Informácie

Rozdiely medzi synaptickými spojeniami

Rozdiely medzi synaptickými spojeniami


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zvážte nasledujúce synaptické spojenia (odtiaľ):

axodendritický - Termín týkajúci sa excitačného alebo inhibičného synaptického spojenia medzi presynaptickým axónom vysielajúceho neurónu a postsynaptickým dendritom (dendritom) prijímajúceho neurónu v dráhe nervového impulzu; také spojenia môžu ovplyvniť, či sa na postsynaptickom dendrite vygeneruje odstupňovaný potenciál alebo nie.

axosomatické - Termín vzťahujúci sa na excitačné alebo inhibičné synaptické spojenie medzi presynaptickým axónom vysielajúceho neurónu a telom/somom postsynaptického bunky prijímajúceho neurónu v dráhe nervových impulzov; takéto spojenia môžu ovplyvniť, či bude alebo nebude generovaný akčný potenciál v postsynaptickej spúšťacej zóne axónu na vrchole axónu.

axoaxonický - Termín týkajúci sa excitačného alebo inhibičného synaptického spojenia medzi presynaptickým axónom vysielajúceho neurónu a postsynaptickým axónovým kopčekom alebo axónom prijímajúceho neurónu v dráhe nervového impulzu; takéto spojenia môžu ovplyvniť, či bude alebo nebude generovaný akčný potenciál v postsynaptickej spúšťacej zóne axónu na vrchole axónu.

Aké sú presne rozdiely medzi spojeniami z hľadiska ich vplyvu na neurón?

Podľa môjho chápania:

  • axodendritický: ovplyvňuje dendrit $ rightarrow $ teda ovplyvňuje stupňovaný potenciál neurónu
  • axosomatický: priamo ovplyvňuje stupňovaný potenciál neurónu
  • axoaxonický: ovplyvňuje iba axón (nezávisle od neurónu?)

Podľa môjho chápania teda axodendritické a axosomatické spojenia prinášajú rovnaký výsledok: ovplyvňujú stupňovaný potenciál neurónu (napr. či neurón "vystrelí"), kde axoaxonické spojenie ovplyvňuje iba to, či axón vystrelí. Je to správne?

Ak je to tak, aký je účel dendritov? Ak sa axóny môžu spojiť s bunkovým telom priamo, prečo by potom potrebovali dendrity (okrem toho, že poskytujú väčšiu spojovaciu plochu pre neurón)?

Poznámka: Čítal som túto odpoveď, ktorá čiastočne vysvetľuje použitie dendritov. Uvádza však tiež, že pokles signálu v dôsledku synaptickej polohy je kompenzovaný zmenou lokálneho potenciálu. Preto odpoveď IMO uvádza, že hlavnou výhodou dendritov je, že inhibičné axosomatické synapsie môžu ťažiť zo závislosti od polohy axodendritických synapsií. Je to pravý a jediný účel axosomatických synapsií? (Opravte ma, ak je môj záver nesprávny!)


Neuróny sú o špecializovaných štruktúrach, ktoré majú špecializované úlohy. Dali ste dobré odôvodnenie pre dendrity --- efektívny spôsob, ako umiestniť veľa spojov na malý priestor. Napríklad pyramídový neurón v kôre bude mať desaťtisíce synapsií. Ak by ste mali iba axosomatické spojenia, soma by musela byť obrovská, aby sa do nich zmestili všetky (a to by spôsobilo množstvo ďalších problémov).

Dendritická štruktúra tiež umožňuje článku efektívnejšie elektrické vlastnosti (pozri teóriu káblov) a nezávisle spracovávať vstupy. V skutočnosti sa teraz rôzne časti dendritu považujú za nezávislé výpočtové kompartmenty. Napríklad bunka môže chcieť selektívne posilniť jednu synapsiu alebo všetky synapsie na jednej dendritickej vetve. Fyzickou izoláciou týchto synapsií v malých dendritických štruktúrach je jednoduchšie vykonať tieto cielené zmeny bez nežiaduceho „presluchu“ na iných synapsiách alebo bunkových aktivitách. Navyše sa prichádzajúce spojenia z rôznych oblastí často segregujú do oblastí dendritu (napr. V hippocampálnych pyramidálnych neurónoch CA1, kortikálnych prepojeniach s najvzdialenejšou časťou dendritu, vnútorných hippocampálnych spojeniach s časťou dendritu bližšie k soma).

Keď má bunka veľký dendrit (niektoré neuróny nemajú žiadne dendrity), je užitočné uvažovať o axodendritických synapsiách ako o normálnych vstupoch, ktoré prispievajú k jemnozrnnému výpočtu a axosomatické a axoaxónové synapsie ako o globálnejších bránach. Tieto posledné typy využívajú svoju polohu na skratovanie "normálneho" výpočtu v dendritoch. Inhibičná axosomatická synapsia napríklad zníži účinok všetky dendritické vstupy pri aktivácii.


Neurobiologický dôsledok predchádzania alebo pasenia sa

Pristionchus môže sa živiť inými červami, ak je baktérií málo. Tu C. elegans je korisťou. Kredit: MPI pre vývojovú biológiu

Vedci zo skupiny Ralfa Sommera z Inštitútu Maxa Plancka pre vývojovú biológiu v nemeckom Tuebingene prvýkrát dokázali identifikovať neurónové koreláty správania porovnaním máp synaptickej konektivity alebo „konektómov“ medzi dvoma druhmi s rôznymi správanie. Porovnávali hltanový nervový systém dvoch nematód, kŕmenie baktériami Caenorhabditis elegans a dravec/všežravec Pristionchus pacificus a našli veľké rozdiely v tom, ako sú neuróny "prepojené" dohromady.

Dlhodobou otázkou v neurobiológii je, ako sa určité správanie odráža vo vzorci spojení medzi neurónmi. Odpoveď na túto otázku si vyžaduje komparatívny prístup, ktorý sa ukázal ako nemožný aj v pomerne malom organizme, akým je nematóda, kvôli technickým obmedzeniam pri príprave a analýze extrémne veľkých súborov údajov. Dan Bumbarger a jeho kolegovia si vybrali hltanový nervový systém C. elegans a P. pacificus, ktoré pozostávajú len z 20 neurónov a vykazujú vysoký stupeň nezávislosti od nervového systému tela. Týchto 20 neurónov reguluje kontrakciu svalov hltana, ktoré sú zodpovedné za príjem potravy a jej spracovanie pred trávením v čreve.

Bumbarger pripravil ultratenké časti po dvoch Pristionchus červami a porovnali počet a umiestnenie synapsií v nervovom systéme hltana s existujúcimi C. elegans údajov. Napriek malým rozmerom háďatka trvalo generovanie a analýza údajov tri roky: Každá zo 150 mikrometrových dlhých oblastí hltana poskytla viac ako 3000 sekcií, ktoré bolo potrebné jednotlivo zobraziť a analyzovať pod elektrónovým mikroskopom.

Prvý výsledok tejto rozsiahlej štúdie prekvapil: „Vďaka svojmu tvaru a polohe každého z 20 neurónov v Pristionchus pacificus by mohol byť korelovaný s presným ekvivalentom v Caenorhabditis elegans“ vysvetľuje vedec. „Je to o to prekvapujúcejšie, že evolučná vzdialenosť medzi týmito dvoma druhmi červov je viac ako 200 miliónov rokov a výrazne sa líšia v správaní potravy a v anatómii ich ústnych častí.“ C. elegans živí sa výlučne baktériami, P. pacificus je schopný zmeniť svoje správanie na korisť ostatných červov, ak je málo bakteriálnej potravy.

Tieto rozdiely sa odrážajú v počte a polohe neuronálnych synapsií. Zatiaľ čo v C. elegans len 9 z 20 nervových buniek sú motorické neuróny, ktoré primárne aktivujú svalové bunky, počet je až 19 v P. pacificus iba jeden neurón funguje výlučne ako interneurón, ktorý vytvára spojenia medzi nervovými bunkami. „To naznačuje podstatné rozdiely v toku informácií,“ hovorí Ralf Sommer. Je zrejmé, že regulácia pohybov je v P. pacificus - nález, ktorý dokonale koreluje s dravým kŕmením červa.

Pomocou čiastočne novo vyvinutých analytických metód vedci v Tuebingene porovnávali aj relevantnosť jednotlivých neurónov a synapsií pre celú sieť. Ukázalo sa, že dva neuróny v prednej časti P. pacificus hltan výrazne získal na dôležitosti: Sú to motorické neuróny regulujúce svalové bunky, ktoré riadia pohyb častí úst, najvýraznejšie pohyb zubov, ktoré sa nenachádzajú v C. elegans. „Časti úst sú obzvlášť aktívne počas dravého útoku, ale nie pri kŕmení baktériami,“ vysvetľuje Sommer. V C. elegans, tieto dva neuróny fungujú výlučne ako interneuróny. Výrazné rozdiely sú aj v zadnej časti hltana. Toto je kde C. elegans má špecializovaný svalový „mlynček“ na drvenie baktérií, ich jediný zdroj potravy. V P. Pacificus, ktorá nemá mlynček, niektoré svalové bunky stratili synaptické spojenie s neurónmi.

„Vzory synaptických spojení dokonale odrážajú zásadné rozdiely v správaní pri kŕmení P. pacificus a C. elegans", Uzatvára Ralf Sommer. Takýto jasný výsledok nie je to, čo nevyhnutne očakával. Predchádzajúce štúdie v oveľa jednoduchších nervových obvodoch - ako v morskom slimákovi Aplysia - naznačili, že zmeny v správaní sa nemusia zhodovať so zmenami v Počet a umiestnenie synapsií Rozdiely vo fyziologických vlastnostiach neurónov alebo v ich modulácii neurotransmitermi môžu byť dostatočné na uskutočnenie zmien v správaní.


Druhovo špecifické vzorce správania korelujú s rozdielmi v synaptických spojeniach medzi homológnymi mechanosenzorickými neurónmi

Charakterizovali sme behaviorálne reakcie dvoch druhov pijavíc, Hirudo verbana a Erpobdella obscura, na mechanickú stimuláciu pokožky a skúmali sme interakcie medzi tlakovými mechanosenzorickými neurónmi (P bunkami), ktoré inervujú pokožku. Aby sme kvantifikovali behaviorálne reakcie, stimulovali sme neporušené pijavice a izolované prípravky na stene tela z týchto dvoch druhov. V reakcii na mechanickú stimuláciu Hirudo vykazoval lokálne ohybové správanie, pri ktorom sa stena tela skrátila iba na strane stimulácie. Erpobdella sa naopak v reakcii na dotyk stiahla na obe strany tela. Aby sme preskúmali neurónový základ tohto rozdielu v správaní, študovali sme interakcie medzi P bunkami. Každý stredný ganglion má štyri P bunky, každá bunka inervuje iný kvadrant steny tela. V súlade s lokálnym ohýbaním aktivácia akejkoľvek jednej P bunky v Hirudo vyvolala polysynaptické inhibičné potenciály v ostatných P bunkách. Na rozdiel od toho P bunky v Erpobdella mali excitačné polysynaptické spojenia, čo je v súlade s kontrakciou celého segmentu pozorovanou u tohto druhu. Okrem toho aktivácia jednotlivých P buniek spôsobila asymetrické kontrakcie steny tela u Hiruda a symetrické kontrakcie steny tela u Erpobdella. Tieto výsledky naznačujú, že rôzne behaviorálne reakcie v Erpobdella a Hirudo sú čiastočne sprostredkované interakciami medzi mechanosenzorickými bunkami.

