA yields from Vitis species, Ampelopsis and other woody perennial plant species by the above mentioned procedure range from 0.5 to 1.0 mg/g fresh leaf tissues with A 260 /A 280 between 1.8 and 2.0 (Table 1). The procedure is fast and simple and 30 to 40 DNA samples may be processed in a single day. Results of DNA restriction digestion with three endonucleases ( Eco RI, Eco RV and Hin dIII) showed complete digestion (Fig. 1a). It is also evident that the uncut DNA exhibits little shearing and is suitable for Southern (1975) hybridization (Fig. 1b). The DNA is also amplifiable in PCR using the RAPD technique (Williams et al., 1990) (Fig. 2).

    Proper choice of the leaf tissue is very important for DNA extraction. The use of very young leaf tissues has resulted in poor yields. We found that partially expanded leaves are the best material. This is consistent with the results reported by Mauro et al. (1992), in which the best results were obtained from rapidly expanding leaves, one to two nodes from the shoot tip. With fully expanded leaves the yield was low and the DNA was not completely digestible. However, we were able to get equally good results with fully expanded leaves when PVP was added to the extraction buffer. PVP has been used to remove polyphenols from mature, damaged and improperly stored leaf tissues (Rogers and Bendich, 1985 Doyle and Doyle, 1987, Howland et al., 1991). PVP forms complex hydrogen bonds with polyphenolic compounds which can be separated from DNA by centrifugation (Maliyakal, 1992). The presence of polyphenolic compounds can be reduced by keeping plant material frozen before extraction and by using PVP in the DNA extraction procedure. The developmental stage of the plant is also important. The optimal time for leaf collection was during the period of active shoot elongation following bud break. Later in the season DNA extraction was difficult and the DNA obtained was unstable for long term storage.

    Complete digestion with restriction endonucleases and amplification in PCR indicate the absence of polysaccharides. Polysaccharides are difficult to separate from DNA (Murray and Thompson, 1980). These compounds are easily identifiable in the DNA preparations as they impart a sticky, viscous consistency to the DNA preparations dissolved in TE buffer. Polysaccharides interfere with several biological enzymes such as polymerases, ligases and restriction endonucleases (Shioda et al., 1987 Richards, 1988). We found that when polysaccharides were not removed the DNA would not amplify. PCR amplification of the DNA with several ten base long oligonucleotides and complete DNA restriction results are consistent with these results. DNA amplification was possible due to the absence of contaminants (Webb and Knapp, 1990 Fang et al., 1992). Fang et al. (1992) found that 1 M NaCl facilitated the removal of polysaccharides by increasing their solubility in ethanol so that they did not co-precipitate with the DNA. However, we found higher concentrations of NaCl (more than 2.5 M) were more effective with the species under study.

    The simplicity of the procedure makes it very practical for DNA extraction especially from Vitis species, hybrids and Ampelopsis and generally from other plant species such as apple, apricot, peach, plum and raspberry. Moreover, DNA yield is higher compared with other procedures used for DNA extraction from grapevines (Bourquin et al., 1991, 5-20 g nuclear DNA /g FW Collins and Symons, 1992, 10-30 g DNA/g FW and Thomas et al., 1993, 25-150 g DNA/g FW). Doyle and Doyle (1987) reported DNA yields up to 1 mg/g of fresh leaf tissues from different plant species and this procedure was used by Mauro et al. (1992) for extraction of grapevine DNA. We have not been able to obtain such a high yield when this procedure was used on grapevine (data not shown). However, we found that DNA extracted by that procedure was occasionally brownish in color and difficult to digest with restriction endonucleases. Such samples also were found to have a shorter storage life. Likewise, the procedure of Doyle and Doyle (1987) gave similar results for different Vaccinium sp. (Rowland and Nguyen, 1993). Our modification of Doyle and Doyle (1990) consistently produces high quality DNA which remains usable for at least two years when stored at -20°C.

    Acknowledgments: We are thankful to Dr. Philip L. Forsline, USDA, ARS, National Clonal Germplasm Repository, Geneva, New York for providing us with Vitis species plant material, Dr. Robert L. Andersen for cherry, apricot, plum and peach, and Mr. Kevin E. Maloney for raspberry. We wish to thank Drs. John C. Sanford and Susan K. Brown for their critical review and valuable suggestions.

    Arumuganathan, K. and E.D. Earle. 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol. Biol. Rep. 9:208-218.

    Baribault, T.J., K.G.M. Skene and N.S. Scott. 1989. Genetic transformation of grapevine cells. Plant Cell Rep. 8:137-140.

    Baribault, T.J., K.G.M. Skene, P.A. Cain and N.S. Scott. 1990. Transgenic grapevines: Regeneration of shoots expressing ß-glucuronidase. J. Exp. Bot. 41:1045-1049.