Figúrky

Behaviorálne reakcie na vlaky ...

Behaviorálne reakcie na vlaky slabých elektrických šokov, ktoré napodobňujú ľahké až stredné úrovne ...

Reakcie na stimuláciu pokožky v...

Reakcie na stimuláciu pokožky v Hirudo a Erpobdella . Pripínali sme päť segmentov ...

Porovnanie P buniek v Hirudo k domnelým homológom P buniek v ...

Reakcie T, P a N buniek na mechanickú stimuláciu tela...

P V. na P V. spojenia v Hirudo a Erpobdella . a Reprezentatívny…

Pripojenia P na P v Hirudo a Erpobdella midbody ganglia. a Reprezentatívne stopy…

Synaptické prepojenie medzi P bunkami…

Synaptická konektivita medzi P bunkami v Hirudo a Erpobdella . a Záznamy z…

Pohyb steny tela v dôsledku ...

Pohyb telesnej steny v dôsledku intracelulárnej stimulácie P bunky. a Top…


NMJ-morph odhaľuje hlavné zložky synaptickej morfológie ovplyvňujúce štruktúru a funkčné vzťahy na neuromuskulárnom spojení

Schopnosť vytvárať synapsie je jednou zo základných vlastností, ktoré vyžaduje nervový systém cicavcov na vytváranie sieťového pripojenia. Štrukturálna a funkčná rozmanitosť medzi synaptickými populáciami je kľúčovým znakom rozmanitosti siete, a napriek tomu vieme o morfologických princípoch, ktoré riadia variabilitu veľkosti, tvaru a sily synapsií, pomerne málo. Použitím neuromuskulárneho spojenia myši (NMJ) ako experimentálne prístupnej modelovej synapsie informujeme o vývoji robustnej, štandardizovanej metodiky na uľahčenie porovnávacej morfometrickej analýzy synapsií („NMJ-morph“). Použili sme NMJ-morph na generovanie základných morfologických referenčných údajov pre 21 oddelených pre- a post-synaptických premenných z 2 160 jednotlivých NMJ patriacich k deviatim anatomicky odlišným populáciám synapsií, čo odhaľuje systematické rozdiely v morfológii NMJ medzi definovanými synaptickými populáciami. Analýza hlavných zložiek odhalila, že celková veľkosť NMJ a stupeň synaptickej fragmentácie spolu s priemerom predsynaptického axónu boli najdôležitejšími parametrami pri definovaní synaptickej morfológie. „Priemerná“ synaptická morfológia bola pozoruhodne zachovaná medzi porovnateľnými synapsami z ľavej a pravej strany tela. Systematické rozdiely v synaptickej morfológii predpovedali zodpovedajúce rozdiely v synaptickej funkcii, ktoré boli podporené fyziologickými záznamami, čo potvrdzuje silný vzťah medzi synaptickou veľkosťou a silou.

1. Pozadie

Vytvorenie a udržanie sieťovej konektivity prostredníctvom vytvorenia vhodných synaptických spojení je základným determinantom funkcie v nervovom systéme cicavcov [1,2]. Akýkoľvek pokus o pochopenie komplexnej štruktúry a funkcie nervového systému si preto vyžaduje presné a podrobné mapovanie synaptickej konektivity („connectomics“), aby sa odhalili základné charakteristiky nervových okruhov, ktoré by inak boli nedostupné [3,4]. Kritická úloha, ktorú zohrávajú synapsie pri udržiavaní sieťovej funkcie, je ďalej ilustrovaná pozorovaním katastrofálnych dôsledkov synaptickej dysfunkcie a straty pri neurodegeneratívnych stavoch, ako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a ochorenie motorických neurónov [5–7].

Štrukturálna a funkčná rozmanitosť medzi synaptickými populáciami je jedným z kľúčových charakteristických znakov rozmanitosti siete. Vieme však pomerne málo o preklenujúcich morfologických princípoch, ktoré riadia variabilitu veľkosti, tvaru a sily synapsií. Napríklad, hoci vplyv jednotlivých genetických a environmentálnych faktorov na synapsie bol skúmaný v mnohých štúdiách [8–10], rozsah, v akom sa tieto vplyvy kombinujú pri kontrole synaptickej morfológie, zostáva nejasný a hierarchická povaha týchto ovplyvňujúcich faktorov zostáva byť zriadený. Preto je potrebné lepšie porozumieť týmto princípom, aby bolo možné plne oceniť identitu a úlohu sieťovej konektivity v nervovom systéme pri zdraví a chorobe.

Vzhľadom na zložitosť synaptickej konektivity, ktorá existuje v centrálnom nervovom systéme cicavcov (CNS) [2], je ťažké získať presné trojrozmerné morfologické merania z dostatočného počtu identifikovaných synapsií na vykonanie porovnávacích morfometrických štúdií. Naproti tomu neuromuskulárna križovatka (NMJ), synapsia vytvorená medzi dolným motorickým neurónom v periférnom nervovom systéme a jeho cieľovým vláknom kostrového svalstva, ponúka experimentálne prístupný model, ktorý je vhodný na štúdie synaptickej morfológie a konektivity a z ktorého vyplývajú poznatky. už skôr boli získané z hľadiska synaptickej biológie v celom nervovom systéme. Okrem toho, rovnako ako synapsie v CNS, NMJ predstavuje miesto primárnej patológie pri mnohých neurologických stavoch, vrátane myasténie gravis a súvisiacich porúch [12,13], vrodených myastenických syndrómov [14] a chorôb motorických neurónov, ako sú amyotrofické laterálne skleróza (ALS) a spinálna svalová atrofia (SMA) [15].

Základná bunková štruktúra synapsií na NMJ je dobre zavedená [16] a jej štruktúra je evidentne prispôsobená tak, aby umožňovala robustnú a spoľahlivú neurotransmisiu s vysokým „bezpečnostným faktorom“ [17]. Historicky najskoršie morfologické popisy NMJ používali zlaté a strieborné prípravky na demonštráciu doštičkových (en plaque) [18] a hroznových (en grappe) [19] nervových zakončení u rôznych druhov stavovcov. S príchodom farbenia cholínesterázou v 50. rokoch 20. storočia (vyvinuté Koelle & Friedenwald [20]) bola možná vizualizácia presynaptických aj postsynaptických zložiek NMJ. Následné štúdie inervácie svalov u rôznych druhov cicavcov využili výhody týchto kombinovaných techník [21], čo viedlo k širokej škále kvalitatívnych metód kategorizácie nervových zakončení [22] a motorických koncových platničiek [23]. Skenovacia elektrónová mikroskopia potvrdila, že toto bunkové usporiadanie je zachované naprieč NMJ u tak rôznorodých druhov, ako sú žaba, zebrička a čínsky škrečok, aj keď s podstatnými rozdielmi v celkovej morfológii [24]. Nedávno bola základná bunková triáda terminálu motorického nervu, vlákna kostrového svalstva a koncových Schwannových buniek rozšírená o domnelý štvrtý typ buniek: „kranocyty“ [25] (pomenované kvôli ich anatomickému vzťahu k NMJ, kde sa nachádzajú 'pokrývajúce' vyššie uvedené štruktúry).

S príchodom imunofluorescenčných techník a konfokálnej mikroskopie v spojení so širokou dostupnosťou počítačového softvéru sa možnosti na vykonanie robustnej kvantitatívnej morfometrickej analýzy NMJ výrazne zlepšili. Zatiaľ sa však neobjavila žiadna štandardná metodika pre komparatívnu morfometrickú analýzu NMJ, čo bráni pokusom o objavenie alebo testovanie hypotéz týkajúcich sa základných morfologických princípov, ktoré môžu regulovať alebo ovplyvňovať vzťahy synaptickej štruktúry a funkcie. V tejto štúdii informujeme o vývoji a testovaní novej platformy I mage J založenej na štandardizovanej morfometrickej analýze NMJ („NMJ-morph“). Aplikáciou NMJ-morfu na myší NMJ sme vygenerovali základné morfologické referenčné údaje pre 21 oddelených pre- a post-synaptických premenných z 2 160 individuálnych NMJ patriacich do deviatich anatomicky odlišných populácií synapsií. Napriek značnej heterogenite NMJ ukazujeme, ako používanie NMJ-morfu v spojení so štatistickou analýzou odhaľuje systematické rozdiely v morfológii NMJ medzi definovanými synaptickými populáciami v kostrovom svale a že citlivosť prístupu je dostatočná na rozlíšenie medzi jemne odlišnými populácie NMJ v súlade s predpovedanými fyziologickými záznamami.

2. Materiál a metódy

2.1. Imunohistochémia svalovej disekcie a neuromuskulárneho spojenia

Dvanásť myší (šesť samcov, šesť samíc) bolo náhodne vybraných z jedného vrhu myší divokého typu CD1 vo veku šiestich týždňov.Po eutanázii predávkovaním inhalovaným izofluránom bola každá myš odvážená a vybrané svaly z každej strany boli vypreparované do 30 minút post-mortem. Svaly sa okamžite fixovali v 4% paraformaldehyde počas 30 minút, potom sa premyli v 1% fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Potom sa odstránilo všetko zostávajúce spojivové tkanivo. Kraniálne a lumbálne svaly určené na celú montáž boli ihneď pripravené na imunohistochémiu (pozri nižšie). Triceps a quadriceps boli kryoochránené ponorením do 30% sacharózy cez noc, 100 µm rezy boli potom získané na mraziacom mikrotóme Thermo Scientific Microm HM 450/KS 34.

Neuromuskulárne spojenia boli imunohistochemicky označené pomocou štandardného laboratórneho protokolu na vizualizáciu presynaptických 2H3/SV2 a postsynaptických AChR [26]. Svalové prípravky boli umiestnené do nasledujúcej sekvencie roztokov (pripravené v 1% PBS, pokiaľ nie je uvedené inak, protilátky a ich koncentrácie sú uvedené nižšie): a-bungarotoxín (BTX) na 30 minút na označenie postsynaptických AChR 4% Triton X na 90 minút min. blokujúci roztok 4% hovädzieho sérového albumínu (BSA) a 2% Tritonu X počas 30 minút, primárne protilátky (pripravené v blokovacom roztoku) počas 72 hodín pri 4 ° C 1% PBS počas 80 minút 4% BSA počas 30 minút sekundárne protilátky (vytvorené v 1% PBS) počas 150 minút 1% PBS počas 80 minút. Nakoniec boli svalové prípravky namontované na sklenené podložné sklíčka v Mowiole a skladované pri -20 ° C. Vo všetkých fázach boli vzorky pred zobrazovaním chránené pred nadmerným vystavením svetlu.

2.2. Protilátky

Primárne protilátky: 1: 50 myšacích anti-SV2 (synaptických vezikúl) IgG, 1: 50 myších anti-2H3 (neurofilament 165) IgG (obaja z Developmental Studies Hybridoma Bank). Sekundárne protilátky: 1 : 100 Cy3 AffiniPure oslí anti-myší IgG (Jackson ImmunoResearch Labs). BTX: 1 : 500 α-bungarotoxín CF488A (Biotium).

2.3. Konfokálna mikroskopia

Obrázky boli získané na konfokálnom mikroskope Zeiss LSM 710. Konfokálne nastavenia boli optimalizované tak, aby sa dosiahol najlepší kompromis medzi kvalitou obrazu a rýchlosťou snímania: 8 bitová hĺbka, veľkosť rámu 512 × 512, zväčšenie 63 ×, priblíženie × 2 a interval z-stacku 1 µm, so sekvenčným získavaním obrazu na minimalizáciu prekrvenia ( červený kanál - excitácia 543 nm, zber 565–615 nm, zelený kanál - excitácia 488 nm, zber 500–550 nm). Všetky analýzy obrazu sa uskutočňovali na projekciách maximálnej intenzity z-zásobníkov pomocou softvéru I mage J a doplnku BinaryConnectivity.

2.4. NMJ-morf

Tu vyvinutý pracovný postup („NMJ-morph“) je nezávislý na platforme a je možné ho použiť v operačných systémoch Windows alebo Mac. Najnovšia verzia programu I mage J a doplnku BinaryConnectivity sú voľne dostupné vo verejnom vlastníctve a je možné ich stiahnuť na adrese http://imagej.nih.gov/ij a http://www.mecourse.com/landinig/software/ software.html (v časti „Morfologické operátory pre ImageJ“). Online podporný materiál obsahuje komplexnú používateľskú príručku NMJ-morph (ktorá obsahuje podrobného sprievodcu vykonaním každého merania). Tento súbor spolu so šablónami tabuliek a vzorovou bankou obrázkov na použitie v školení a štandardizácii sú voľne dostupné na stiahnutie z http://dx.doi.org/10.7488/ds/1490.

NMJ-morph je navrhnutý tak, aby uľahčoval kvantitatívnu analýzu pre- aj post-synaptických štruktúr na NMJ, založenú na štandardizovanom a opakovateľnom pracovnom toku vhodnom na použitie na konfokálnych projekciách z-stackov jednotlivých NMJ. Ak konfokálna mikroskopia buď nie je možná (napr. Pri súčasnom zaznamenávaní štruktúry a funkcie z rovnakých NMJ), alebo nie je pre niektorých pracovníkov k dispozícii, na analýzu morfologickej NMJ možno použiť podobný štandardizovaný prístup využívajúci fluorescenčnú mikroskopiu so širokým poľom (údaje nie sú uvedené), ale pre optimálne výsledky sa odporúčajú konfokálne z-stack projekcie. Tabuľka 1 uvádza úplný súbor 21 morfologických premenných, ktoré sú zahrnuté v pracovnom toku NMJ-morph. V našich rukách boli vyškolení používatelia schopní získať komplexné morfometrické údaje z viac ako 30 NMJ za hodinu.

Tabuľka 1. Morfologické premenné a východiskové údaje. V protokole NMJ-morph je celkovo zahrnutých 21 morfologických premenných. Maximálne a minimálne hodnoty pre každú premennú NMJ zodpovedajú priemerným hodnotám na sval (240 NMJ) pre údaje uvedené na obrázku 4 a v elektronickom doplnkovom materiáli, obrázok S4. Násobný rozdiel medzi maximálnymi a minimálnymi hodnotami bol významný pre všetky premenné okrem priemerného počtu vstupov axónov (****p & lt 0,0001, ***p & lt 0,001, **p < 0,01, *p <0,05).

Konfokálne mikrografy imunologicky označených myších NMJ boli získané z prípravkov celého svalu alebo zo 100 µm rezov (pre väčšie svaly) s použitím štandardných prístupov na zachytávanie obrazu (pozri vyššie). Pre presnú analýzu každý obrázok zachytil jeden čelný NMJ s krátkou dĺžkou jeho terminálneho axónu v strede zorného poľa (obrázok 1). NMJ, ktoré boli čiastočne šikmé k zornému poľu, boli zahrnuté len vtedy, ak šikmá časť tvorila menej ako cca. 10% z celkovej plochy.

Obrázok 1. Morfologická heterogenita myších NMJ. Príklady NMJ z troch oblastí tela: hlava a krk (interscutularis sval, IS), predná končatina (triceps brachii, TRI) a zadná končatina (4. hlboká lumbrická, HL4). Zobrazenia NMJ vykazujú výrazné rozdiely vo veľkosti a celkovej morfológii bez zjavného vzťahu k oblasti tela. Mierka = 10 µm.

Surové konfokálne obrázky boli potom prevedené na binárne náprotivky. Na nastavenie prahu sa súčasne otvorili dve kópie projekcie maximálnej intenzity v obrázku J, prvý sa použil ako referencia, pričom sa vybral prah pre druhý. Myslím si, že podľa našich skúseností J je zabudovaných niekoľko rôznych metód prahovania, „HuangMetóda [27] poskytla najpresnejšiu binárnu reprezentáciu pôvodného obrazu u 79 % NMJ (v počiatočnej testovacej sérii 600 NMJ analyzovaných 2 nezávislými výskumníkmi – pozri Výsledky a elektronický doplnkový materiál, obrázok S1). Pokiaľ ide o zostávajúce NMJ, „HuangMetóda v týchto prípadoch neposkytla presné binárne obrázky, prah bol buď nastavený ručne (pre 18% NMJ), alebo v najmenšom počte prípadov (3%) sme zistili, že „Jen‘Metóda [28] bude ďalším najužitočnejším automatizovaným prahom.

Aby sme zaistili najvyšší stupeň reprodukovateľnosti medzi množinami údajov (alebo pre tých používateľov, ktorí majú menšie skúsenosti s NMJ-morfom), odporúčame, aby boli všetky obrázky, u ktorých nie je možné presne stanoviť prahovú hodnotu, pomocou príkazu „Huang“ metóda by sa mala z analýzy na začiatku vyradiť. Avšak pre tých, ktorí sú oboznámení s NMJ-morfom, môže byť výnos súboru údajov zvýšený buď pomocou manuálneho prahovania, alebo „Yen„(ako je uvedené vyššie) bez toho, aby sme ohrozili kvalitu údajov v počiatočných testovacích sériách 600 NMJ, zistili sme, že tieto malé rozdiely v prahovaní závislé od používateľa významne neovplyvnili výsledné analýzy ani reprodukovateľnosť údajov (pozri obrázok 3 a Výsledky).

V situáciách, keď je pomer signálu k šumu na snímkach nižší ako pomery použité v tejto štúdii (napr. pri patologických NMJ, počas vývoja alebo v situáciách, keď sa štruktúra a funkcia NMJ študuje súčasne a kde nemusí byť intenzívne označovanie v súlade s normálnou funkciou), je pravdepodobné, že sa bude viac spoliehať na manuálne stanovenie prahových hodnôt a väčšia variabilita medzi nezávislými vyšetrovateľmi bude nevyhnutná. Tieto zložitejšie okolnosti tiež zdôrazňujú dôležitosť prahovania jednej kópie obrázka s odkazom na originál, aby sa zabezpečilo, že binárny náprotivok bude presnou reprezentáciou pôvodného obrázka.

Jeden posledný bod, ktorý by sme chceli zdôrazniť v súvislosti s používaním NMJ-morfu, sa týka absolútny presnosť získaných meraní. Načrtnutý pracovný tok je zároveň robustný a opakovateľný pretože používa najpresnejšie binárne obrázky s prahom (či už automatické alebo manuálne vybrané) absolútny meranie jednotlivých premenných (napr. plocha klastra AChR) sa pravdepodobne dosiahne iba manuálnymi meraniami vykonanými na origináli, bezprahové„konfokálne obrázky, pomocou ktorých sa jednotlivec môže jemne rozhodovať o presných hraniciach každého NMJ. Je to nevyhnutne časovo oveľa náročnejší prístup v porovnaní s tým, ktorý je načrtnutý, a tiež podlieha variabilite medzi pozorovateľmi, ktorú sme sa snažili znížiť, ale pre skupiny, ktoré sa zaoberajú menšími súbormi údajov, to môže byť preferovaná možnosť, ak povolenia.

Celkovo sme do platformy NMJ-morph začlenili 21 jednotlivých morfologických premenných rozdelených na „jadrové premenné“, „odvodené premenné“ a „pridružené nervové a svalové premenné“ (obrázok 2 a tabuľka 1). Základné, samovysvetľujúce rozmery, ako je plocha a obvod, sa merali pomocou štandardných funkcií I mage J (obrázok 2) (podrobné online pokyny nájdete v online používateľskej príručke NMJ-morph, ktorá je k dispozícii na: http: //dx.doi. org/10.7488/ds/1490).

Obrázok 2. Prehľad platformy NMJ-morph. Vývojový diagram demonštrujúci sekvenciu analýz pre každé NMJ. Pracovný tok obsahuje 21 morfologických premenných: 11 „základných premenných“ je uvedených červeným písmom, 7 „odvodených premenných“ modrou farbou a 3 „súvisiace nervové a svalové premenné“ zelenou farbou. Špecifické operácie v rámci NMJ-morfu sú uvedené kurzívou.

Pokiaľ ide o zložitejší vzorec vetvenia nervových zakončení, predchádzajúce štúdie často používali zložitú terminológiu na definovanie vetiev (napr. proximálne a distálne segmenty [29], rády vetvenia [30]), pričom žiadna z nich nie je vhodná na jednoduché alebo široké použitie. . Vyhli sme sa takej nejednoznačnosti pri definovaní vetiev pomocou funkcie „skeletonizácia“ v programe I mage J na vytvorenie „kostry“ nervových zakončení hrubej ako jeden pixel. Počet koncových vetiev [31] a počet bodov vetiev sa potom vypočítal automaticky pomocou doplnku I mage J: BinaryConnectivity [32] (elektronický doplnkový materiál, obrázok S2). Táto metóda bola prvýkrát popísaná vo vzťahu k rozvetvenému vzoru koncovej platne [33], ale predtým nebola aplikovaná na analýzu pre-synaptických nervových zakončení.

Index „komplexnosti“ bol vyvinutý tak, aby kombinoval jednotlivé premenné vetvy do jedného predsynaptického indexu (podobne ako postsynaptické indexy „kompaktnosti“ a „fragmentácie“ pozri obrázok 2). Predchádzajúce metódy pre tento typ analýzy sa líšili od tých, ktoré používajú relatívne komplexnú nomenklatúru (napr. Priemerná vzdialenosť medzi bodmi pôvodu sekundárnych vetiev na primárnej vetve [30]), až po jednoduchšie metódy (napr. Dĺžka vetiev × počet bodov vetiev/100 [29]). Na vygenerovanie pohodlnejšieho numerického indexu sme použili nasledujúci vzorec s logaritmickou deriváciou:

Základné rozmery postsynaptickej motorovej koncovej platne sa opäť merali pomocou štandardných funkcií I mage J (obrázok 2, kde nájdete podrobné pokyny). Zložitejšie morfologické premenné postsynaptickej motorickej koncovej platne boli stanovené pomocou niekoľkých „odvodených“ premenných (obrázok 2 a tabuľka 1). „Kompaktnosť“ AChR na koncovej doske bola definovaná nasledovne:

Tento index bol v predchádzajúcich štúdiách označený ako „disperzia“ [33,34], ale uprednostňujeme termín „kompaktnosť“ ako presnejší deskriptor množstva receptorov v danej oblasti. Okrem toho pomáha jasne rozlišovať medzi touto premennou a „fragmentáciou“ (pozri nižšie), ktorá opisuje odlišnú fyzikálnu charakteristiku koncovej dosky.