    Bourquin, J.-C., L. Otten and B. Walter. 1991. Identification of grapevine root-stocks by RFLP. C.R. Acad. Sci. Paris 312 Série III:593-598.

    Collins, G.G. and R.H. Symons. 1992. Extraction of nuclear DNA from grape vine leaves by a modified procedure. Plant Mol. Biol. Rept. 10:233-235.

    Couch, J.A. and P.J. Fritz. 1990. Isolation of DNA from plants high in polyphenolics. Plant Mol. Biol. Rep. 8:8-12.

    Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues. Phytochem Bull. 19:11-15.

    Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15.

    Fang, G., S. Hammar and R. Rebecca. 1992. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. BioTechniques 13:52-56.

    Hain, R., H.J. Reif, E. Krause, R. Langebartels, H. Kindl, B. Vornam, W. Wiese, E. Schmelzer, P.H. Schreier, R.H. Stöcker and K. Stenzel. 1993. Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361:153-156.

    Hébert, D., J.R. Kikkert, F.D. Smith and B.I. Reisch. 1993. Optimization of biolistic transformation of embryogenic grape cell suspensions. Plant Cell Rep. (In Press).

    Howland, D.E., R.P. Oliver and A.J. Davy. 1991. A method of extraction of DNA from birch. Plant Mol. Biol. Rep. 9:340-344.

    Katterman, F.R.H. and V.I. Shattuck. 1983. An effective method of DNA isolation from the mature leaves of Gossypium species that contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins. Preparative Biochemistry 13:347-359.

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1992a. Molecular genetic mapping and genome size of Vitis. Plant Genome-I, 9-11 November, San Diego, CA. (Abstract).

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1992b. Molecular genetic mapping of the Vitis genome. Am. J. Enol. Vitic. 43:393 (Abstract).

    Lodhi, M.A., B.I. Reisch and N.F. Weeden. 1993. Molecular genetic mapping and genome size of Vitis . 90th Meeting Am. Soc. Hort. Sci., July 24-29 (1993), Nashville, TN. (Abstract) HortScience (in press).

    Maliyakal, E.J. 1992. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Res. 20:2381.

    Mauro, M.-C., M. Strefeler, N.F. Weeden and B.I. Reisch. 1992. Genetic analysis of restriction fragment length polymorphisms in Vitis . J. Hered. 83:18-21.

    Murray, M.G. and W.F. Thompson. 1980. Rapid isolation of high molecular weight DNA. Nucleic Acids Res. 8:4321-4325.

    Richards, E. 1988. Preparation of genomic DNA from plant tissue. In: Current Protocols in Molecular Biology. (eds. F.M. Ausubel, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl), pp. 2.3.2-2.3.3. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.

    Rogers, S.O. and A.J. Bendich. 1985. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol. Biol. 5:69-76.

    Rowland, L.J. and B. Nguyen. 1993. Use of polyethylene glycol for purification of DNA from leaf tissue of woody plants. BioTechniques 14: 734-736.

    Shioda, M. and K. Marakami-Muofushi. 1987. Selective inhibition of DNA polymerase by a polysaccharide purified from slime of Physarum polycephalum . Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:61-66.

    Striem, M.J., P. Spiegel-Roy, G.Ben-Hayyim, J. Beckmann and D. Gidoni. 1990. Genomic fingerprinting of Vitis vinifera by the use of multi-loci probes. Vitis 29:223-227.

    Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

    Thomas, M.R., S. Matsumoto, P. Cain and N.S. Scott. 1993. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification. Theor. Appl. Genet. 86:173-180.

    Webb, D.M. and S.J. Knapp. 1990. DNA extraction from a previously recalcitrant plant genus. Plant Mol. Biol. Rep. 8:180-185.

    Weeden, N.F., G.M. Timmerman, M. Hemmat, B.E. Kneen and M.A. Lodhi. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers. In: Proc. Joint Plant Breeding Symposium Series. Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Crop Science Society of America, American Society for Horticultural Science and American Genetic Association. pp. 12-17.

    Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535.

    Yamamoto, N., G. Ono, K. Takashima and A. Totsuka. 1991. Restriction fragment length polymorphisms of grapevine DNA with phenylalanine ammonia-lyase cDNA. Jap. J. Breed. 41:365-368.

    Table I. Sources and DNA yield of the plant material used for DNA extraction.

    Vitis vinifera cv. Cabernet sauvignon

    Ampelopsis brevipedunculata

    Apple ( Malus domestica cv. Red Delicious)

    Apricot ( Prunus armeniaca cv. NY 500)

    Cherry ( Prunus avium cv. NY 6476)

    Peach ( Prunus persica cv. Rutgers Red Leaf)

    Plum ( Prunus domestica cv. NY 65.363.1)

    Raspberry ( Rubus idaeus cv. NY 83)

    a NYSAES (New York State Agricultural Experiment Station, Geneva, New York)


    Troubleshooting Guide for Genomic DNA Extraction & Purification (NEB #T3010)

    Need some help purifying genomic DNA with the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)? We&rsquore here to help. Our troubleshooting guide below outlines some of the most common pain points that scientists encounter during gDNA purification. You can also find guidance on choosing appropriate input amounts in our online resource, Choosing Input Amounts for the Monarch Genomic DNA Purification Kit. Still having trouble? Contact our technical support at any time.