NMJ-morf sa tiež použil na kvantifikáciu počtu diskrétnych klastrov AChR obsahujúcich motorickú koncovú platňu. Napriek tomu, že predchádzajúce štúdie uvádzali jednoduché počítanie klastrov receptorov AChR [35], naše skúsenosti naznačovali, že v praxi to môže byť náročné, pretože klastre ležiace v tesnej blízkosti sa často javia ako jeden. Tento problém sme prekonali využitím funkcie „segmentovaných častíc“ v programe I mage J, ktorá rozdelila koncovú dosku do úplne diskrétnych zhlukov, ktoré bolo možné ľahko spočítať (elektronický doplnkový materiál, obrázok S3). Táto funkcia je typom „segmentácie povodia“ pre obrázky v odtieňoch sivej, ktorá poskytuje prostriedky na automatické oddeľovanie častíc, ktoré sa dotýkajú [36]. Okrem toho sa vypočítal index „fragmentácie“, pričom pevná doštička podobná plaku má index nula (0) a vysoko fragmentovaná koncová doštička má index, ktorý smeruje k číselnej hodnote jedna (1):

Zostávajúce morfologické premenné merané pomocou NMJ-morfu („prekrývanie“ a „oblasť synaptického kontaktu“) poskytujú podrobnosti o morfologickom „zhode“ pre- a post-synaptického aparátu. „Prekrytie“ opisuje stupeň zhody medzi pre- a postsynaptickými prvkami NMJ – rozsah, v akom nervový terminál prekrýva zhluky AChR. Čiastočne obsadené alebo prázdne koncové platne sú charakteristickým znakom odumierajúcej patológie (napr. ALS a SMA) a Wallerovej degenerácie [15] a predchádzajúce štúdie zaradili NMJ pri inšpekcii do rôznych kategórií, od prázdnych po úplne obsadené, semikvantitatívnym spôsobom. [37]. Odvodený index „prekrývania“ nám umožnil vypočítať presnú „percentuálnu obsadenosť AChR“ pomocou metódy, ktorú prvýkrát popísal Prakash a kol. [30]:

Podobným spôsobom sme boli schopní pripísať presnú „oblasť synaptického kontaktu“ pre každý NMJ takto:

Merania priemeru svalového vlákna sa získali pomocou mikroskopu Olympus IX71/zostavy fotoaparátu Hamamatsu C4742-95. Prípravky z dráždených vlákien sa zobrazovali pri zväčšení × 20. Obrázky boli zachytené pomocou softvéru Openlab I mprovision a meranie priemeru svalových vlákien bolo uskutočnené ručne v programe I mage J. Na jeden sval bolo zmeraných štyridsať jednotlivých vlákien (celkovo 2160 svalových vlákien pre kompletný súbor údajov).

2.5. Elektrofyziológia

Intracelulárne záznamy boli urobené zo vzdialenosti 100 µm NMJ na svalových vláknach v izolovaných IS a prípravkoch nervových svalov LAL kúpaných v fyziologickom fyziologickom roztoku pufrovanom HEPES (MPS, obsahujúceho 2 mM Ca 2+ a 1 mM Mg 2+) pri izbovej teplote ( 22–25 ° C), pomocou sklenených mikroelektród naplnených 4 M octanu draselného, ​​odpory 20–40 MΩ, ako bolo popísané vyššie [38–40]. Akčné potenciály svalov boli blokované predinkubovaním svalov v µ-konotoxíne GIIIB (Alomone, 2,5 µM v prevzdušnenom MPS) 20-30 minút pred prenosom a pripnutím prípravkov do záznamovej komory lemovanej Sylgardom namontovanej na pódiu zvislej zlúčeniny mikroskop (Zeiss Axioscop2 FS Plus) vybavený × 10– × 40 objektívmi namáčajúcimi vodu. Nervovo evokované svalové reakcie boli produkované sacou elektródou pripojenou k stimulátoru Digitimer DS2 s použitím časovaných impulzov s amplitúdou 1–10 V a trvaním 0,1–0,2 ms. Spontánne MEPP a nervovo vyvolané EPP boli zaznamenané zosilňovačom Axoclamp 2B a digitalizované prostredníctvom rozhrania Digidata 1322A a analyzované pomocou softvéru p C lamp 9.0 (všetky Axon Instruments/Molecular Devices) alebo W vo WCP (Strathclyde Electrophysiological Software) bežiacom na štandarde. PC. Na porovnanie svalov a vlákien boli amplitúdy EPP a MEPP opravené na štandardný pokojový potenciál -80 mV. Pre kvantálnu analýzu boli amplitúdy EPP korigované na nelineárne súčty podľa vzorca [41], V.′ = v/(1 − fv/E) použitie „f' faktor 0,8 a za predpokladu reverzného potenciálu pre AChR 0 mV. Kvantálny obsah sa potom vypočítal použitím priamej metódy vydelením korigovanej amplitúdy EPP strednou amplitúdou MEPP korigovanou na pokojový potenciál EPP.

2.6. Zber údajov a štatistická analýza

Všetky údaje boli exportované z I mage J a zoradené do jednej tabuľky navrhnutej v Microsoft E xcel (tabuľky šablón NMJ-morph sú voľne dostupné na stiahnutie z http://dx.doi.org/10.7488/ds/1490). V tabuľkách sa ručne skontrolovali numerické chyby po importe údajov z programu I mage J. Štatistické analýzy sa vykonali pomocou softvéru GraphPad Pism a SPSS. Jednotlivé štatistické metódy sú podrobne popísané v časti Výsledky a legendách obrázkov.

3. Výsledky

Na generovanie experimentálnych prípravkov NMJ vhodných na uskutočnenie porovnávacej morfometrickej analýzy sme použili imunohistochemicky označené svalové prípravky z mladých dospelých (približne dvojmesačných) myší divokého typu. NMJ boli značené pomocou protilátok proti proteínom neurofilamenta (2H3) a synaptických vezikúl (SV2) na odhalenie presynaptickej neuronálnej architektúry a α-bungarotoxínu na odhalenie postsynaptických motorických koncových platničiek [26,42–45] (obrázok 1). Počiatočné kvalitatívne porovnania NMJ z troch rôznych svalov tej istej myši - interscutularis (IS) triceps brachii (TRI), 4. hlboká lumbálna zo zadnej končatiny (HL4) - odhalili nápadne odlišné synaptické morfológie medzi tromi súbormi synapsií, s výraznými rozdielmi v veľkosť, vzhľad a zložitosť pre- aj post-synaptických štruktúr (obrázok 1).

3.1. Vývoj NMJ-morfu ako štandardizovanej platformy na získavanie morfologických údajov

Na ďalšie skúmanie týchto variácií v morfológii NMJ a uľahčenie kvantitatívnych porovnaní a následných štatistických analýz sme vyvinuli NMJ-morph ako štandardizovaný pracovný tok, prostredníctvom ktorého by sme mohli získať morfologické referenčné údaje pre 21 oddelených pre- a postsynaptických premenných (pozri Materiál a metódy ).

Spočiatku, aby sa určila spoľahlivosť NMJ-morfy a identifikoval sa stupeň akejkoľvek variability medzi užívateľmi, sériu 600 NMJ analyzovali dvaja nezávislí výskumníci, ktorí vykonali merania na dvoch rôznych pracovných staniciach (obrázok 3). V tomto cvičení vyšetrovateľ 1 vybral Huang prahová hodnota pre 83% obrázkov (14% manuálne, 3% Yen), pričom vyšetrovateľ 2 vybral Huang pre 74% (22% manuálne, 4% Yen) celkovo dvaja výskumníci zvolili rovnaký prah (buď Huang, Yen alebo manuálne) pre 77% obrázkov. Napriek týmto variáciám vo výbere prahu, spolu s manuálnym charakterom niektorých meraní v rámci NMJ-morph, zhoda medzi týmito dvoma vyšetrovateľmi bola silná vo všetkých premenných NMJ: korelačné koeficienty (r) sa pohyboval od 0,844 (priemer axónu) do 0,997 (oblasť AChR), s p & lt 0,0001 pre všetky premenné. Pretože účinok variability medzi pozorovateľmi, ktorý je možné pripísať tejto kombinácii prahových hodnôt a manuálneho merania, je preto zjavne malý, dospeli sme k záveru, že načrtnutý pracovný tok bol dostatočne robustný na to, aby bol použitý pre zvyšok štúdie (a odporúčané na použitie vo všeobecnosti). Táto počiatočná analýza bola tiež použitá na identifikáciu adekvátnych veľkostí vzoriek potrebných na presné vyhodnotenie synaptickej morfológie v NMJ-morfe, pričom na získanie robustných údajov je potrebná veľkosť vzorky viac ako 30 NMJ na sval (obrázok 3).Na základe tohto pozorovania sa všetky následné analýzy uskutočnili na vzorke s veľkosťou 40 NMJ na sval.

Obrázok 3. Spoľahlivosť NMJ-morfy. Dvaja nezávislí vyšetrovatelia použili NMJ-morph na analýzu série 600 NMJ z 1. hlbokého bedrového kĺbu zadnej končatiny (6 myší: 3 samce, 3 samice, 50 NMJ z bedrovej oblasti na každej strane). (a) Medzi dvoma vyšetrovateľmi bola pre všetky premenné preukázaná silná zhoda. Scatterplots demonštrujú rozsah v korelácii, od najslabšieho (priemer axónu) po najsilnejší (oblasť AChR). Pre všetky premenné bola korelácia medzi pozorovateľmi vysoká ((r ≥ 0,844) a štatisticky významné (p < 0,0001). (b) Dôležitosť primeraného odberu vzoriek pri uvádzaní priemerných hodnôt pre premenné NMJ. Grafy zodpovedajú premenným znázorneným na (a) a ukazujú údaje získané z jedného svalu (50 NMJ). Zvyšovanie veľkosti vzorky má za následok postupné ustálenie priemeru na tomto základe, na zaistenie presnosti uvádzaných priemerných hodnôt odporúčame vzorku 40 NMJ na sval.

Počas počiatočného vývoja a testovania NMJ-morfu, ktorý používal samce aj samice myší z vrhu, neboli zaznamenané žiadne zjavné rozdiely pripísateľné sexuálnemu dimorfizmu (údaje nie sú uvedené). Všetky následné analýzy boli preto uskutočnené na jednom pohlaví (ľubovoľný výber žien), a to z dôvodu konzistentnosti prístupu a zjednodušenia (napriek tomu významných) problémov, ktoré spôsobuje veľkoobjemové spracovanie údajov.

3.2. Východiskové morfologické údaje pre neuromuskulárne spojenie myši

Po zistení, že NMJ-morf je možné použiť na generovanie robustných morfologických údajov, sme ďalej použili tento prístup na získanie základných referenčných údajov pre NMJ z radu svalov získaných z viacerých myší pochádzajúcich z jedného vrhu. Svaly boli vybrané tak, aby zahŕňali širokú škálu kritérií, pričom sa predpokladalo, že akékoľvek rozdiely v morfológii NMJ môžu priamo súvisieť s týmito faktormi. Tieto kritériá zahŕňali pokrytie všetkých oblastí tela, proximálnu/distálnu polohu a funkčnú homológiu v končatinách a rôzne nervové zásoby, hrubú architektúru a funkciu. Svaly tiež museli byť v rutinnom biologickom použití. Na účely tejto štúdie bola celá väčšina kvadricepsov/tricepsov (každý s jedným nervovým zásobením) považovaná za jeden diskrétny „sval“, pričom boli vybrané jednotlivé lumbricals prednej a zadnej končatiny (každý s iným nervom dodávka) sa považovali za oddelené „svaly“. Výbery z končatín teda tvorili šesť samostatných svalov (s ich šiestimi rôznymi nervovými zásobami), a nie dve funkčne podobné skupiny (quadriceps/triceps a lumbricals). Celkovo bolo vybratých deväť anatomicky odlišných svalov z troch rôznych oblastí tela (lebečné, predné a zadné) (obrázok 4).

Obrázok 4. Základné morfologické údaje pre myšací NMJ. Stĺpcové grafy demonštrujúce variácie v morfológii NMJ medzi rôznymi svalmi bez jasného vzťahu k oblasti tela. (a) Pre- a (b) sú ukázané postsynaptické príklady. Stĺpce zobrazujú priemer a štandardnú chybu priemeru (s.e.m.), vypočítanú zo združených údajov troch párov ľavého/pravého svalu (240 NMJ). Svaly sú zoradené podľa veľkosti a farebne odlíšené podľa oblasti tela (hlava a krk sú červené, predné končatiny sú žlté, zadné končatiny sú modré). Príklady NMJ poskytujú presnú vizuálnu reprezentáciu priemerných hodnôt znázornených na stĺpcovom grafe (s presnosťou ± 5% priemeru) a zodpovedajú maximálnym, mediánovým a minimálnym hodnotám. Mierka = 10 µm. Skratky: IS, interscutularis LAL-R, levator auris longus (rostrálne pásmo) LAL-C, levator auris longus (kaudálne pásmo) TRI, triceps brachii FL2, 2. hlboký lumbálny (predná končatina) FL4, 4. hlboký bedrový (predok) QUAD, kvadricepsy femoris HL1, 1. hlboká lumbrika (zadná končatina) HL4, 4. hlboká bedrová (zadná končatina).

V súlade s našimi počiatočnými kvalitatívnymi pozorovaniami (obrázok 1) kvantitatívne analýzy potvrdili výraznú heterogenitu v morfológii NMJ medzi rôznymi svalmi (tabuľka 1). Významné rozdiely boli zaznamenané v priemerných hodnotách v celom rozsahu pre- a postsynaptických premenných pre rôzne svaly (obrázok 4 a tabuľka 1 elektronický doplnkový materiál, obrázok S4). Maximálne a minimálne hodnoty, ako aj rozdiely v násobkoch zmeny medzi svalmi umiestnenými na najvyšších a najnižších hodnotách pre každú premennú, sú uvedené v tabuľke 1. Morfologická premenná s najväčším rozdielom medzi svalmi bola priemerná plocha klastrov AChR s násobná zmena 3,17 medzi svalom s najvyšším a najnižším umiestnením (tabuľka 1). Naproti tomu premenné vykazujúce najmenšie násobné rozdiely boli „počet axonálnych vstupov“ (nie je prekvapením, pretože všetky skúmané NMJ pochádzali od zdravých dospelých myší, u ktorých sa dá očakávať monoinervácia koncových platní) a „prekrývania“ (tabuľka 1 elektronický doplnkový materiál, obrázok S4B). Tento malý rozdiel v „prekrytí“ naprieč NMJ rôznych svalov naznačuje, že fyzická zhoda medzi pre- a postsynaptickými zložkami NMJ je vo všetkých synapsiách vysoko zachovaná bez ohľadu na ich individuálnu polohu alebo anatomickú „identitu“. Vzhľadom na tento vysoký stupeň fyzickej zhody medzi pre- a post-synaptickými štruktúrami a na dôsledky, ktoré z toho vyplývajú všetky ostatné premenné NMJ by mali byť „veľkosti prispôsobené“ naprieč synapsiou, bolo to zarážajúce nedostatok absolútnej zhody ani žiadne jasné zoskupenie premenných NMJ podľa oblasti tela alebo typu svalového vlákna (všimnite si rôzne rady svalov na obrázku 4, vo všeobecnosti aj vzhľadom na pre- a postsynaptické premenné). Napríklad NMJ inervujúce prevažne rýchlo sa šklbajúce svaly bolo možné nájsť s morfologickými premennými v každom extrémnom spektre (napr. Porovnajte FL2 a LAL-R na obrázku 4). Podobne je možné nájsť NMJ inervujúce svaly v prednej končatine (žlté pruhy na obrázku 4) s morfologickými premennými na každom konci rozsahu.

Okrem rozdielov v morfologických premenných NMJ medzi svalmi súčasný súbor údajov odhaľuje aj heterogenitu v súboroch NMJ z jednej vzorky svalu (t.j. z jednej strany jedného zvieraťa). Pre každý taký súbor 40 NMJ sme vypočítali variačný koeficient (CV) pre každú z 11 základných morfologických premenných: medián CV bol 0,3, pričom centrálnych 90% CV malo hodnoty medzi 0,16 a 0,67.

3.3. Identifikácia morfologických princípov riadiacich synaptickú heterogenitu na neuromuskulárnom spojení

Vzhľadom na zjavný nedostatok zjavných prediktorov morfológie NMJ na základe polohy tela alebo typu svalového vlákna sme použili pokročilejšie štatistické analýzy v snahe odhaliť morfologické princípy, ktoré riadia synaptickú heterogenitu, ktoré neboli ľahko zrejmé jednoduchým pozorovaním. Na tento účel sme vykonali analýzu hlavných komponentov (PCA) na úplnom viacrozmernom súbore údajov, ktorý obsahuje hodnoty 11 „jadrových“ morfologických premenných hodnotených pri každej z 2160 jednotlivých NMJ. Systematickým hodnotením korelácií medzi premennými PCA identifikuje najmenší počet faktorov („hlavných komponentov“), ktoré zodpovedajú za najväčší stupeň variability v súbore údajov v zdanlivo vysokorozmernom súbore údajov. Tento prístup nám umožňuje vizualizovať „poradie“ len v dvoch alebo troch dimenziách.

PCA preukázal, že väčšinu rozptylu (81%) v súbore údajov je možné zachytiť v dvojrozmernom grafe (obrázok 5), pričom prvá hlavná zložka (PC1) predstavuje približne 72% rozptylu a druhá istina komponent (PC2), ktorý predstavuje ďalších približne 9% rozptylu. Z fyzikálneho hľadiska sa PC1 najlepšie považuje za odraz „celkovej veľkosti“ NMJ na základe výrazne pozitívnych korelácií medzi morfologickými premennými súvisiacimi s veľkosťou (elektronický doplnkový materiál, obrázok S5) a ich zoskupením s vysokou X hodnoty súradníc na diagrame zaťaženia PCA (elektronický doplnkový materiál, obrázok S6). Podobným spôsobom možno PC2 interpretovať tak, že odráža stupeň „fragmentácie“ koncovej platne na základe oveľa slabšej asociácie pozorovanej medzi premennými súvisiacimi s veľkosťou a počtom klastrov AChR (elektronický doplnkový materiál, obrázok S5) a výrazne vysoká r súradnica počtu údajových bodov klastrov AChR na záťažovom grafe PCA (elektronický doplnkový materiál, obrázok S6). Jednoduchý spôsob, ako ilustrovať, ako tieto hlavné komponenty súvisia s meranými premennými, je považovať komponenty za „súhrn“ premenných. Jednoduchou analógiou je uvažovať o prirodzených variáciách v kostrách zvierat – možno merať ľubovoľný počet jednotlivých premenných (napr. rozmery lebky: výška, dĺžka, šírka, obvod, hmotnosť atď.), ale mnohé z nich budú korelované a veľký podiel z celkovej variability možno zistiť, že spočíva na oveľa menšom počte základných komponentov („veľkosť lebky“, „tvar lebky“ atď.) [46].

Obrázok 5. Analýza hlavných zložiek NMJ. Dvojrozmerné PCA reprezentácie NMJ definovaných 11 „jadrovými“ morfologickými premennými. (a) PCA mapa kompletnej sady 2160 NMJ, farebne označená podľa typu svalu. The X-axis predstavuje prvú hlavnú zložku (−3 až +5), r-os druhá hlavná zložka (-5 až +5). Vložka zobrazuje rovnakú mapu, ale obmedzuje sa iba na NMJ zo svalov TRI a FL2, čo ilustruje schopnosť PCA oddeľovať morfologicky odlišné NMJ. (b) Mapa PCA odvodená od mapy na paneli (a), agregovaním cez NMJ z každého zvieraťa. Každý údajový bod predstavuje ťažisko pozícií na mape 40 NMJ konkrétneho svalu z jednej strany jednotlivého zvieraťa, ľavý a pravý údajový bod pre každé zviera sú spojené čiarami. Svaly sfarbené ako na paneli (a). Jedna čiara pre každý typ svalu je označená tak, aby pomohla vizuálnej interpretácii. Súradnice PC1 a PC2 prebiehajú od −1,5 do +1,5. PCA vykonaná pomocou SPSS.

Záver, ktorý treba vyvodiť z PCA, je, že morfologická heterogenita je determinovaná predovšetkým „celkovou veľkosťou“ NMJ (na rozdiel od akejkoľvek individuálnej premennej), pričom „fragmentácia“ koncovej platne tiež predstavuje malý, ale významný príspevok k tejto variácii. Rovnako nie je možné použiť jednu morfologickú premennú na predpovedanie celkovej morfológie NMJ v danom svale. Tieto dve hlavné zložky („celková veľkosť“ a „fragmentácia“) možno jasne oceniť na rôznych NMJ zobrazených na obrázku 1.

3.4. Vplyv pre- a post-synaptických buniek na morfológiu nervovosvalového spojenia

Ďalej sme chceli posúdiť relatívny príspevok pre- a post-synaptických buniek (reprezentovaných priemerom axónov a priemerom svalových vlákien) k regulácii morfológie NMJ. Predovšetkým sme sa chceli zaoberať tichým predpokladom, že celková veľkosť NMJ (identifikovaná ako kľúčový determinant synaptickej morfológie pozri vyššie) bola jednoducho dôsledkom veľkosti vlákna kostrového svalstva, na ktorom sa tvorí NMJ (na základe predchádzajúcich väzieb medzi veľkosť koncovej platničky a priemer svalového vlákna [23,40,47]). Každú premennú NMJ sme vyniesli jednotlivo proti priemeru axónu aj svalového vlákna a získali sme korelačný koeficient a súvisiace p-hodnotu pre každé párovanie (obrázok 6 a tabuľka 2). Korelačné koeficienty mali pre priemer axónov väčšiu veľkosť ako priemer svalových vlákien pre väčšinu premenných (13 z 18), pričom korelácie boli silnejšie pre „základné premenné“ (podobné výsledky sa zistili s použitím korelačných údajov Spearmana, ktoré nie sú uvedené). Tieto výsledky naznačujú, že morfologické charakteristiky pre-synaptickej bunky (motorický neurón) sú silnejším determinantom celkovej synaptickej morfológie ako pre post-synaptickú bunku (svalové vlákno).