    • Thaw cell pellets slowly on ice and flick tube several times to release the pellet from the bottom of the tube. Be sure to use cold PBS for resuspension, and resuspend gently by pipetting up and down 5&ndash10 times until a uniformly turbid cell suspension is obtained and the pellet is completely dissolved.
    • Add Proteinase K and RNase A to sample and mix well before adding the Cell Lysis Buffer, otherwise the high viscosity of the lysate will impede proper mixing of the enzymes.
    • Keep frozen blood samples frozen and add Proteinase K, RNase A and Blood Lysis Buffer directly to the frozen samples. Start lysis right away and let the samples thaw upon lysis incubation.
    • Fresh (unfrozen) whole blood should not be older than a week. Older samples will show a progressive amount of DNA degradation and loss of yield.
    • Digestion of whole blood samples from some animal species with high hemoglobin content (e.g. guinea pig) may lead to the accumulation of insoluble hemoglobin complexes that stain and clog the membrane, leading to reduced yield and purity. Reduce Proteinase K lysis time from 5 to 3 minutes to prevent the formation of these precipitates.
    • Cut starting material to the smallest possible pieces or grind with liquid nitrogen. In large tissue pieces, nucleases will destroy the DNA before the Proteinase K can lyse the tissue and release the DNA.
    • Proteinase K digestion of fibrous tissues (e.g. muscle, heart, skin, ear clips), brain tissue and all RNAlater-stabilized tissues leads to the release of small indigestible protein fibers that often gives the lysate a turbid appearance. These fibers will block the binding sites of the silica membrane reducing yield and causing protein contamination. To remove fibers, centrifuge lysate at maximum speed for 3 minutes, as indicated in the protocol. For ear clips and brain tissue, use no more than 12&ndash15 mg input material, otherwise the fiber removal will not be complete.
    • Samples that are stored for long periods of time at room temperature, 4°C or -20°C will show degradation and loss of the gDNA content over time. Flash freeze tissue samples with liquid nitrogen or dry ice and store them at -80°C. Alternatively, use stabilizing reagents to protect the gDNA and enable storage for longer periods of time at 4°C or -20°C.
    • Organ tissues like pancreas, intestine, kidney and liver contain significant amounts of nucleases. They should be treated with extreme care and stored properly to prevent DNA degradation. Keep frozen and on ice during sample preparation. Refer to the protocol for the recommended amount of starting material and Proteinase K to use.
    • Some organ tissues (e.g. spleen, kidney, liver) are extremely rich in genomic DNA. Attempting to process quantities larger than the recommended input amounts will result in the formation of clouds of tangled, long-fragment gDNA that cannot be eluted from the silica membrane. Reduce the amount of input material to get a higher yield.
    • Most samples are digested with 10 µl Proteinase K, but for brain, kidney and ear clips, using 3 µl will provide better yields.
    • Samples that are stored for long periods of time at room temperature, 4°C or -20°C will show degradation and loss of the gDNA content over time. Shock freeze tissue samples with liquid nitrogen or dry ice and store them at -80°C. Alternatively, use stabilizing reagents such as RNAlater to protect the gDNA and enable storage for longer periods of time at 4°C or -20°C.
    • Cut starting material to the smallest possible pieces or grind with liquid nitrogen. In large tissue pieces, nucleases will degrade the DNA before the Proteinase K can lyse the tissue and release the DNA.
    • Organ tissues like pancreas, intestine, kidney and liver have a very high nuclease content. They should be treated with extreme care (see &lsquoSample not stored properly&rsquo section above) to prevent DNA degradation. Keep frozen and on ice during sample preparation.
    • Fresh (unfrozen) whole blood should not be older than a week. Older samples will show a progressive amount of DNA degradation and loss of yield.
    • Thawing frozen blood samples releases DNase, causing degradation. Keep frozen blood samples frozen and add enzymes and lysis buffer directly to the frozen samples. Start lysis right away and let the samples thaw upon lysis incubation.

    Guanidine salt was carried over into the eluate:

    The binding buffer contains guanidine thiocyanate (GTC), which shows a very strong absorbance at 220&ndash230 nm.

    The most common way that salt is introduced into the eluate is by allowing the buffer/lysate mixture to contact the upper column area.

      When transferring the lysate/binding buffer mix, avoid touching the upper column area with the pipet tip always pipet carefully onto the silica membrane.


    Pozri si video: peletovací lis mp 150 cronimo (Február 2023).