Obrázok 6. Vplyv pre- a post-synaptických buniek na morfológiu NMJ. Bodové grafy demonštrujúce koreláciu medzi priemerom axónu (alebo priemerom svalového vlákna) a jednotlivými premennými NMJ. (a) Pred a (b) sú ukázané postsynaptické príklady. Aby sa uľahčila vizuálna interpretácia, každý údajový bod zobrazuje priemernú hodnotu zo súboru 40 NMJ analyzovaných pre daný sval z jednej strany konkrétneho zvieraťa, ale korelačné koeficienty sa získali pomocou úplného súboru jednotlivých NMJ. Priemer axónu preukázal silnejšiu koreláciu s väčšinou premenných NMJ. Priemer svalových vlákien vykazoval nelineárny vzťah k premenným NMJ, pričom svaly boli zoskupené do dvoch podskupín (pozri výsledky). Kľúč ku skratkám a farebnému kódovaniu nájdete na obrázku 4.

Tabuľka 2. Vplyv pre- a post-synaptických buniek na morfológiu NMJ. Korelačné koeficienty PCA (r) získané z analýzy úplného súboru údajov (2 160 NMJ), ktoré demonštrujú vplyv priemeru axónu a svalového vlákna na každú z premenných NMJ. Koeficienty tučným písmom naznačujú silnejšiu koreláciu medzi priemerom axónu a príslušnými premennými. Úrovne významnosti: **p < 0,01, *p <0,05.

Je zaujímavé, že zatiaľ čo vzťah medzi priemerom axónu a morfológiou NMJ bol lineárny v celom rozsahu pozorovaných priemerov axónov, vzťah medzi priemerom svalového vlákna a morfológiou NMJ bol celkom odlišný: pôvodne silný lineárny vzťah pozorovaný pre svalové vlákna s malým priemerom neplatil pre svalové vlákna tricepsu a štvorhlavého svalu s väčším priemerom (obrázok 6). NMJ z tricepsov a quadricepsov boli teda menšie (na základe meraní oblasti nervovej terminálnej oblasti a oblasti AChR) v porovnaní s ich priemermi svalových vlákien, ako by sa dalo predpovedať extrapoláciou vzťahu pozorovaného v lebečných a bedrových svaloch. Tieto pozorovania ďalej spochybňujú názor, že veľkosť NMJ je jednoduchou funkciou priemeru svalového vlákna. Zostáva ešte určiť, či bližšia korelácia s priemerom axónu znamená väčší vplyv presynaptickej bunky na morfológiu NMJ. Napríklad retrográdna signalizácia zo svalového vlákna môže stále ovplyvňovať morfológiu NMJ, napriek slabšej korelácii veľkosti. Rozdiel medzi predpovedanými a pozorovanými veľkosťami NMJ na väčších svalových vláknach (v tricepsoch a kvadricepsoch) možno vysvetliť objemovým obmedzením predsynaptickej neuronálnej cytoplazmy.

Je tiež potrebné poznamenať, že pozorovaný vzťah medzi priemerom svalových vlákien a 'veľkosťou' NMJ (ako je popísané vyššie) nebol ovplyvnený veľkosťou jednotlivých zvierat, nebola nájdená žiadna korelácia medzi 'veľkosťou' zvieraťa (hmotnosť) a veľkosťou NMJ. ani medzi „veľkosťou“ (hmotnosťou) a priemerom svalového vlákna.

3.5. Vnútroindividuálna regulácia synaptickej morfológie

Výrazná heterogenita v morfológii NMJ, ktorú sme pozorovali medzi rôznymi svalmi, nás viedla k otázke, do akej miery bola synaptická morfológia kontrolovaná v rámci jednej populácie synapsií (napr. všetky NMJ v anatomicky definovanom svale), medzi dvoma stranami toho istého jedinca ( napr. porovnanie NMJ v rovnakom svale na ľavej a pravej strane tela) a medzi rôznymi jedincami (napr. porovnanie NMJ v rovnakom svale medzi rôznymi myšami z jedného vrhu).

Obrázok 7 demonštruje systematický prístup k párovému porovnávaniu týchto faktorov (sval, bok a myš) zobrazením meraní pre jednu „jadrovú“ premennú NMJ (oblasť AChR) pre ľavý/pravý pár dvoch rôznych svalov predných končatín (TRI a FL2) v dve myši z rovnakého vrhu. V tomto príklade je okamžite zrejmé, že najväčšie rozdiely v oblasti AChR sú pozorované pri párovom porovnaní TRI verzus FL2 u každej myši, po ktorom nasleduje porovnanie medzi myšami (tj M1 v. M2 pre každý sval, buď TRI alebo FL2) , pričom porovnanie ekvivalentných svalov na ľavej/pravej strane tela ukazuje najmenšie rozdiely.

Obrázok 7. Vplyv strany, svalu a jednotlivca na morfológiu NMJ. Porovnanie ľavých/pravých párov dvoch svalov (TRI a FL2) od dvoch súbežných myší (M1 a M2) s ohľadom na priemernú oblasť AChR NMJ. Každý dátový bod žltou farbou (jednotlivý sval, ľavý alebo pravý) predstavuje priemer zo 40 NMJ, priemer ľavého/pravého páru je označený čiarou. Reprezentatívne páry NMJ sú zobrazené vedľa. Mierka = 20 um.

Aby sme kvantifikovali vplyv každého z týchto faktorov na všetky svaly v celom vrhu, vykonali sme trojcestnú analýzu rozptylu (ANOVA) na kompletnom súbore údajov 2160 jednotlivých NMJ (tabuľka 3). To potvrdilo, že najväčší vplyv na morfológiu NMJ má „identita“ svalu (t. J. Najväčšie rozdiely boli pozorované pri porovnaní morfológie NMJ medzi rôznymi jednotlivými svalmi bez ohľadu na stranu alebo individuálnu „identitu“ zvieraťa).

Tabuľka 3. Vplyv strany, svalu a jedinca na morfológiu NMJ. Úrovne významnosti získané z trojcestnej analýzy rozptylu (ANOVA), ktorá demonštruje vplyv každého faktora na prirodzenú variáciu morfológie NMJ. Svalová identita má najväčší vplyv, strana nemá žiadny vplyv. Úrovne významnosti: ***p & lt 0,001, **p < 0,01, *p <0,05. ANOVA vykonávané pomocou SPSS.

Je možné, že absencia rozdielov medzi ľavou a pravou stranou v našich analýzach uvedených v tabuľke 3 bola výsledkom spojenia údajov z jednotlivých svalov a zvierat s možnosťou, že toto združenie zakryje skutočné rozdiely vľavo/vpravo v rámci jednotlivých zvierat. Testovali sme túto eventualitu vykonaním série t-testy porovnávajúce priemerné hodnoty konkrétnej premennej (oblasť AChR) pre NMJ každého páru ľavého/pravého svalu u každej jednotlivej myši. V tomto súbore 27 (= 3 × 9) porovnaní vľavo/vpravo iba jedno vykazovalo štatisticky významnú (p

3.6. Vplyv morfologických premenných na synaptickú funkciu na nervovosvalovom spojení

Nakoniec sme sa pýtali, do akej miery mal rozsah pre- a post-synaptických morfológií pozorovaný v našich experimentoch vplyv na funkčnú kapacitu NMJ.Vzťah medzi štruktúrou a funkciou je rozhodujúci pre zachovanie vysokého „bezpečnostného faktora“ na NMJ [17] - schopnosti uvoľniť dostatočný neurotransmiter na vyvolanie akčného potenciálu vo svalovom vlákne [48,49]. Pre tieto experimenty sme vykonali elektrofyziologické analýzy NMJ vo svaloch IS a LAL, vybraných na základe ich susedných polôh v tele (prijímajúce nervové zásobenie z rovnakého hlavného periférneho nervu), ale so systematickými a výrazne odlišnými morfológiami NMJ (obrázky 4 a 8 a tabuľky 1 a 4 elektronický doplnkový materiál, obrázok S4).

Obrázok 8. Elektrofyziologická analýza NMJ pri IS a LAL. Tieto zistenia podporili pozorované morfologické rozdiely (obrázok 4) a boli v súlade s predchádzajúcimi zisteniami týkajúcimi sa vzťahu medzi veľkosťou nervových zakončení a synaptickou silou. (a,b) EPP (horné stopy) a spontánne MEPP (dolné stopy vyšší zisk, pomalšia časová základňa) zaznamenané z reprezentatívnych (a) IS a (b) LAL svalové vlákna. (c) V porovnaní oboch svalov nebol v amplitúde EPP významný rozdiel. (df) Frekvencia spontánnej MEPP bola asi štyrikrát nižšia vo svalových vláknach IS v porovnaní s LAL (d). Naopak, amplitúda MEPP (kvantová veľkosť) bola asi o 45 % väčšia v IS ako LAL vlákna (e). Kvantálny obsah bol v LAL asi o 87% vyšší v porovnaní s IS (f), vyrovnaním rozdielu v kvantálnej veľkosti, a teda prispôsobením nelineárnemu súčtu a poskytnutím amplitúdy a bezpečnostného faktora EPP pre prenos na ekvivalentných úrovniach. Údaje sú priemer ± SEM n = 33–58 svalových vlákien zaznamenaných v N. = 2 IS a N. = 3 LAL svaly **p & lt 0,01 ****p & lt 0,0001 nepárový t-testy).

Tabuľka 4. Elektrofyziologické vlastnosti IS a LAL. Súhrn elektrofyziologických vlastností svalov IS a LAL. Hodnoty sú priemer a štandardná chyba priemeru (s.e.m.) pre každú premennú a násobný rozdiel medzi priemermi pre každý sval. Údaje boli zaznamenané z 33–58 svalových vlákien v dvoch svaloch IS a troch svaloch LAL. Úrovne významnosti: ****p & lt 0,0001, **p < 0,01, *p <0,05.

Pokojové membránové potenciály v IS (−64 ± 1 mV, priemer ± s.e.m., n = 40 vlákien, N. = 2 svaly) boli o niečo (o 2–6 mV) negatívnejšie než v LAL (–60 ± 1 mV, p & lt 0,03, t-test). Amplitúdy EPP (korigované na pokojový potenciál −80 mV) v IS (25,0 ± 2,0 mV, n = 40 vlákien, N. = 2 svaly) a LAL (28,7 ± 2,3 mV, n = 56 vlákien, N. = 3 svaly) sa výrazne nelíšili (p = 0,24). Časy vzostupu a poklesu EPP boli výrazne dlhšie v IS (1,12 ± 0,06 ms, resp. 2,05 ± 0,08 ms, resp. n = 50 vlákien, N. = 2 svaly) ako v LAL (0,82 ± 0,05 ms, 1,36 ± 0,05 ms, n = 58 vlákien, N. = 3 svaly, p < 0,0001). Tieto údaje predpovedajú nižší odpor membrány a kratšiu časovú konštantu membrány v LAL ako svalové vlákna IS.

Frekvencia MEPP na NMJ bola viac ako štyrikrát nižšia vo svaloch IS (0,77 ± 0,07 s −1 , n = 34 vlákien, N. = 2 svaly) ako v LAL (3,54 ± 0,46 s −1, n = 46 vlákien, N. = 3 svaly, p < 0,0001). Tieto údaje sú v súlade s pozorovaniami vyšších frekvencií MEPP na väčších koncových doštičkách, ktoré boli urobené predtým [23]. Podobne amplitúda MEPP (kvantová veľkosť), korigovaná na štandardný pokojový membránový potenciál -80 mV, bola asi o 45 % väčšia v IS (1,12 ± 0,13 mV, n = 33 vlákien, N. = 2 svaly) ako v LAL (0,76 mV ± 0,06 mV, n = 47 vlákien, N. = 3 svaly, p <0,01), čo je v súlade s predchádzajúcimi správami [23]. Priemerný kvantový obsah počiatočných EPP vypočítaný po korekcii amplitúd EPP na nelineárne súčty a pokojový potenciál bol v LAL asi o 85% väčší (67,7 ± 6,2 kvanta, n = 45 vlákien, N. = 3 svaly) ako v IS (37,3 ± 2,4 kvanta, n = 33 vlákien, N. = 2 svaly, p < 0,0001), čo je v súlade s dobre preukázanou koreláciou medzi kvantovým obsahom a oblasťou nervového zakončenia pri NMJ [23,38–40,49,50].

Celkovo sú naše fyziologické merania v súlade s predchádzajúcimi zisteniami [23,38–40,49,50] týkajúcimi sa vzťahu medzi synaptickou veľkosťou a synaptickou silou a ďalej potvrdzujú morfometrické rozdiely medzi anatomicky definovanými svalmi, ktoré sme tu uviedli.

4. Diskusia

Tu uvádzame správu o úspešnom vývoji a implementácii platformy/pracovného toku založeného na technológii I mage J s cieľom uľahčiť porovnávacie morfometrické analýzy NMJ (NMJ-morph). Pomocou NMJ-morfu sme vygenerovali východiskové referenčné údaje pre 21 individuálnych pre- a postsynaptických morfologických premenných na NMJ, čo odhaľuje systematické rozdiely v morfológii NMJ medzi definovanými synaptickými populáciami. Podrobnejšie štatistické skúmanie týchto údajov pomocou PCA odhalilo celkovú veľkosť NMJ a stupeň synaptickej fragmentácie ako najdôležitejšie parametre pri definovaní synaptickej morfológie. Tiež demonštrujeme, že „priemerná“ synaptická morfológia je vysoko zachovaná medzi NMJ umiestnenými v rovnakých anatomicky oddelených svaloch na ľavej a pravej strane tela a ďalej potvrdzujeme, že systematické rozdiely v synaptickej morfológii predpovedajú zodpovedajúce rozdiely v synaptickej funkcii.

Demonštrácia užitočnosti NMJ-morfu ako robustnej a opakovateľnej metodiky pre komparatívnu morfometrickú analýzu NMJ naznačuje, že teraz bude možné tento prístup uplatniť na širokú škálu experimentálnych prostredí (vrátane štúdia patologických zmien vyskytujúcich sa na NMJ počas rad neurodegeneratívnych stavov). Medzi výhody prijatia takéhoto štandardizovaného prístupu patrí schopnosť rýchlo a jednoducho porovnávať a kombinovať súbory údajov z viacerých štúdií generovaných rôznymi laboratóriami (čo je v súčasnosti mimoriadne náročné, keď je súčasnou praxou jednotlivých laboratórií používanie odlišných a často jemne odlišných prístupov) na morfometriu NMJ). Poskytnutím bezplatného prístupu k komplexnej používateľskej príručke NMJ-morph (popisujúcej podrobnú metódu vykonávania každého merania), spolu so šablónami tabuliek a vzorovou bankou obrázkov na použitie pri školeniach a štandardizácii očakávame, že tento prístup bude atraktívny do iných laboratórií. Okrem toho poskytnutie základných morfologických referenčných údajov z mnohých rôznych svalových skupín v tejto štúdii by malo pomôcť pri navrhovaní a interpretácii budúcich štúdií NMJ v oblasti zdravia a choroby.

V tejto štúdii sme sa zamerali na komplexnú analýzu morfológie NMJ v jednom vrhu myší CD1. Vzhľadom na možno neočakávaný stupeň heterogenity NMJ zaznamenaný medzi svalmi a jednotlivými zvieratami z vrhu je potrebné zistiť, či sa tieto variácie týkajú aj porovnávaní medzi vrhom a medzi kmeňmi, ktoré tieto analýzy vyžadujú ďalšie skúmanie v budúcom výskume, a my varuje pred tým, aby sa tu uvádzané hodnoty považovali za „normálne“ alebo „typické“ pre všetky myši. Ak sú skutočne prítomné vysoké hladiny heterogenity NMJ v rôznych kmeňoch myší, mohlo by to mať významné dôsledky pre translačný výskum synaptickej patológie pri neurodegeneratívnych ochoreniach.

Navyše naše pozorovanie vysoko konzervovanej/regulovanej „priemernej“ synaptickej morfológie na myších NMJ umiestnených v rovnakom svale, ale na rôznych stranách tela, kontrastuje s výraznými rozdielmi v synaptickej morfológii pri opätovnom porovnávaní NMJ v tom istom svale, ale medzi dvoma individuálnymi zvieratá sú tieto pozorovania v rozpore s predchádzajúcimi zisteniami z modelových systémov bezstavovcov. V Drosophila napríklad kvantitatívna analýza morfológie NMJ na svale 4 u 20 rôznych poddruhov odhalila malé morfologické odchýlky pri porovnaní jednotlivých zvierat v rámci každého druhu, pričom rozsiahle rozdiely vo veľkosti a komplexnosti NMJ sa vyskytujú iba medzi druhmi [10]. Tieto zistenia naznačujú, že kontrola synaptickej morfológie, ktorá sa zdá byť prísne regulovaná Drosophila (pravdepodobne geneticky), nie je v komplexnom nervovom systéme cicavcov tak vysoko konzervovaný. U myší teda existuje úroveň heterogenity v synaptickej morfológii, ktorá nemusí byť zjavná v dobre študovaných bezstavovcových systémoch. Preto nemusí byť možné jednoducho preložiť zistenia týkajúce sa genetickej alebo environmentálnej kontroly synaptickej štruktúry a funkcie získané z modelových systémov, ako napr. Drosophila priamo do nervového systému cicavcov. Dostupnosť morfínu NMJ však teraz uľahčí presnejšie preskúmanie zjavnej nemennosti u iných druhov, zatiaľ čo u myší referenčné údaje, ktoré sme vytvorili pre zdravé NMJ v celom rade svalov, pozývajú na budúce porovnania s NMJ v chorobný stav.

Vzhľadom na rozdiely pozorované pri NMJ u myší zostáva zistiť, či morfologické princípy identifikované v tejto štúdii sú vhodné na extrapoláciu na iné druhy cicavcov vrátane ľudí. To môže mať značný význam vzhľadom na štúdie neurodegeneratívnych stavov ovplyvňujúcich neuromuskulárne synapsie, kde sa väčšina predklinického výskumu spolieha na modely chorôb hlodavcov. Štúdie, ktoré sa priamo zaoberajú zachovaním (alebo iným spôsobom) regulačnej kontroly synaptickej morfológie medzi nižšími cicavcami (napr. Myšami) a ľuďmi, sú preto opodstatnené, aj keď technicky náročné, pretože predchádzajúce štúdie ľudských NMJ sa spravidla spoliehali na motorickú bodovú biopsiu [51], a kedysi bežne indikovaný diagnostický postup, ktorý sa v modernej klinickej praxi vykonáva len zriedka.

Elektrofyziologické údaje, ktoré sme získali, sú v súlade s našimi nálezmi menších svalových vlákien a menších NMJ v IS v porovnaní s LAL, pretože je známe, že kvantový obsah vo svalových vláknach cicavcov je úmerný veľkosti terminálu motorického nervu [23,38–40,49,50 ]. Výsledkom je, že relatívne malé svalové vlákna majú vyšší vstupný odpor, dlhšiu membránovú časovú konštantu a NMJ vykazujú väčšie MEPP (kvantová veľkosť) a nižší kvantový obsah ako väčšie vlákna [23,40]. Vyšší kvantový obsah, ktorý sme pozorovali v LAL (v súlade s väčšími nervovými zakončeniami) a nižšia kvantová veľkosť (v súlade s väčšími svalovými vláknami), sa približne navzájom kompenzovali, takže amplitúda EPP bola takmer rovnaká ako v IS, čo podporuje predstavu homeostatika. mechanizmus, ktorý zachováva faktor bezpečnosti pre nervosvalový prenos [40,50,52]. Je však potrebné poznamenať, že sme slepo odobrali vzorky EPP pomocou jednoduchých mikroelektród, ďalšie poznatky je možné získať súčasným zobrazením morfológie NMJ spolu s elektrofyziologickými záznamami z rovnakých svalových vlákien (napr. Umožnením získania kvantových analýz priamo zo záznamov prúdov koncových doštičiek získaných pomocou dvojelektródová napäťová svorka [41]). Wood & Slater [53,54] merali bezpečnostný faktor týmto spôsobom porovnaním pozorovaného prúdu na koncovej doske s prúdom potrebným na kritickú depolarizáciu svalových vlákien na prah výstrelu akčného potenciálu. Dospeli k záveru, že akonáhle sa vezmú do úvahy rozdiely v príspevku postsynaptického junctionálneho skladania, bezpečnostný faktor v móle potkana (sval s pomalým zášklbom) zodpovedá približne 3,5-násobku množstva neurotransmiteru uvoľneného pri NMJ v porovnaní s požiadavkou na spustenie svalové akčné potenciály, ale toto bolo výrazne nižšie ako u NMJ v extensor digitorum longus (rýchlo sa trhajúci sval), kde bol bezpečnostný faktor asi 5. Zostáva teda nejasné, ktorá vlastnosť NMJ je homeostaticky regulovaná [52,55], a či sa NMJ v svaloch IS a LAL v tomto ohľade normálne líšia. Ďalšia analýza prúdov koncových platničiek v týchto dvoch svaloch spolu s týmito pozorovaniami môže poskytnúť nový pohľad na faktory, ktoré regulujú synaptickú depolarizáciu. Túto metódu simultánneho záznamu štruktúry a funkcie z rovnakých NMJ nedávno použil Willadt a kol. [56], čím sa značne rozšíril okruh otázok, ktoré je možné riešiť v budúcom výskume.

Stručne povedané, úspešne sme vyvinuli nový pracovný tok založený na I mage J (NMJ-morph), aby sme uľahčili porovnávacie morfometrické analýzy NMJ. Uvádzame základné referenčné údaje pre 21 individuálnych pre- a postsynaptických morfologických premenných na NMJ, ktoré odhalili systematické rozdiely medzi definovanými synaptickými populáciami. Dospeli sme k záveru, že celková veľkosť NMJ a stupeň synaptickej fragmentácie sú najdôležitejšie parametre na definovanie synaptickej morfológie in vivo.

Etika

Všetky experimenty na myšiach boli vykonávané podľa príslušných projektových a osobných licencií udelených britským ministerstvom vnútra.


Aký je rozdiel medzi synapsiou a neuromuskulárnym spojením?

Títo dvaja sú si veľmi podobní! A synapsia je spojenie medzi neurónom a nasledujúcou bunkou. A neuromuskulárne spojenie je druh synapsie, ktorá sa vyskytuje medzi Motorické neuróny a Svalové bunky. Akčné potenciály sa prenášajú z neurónov do svalových buniek, čím stimulujú pohyb svalových buniek. Neuromuskulárne spojenia fungujú rovnakým spôsobom ako synapsie, s niekoľkými dôležitými rozdielmi: - Neuromuskulárne spojenia majú viac receptorov na postsynaptickej membráne ako iné synapsie. - Keď motorický neurón spustí akčný potenciál vždy vyvoláva reakciu vo svalovej bunke. (To nie je vždy prípad synapsie medzi dvoma neurónmi).


Rozdiely medzi synapsiami a neuromuskulárnymi spojmi

Takže jeden z rozdielov hovorí: „NMJ sú vždy excitačné, synapsie môžu byť inhibičné alebo excitačné“, ale nerozumiem presne, čo to znamená?

Vďaka

Toto nie je to, čo hľadáte? Skúste&hellip

(Pôvodný príspevok od white_o)
V jednom z rozdielov sa teda uvádza, že „NMJ sú vždy excitačné, synapsie môžu byť inhibičné alebo excitačné“, ale nerozumiem presne, čo to znamená?

Vďaka

V zásade neuromuskulárny prechod nemôže skutočne inhibovať kostrové svalstvo, pretože prirodzený stav kostrového svalu je uvoľnený. Takže ak by ste mali mať inhibičnú neuromuskulárnu križovatku, potom by to nič neurobilo, pretože jediné, čo by ste robili, by bolo inhibovať niečo, čo už nič nerobí. Neuromuskulárne spojenia teda môžu byť iba excitačné, pretože aktivácia NMJ stimuluje kontrakciu svalu.

Synapsie na druhej strane môžu byť stimulačné alebo inhibičné. Je to dôležité, pretože väčšina neurónov je aktívna stále, napríklad niektoré neuróny v sympatickom nervovom systéme sa neustále aktivujú, aby stimulovali niektoré cievy, aby sa stiahli, ale ak telo z nejakého dôvodu potrebuje tieto cievy rozšíriť, potom potreba inhibovať sympatické neuróny, ktoré spôsobujú ich zúženie. Deje sa tak pomocou inhibičnej synapsie v mozgu, ktorá bráni sympatickému neurónu v častom streľbe.

^ Toto bolo dosť zle vysvetlené, niekto iný by to mohol lepšie zvládnuť

Synapsie sú medzi dvoma neurónmi. Predsynaptický neurón (ten, ktorý sa spustí ako prvý) uvoľňuje neurotransmitery a oznamuje postsynaptickému neurónu, či je potrebné ho zapnúť alebo vypnúť. V závislosti od typu synapsie teda môže inhibovať alebo excitovať postsynaptický neurón, ktorý nasleduje.

Na neuromuskulárnom spojení máte spojenie medzi neurónom a efektorovým svalom. Pre kostrové svaly máte uvoľnený acetylcholín, ktorý vždy nabudí svalovú bunku. Ak teda excitujete neurón na nervosvalovej križovatke, výsledkom bude vždy svalová kontrakcia. To isté platí pre srdcový sval a hladký sval, aj keď tu verím, že neurotransmiter nie je ani adrenalín.

(Pôvodný príspevok od biela_o)
V jednom z rozdielov sa teda uvádza, že „NMJ sú vždy excitačné, synapsie môžu byť inhibičné alebo excitačné“, ale nerozumiem presne, čo to znamená?

Vďaka

Dobre. Najprv mi vysvetlite významový rozdiel medzi synapsiou a NMJ. Synapsie sú spojenia medzi nervovými bunkami, zatiaľ čo NMJ je kvázi vstupom do svalovej bunky. Na prenos stimulu vo forme akčného potenciálu z nervovej bunky na inú a do svalovej bunky potom musia byť receptory neurotransmiterov na NMJ otvorené acetylcholínom. Stáva sa to vtedy, keď stimul vo forme akčného potenciálu dorazil do synapsie.

Stimul je excitačný, keď je prekročený prah stimulu. To vedie k prenosu stimulu z nervovej bunky do ďalšej, a tým do určitej svalovej bunky. Stimul je inhibičný, ak je stimulačný prah podbehnutý, to znamená, že je príliš slabý na prenos z nervovej bunky do nervovej bunky.

Na základe tohto vysvetlenia musí byť NMJ vždy vzrušujúci, inak nie sú stimuly schopné priviesť svalové bunky, a teda používať časti tela, ktoré sú s týmito svalovými bunkami sprevádzané. Okrem hlavnej funkcie synapsií, a to prenášať vzruchy z nervovej bunky do nervovej bunky, sú niektoré z nich inhibičné, aby nedochádzalo k nadmernej stimulácii. Predstavte si, že máte v mozgu 100 myšlienok súčasne, pretože 100 podnetov sa prenáša v toľkých rôznych nervových bunkách! zbláznil by si sa, však? preto sú synapsie tiež inhibičné, aby zaručili, že sa prenášajú len dôležité podnety pre naše vnímanie.


Vznikajúce priesečníky medzi neurovedou a biológiou gliómu

Vytvorenie neurónových a gliových sietí v mozgu závisí od aktivít nervových progenitorov, ktoré sú ovplyvnené vnútornými mechanizmami bunky, interakciami s lokálnym mikroprostredím a signalizáciou na veľké vzdialenosti. Pokrok v neurovede pomohol identifikovať kľúčové faktory vo vývoji CNS. Štúdie v posledných rokoch zároveň zvýšili naše chápanie molekulárnych a bunkových faktorov vo vývoji a raste primárnych mozgových nádorov. Aby sa darilo, bunky gliómu využívajú cesty, ktoré sú aktívne v normálnych progenitorových bunkách CNS, ako aj v normálnej signalizácii neurotransmiterov. Nádorové bunky nevyliečiteľných gliómov sa navyše integrujú do komunikujúcich mnohobunkových sietí, kde sú prepojené prostredníctvom bunkových výčnelkov podobných neuritom. V tomto prehľade diskutujeme o dôkazoch, že vývoj, organizácia a funkcia CNS zdieľajú množstvo spoločných znakov s progresiou gliómu a malignitou. Patria sem mechanizmy používané bunkami na proliferáciu a migráciu, interakciu s ich mikroprostredím a integráciu do mnohobunkových sietí. Vznikajúce priesečníky medzi oblasťami neurovedy a neuroonkológie, o ktorých sa v tomto prehľade uvažuje, poukazujú na nové smery výskumu a nové terapeutické príležitosti.

Hoci predstavujú iba jedno až dve percentá všetkých nádorov 1, malígne gliómy sú obzvlášť invalidizujúce a smrteľné choroby 2. Ich infiltračný rast a vysoká rezistencia nádorových buniek voči terapiám spolu so zraniteľnosťou CNS bránia účinným protinádorovým terapiám. Názov „glióm“ odzrkadľuje histomorfologickú podobnosť nádorových buniek s bunkami gliových línií v normálnom mozgu, ako sú astrocyty a bunky oligodendrogliálnej línie, ktoré boli dlho považované za jediné proliferujúce bunky v zrelom mozgu 3. V dôsledku toho boli nádory rozdelené na základe nápadných mikroskopických znakov a na predpokladaný typ pôvodu buniek, napríklad na astrocytómy a oligodendrogliómy 4, klasifikácia, ktorá sa dnes prehodnocuje. Dnes rozlišujeme tri hlavné typy gliómov: oligodendroglióm (izocitrátdehydrogenáza (IDH)-mutované a súčasne vymazané 1p/19q) IDH-mutované astrocytómy a IDH astrocytómy divokého typu, ktoré zahŕňajú najzhubnejší typ gliómu, glioblastóm.


2 odpovede 2

Typicky sa „presynaptické“ a „postsynaptické“ používajú na označenie dvoch neurónov, ktoré sú spojené, ako správne uvádzate v druhom príklade. Tok informácií v nervovom systéme v zásade prebieha jedným smerom. Ak jeden neurón vystrelí (presynaptická bunka), môže chemicky aktivovať inú bunku, na ktorej sa synapsuje (postsynaptická bunka), ako ukazuje nasledujúci obrázok 1.

Ako názorný príklad uvažujme sluchový systém (obrázok 2).

Bunky, ktoré posielajú svoje axóny z vnútorného ucha do kochleárneho jadra (prvá centrálna sluchová štruktúra v sluchovej dráhe), sa nazývajú špirálové gangliové bunky. Axóny z bunky sluchového nervu tvoria sluchový nerv. Bunky sluchového nervu uvoľňujú glutamát zo svojho axónového konca do synapsie, čo zase aktivuje bunky kochleárneho jadra. V tejto schéme sú bunky sluchového nervu presynaptickýa bunky kochleárneho jadra sú postsynaptický.

Pri preklade tohto príkladu na obrázok 1 by axónom hore bola bunka sluchového nervu a postsynaptickým neurónom kochleárne jadro, ktoré prijíma vstup zo sluchového nervu.

Aby sme však pokračovali v periférnom sluchovom systéme, bunky sluchového nervu dostávajú svoj vstup periférne z vláskových buniek vo vnútornom uchu, zatiaľ čo bunky kochleárneho jadra odosielajú svoj výstup centrálne do komplexu olivária. Bunky sluchového nervu teda môžu byť tiež klasifikované ako postsynaptické, zatiaľ čo bunky kochleárneho jadra sú tiež presynaptické. Opäť, ako ukazuje tento príklad na báze sluchového systému, všetko závisí od kontext a konkrétny systém, ktorý je predmetom vyšetrovania.

Terminológia však môže poukazovať aj na jednu bunku. V hypotetickom scenári by neurón poslal kolaterálny axón do svojho vlastného bunkového tela, bola by to presynaptická aj postsynaptická bunka. Na obrázku by axón v hornej časti obrázku (stále správne označený ako presynaptický) potom pochádzal z neurónu zobrazeného v spodnej časti obrázku (stále správne označený ako postsynaptický).

Zo svojho bakalárskeho titulu z biológie som oboznámený iba s druhý používanie výrazov, ktoré popisujete.

teda termíny presynaptický a postsynaptický popisujú priestorový vzťah ako viete, do synapsie, ktorá má smerovosť. Ak sa výrazy používajú na opis celých buniek, ako pokrýva AliceD, a ako to ľudia často robia pri popise nervovej dráhy, potom by kvôli jasnosti mala byť pomenovaná príslušná synapsia. Dôvodom je, že mnohé neuróny prijímajú vstup a poskytujú výstup na rôznych synapsiách.

Prvé použitie, ktoré navrhujete, je mi neznáme, nepočul som o tomto použití. Tento význam by možno možno lepšie pochopil z výrazov „pred alebo po prenose“ alebo „pred alebo po synaptickej udalosti“, ale nie som si istý, ako sú tieto pojmy užitočné (vysvetlím, prečo :)

Existuje niekoľko štruktúr synapsie, pre ktoré by mohlo byť užitočné premýšľať o stavoch pred a po jednej synaptickej udalosti: iónové kanály a populácia vezikúl neurotransmiterov na konci axónu a iónové kanály postsynaptickej žiarovky.

Celý systém prítomný v synapsii je však dynamický a verím, že nové akčné potenciály môžu do synapsie doraziť častejšie, ako je doba potrebná na obnovu synapsie - preto skutočne existuje heterogénna populácia štátov s časom, nie s dvoma. jasné. Jedna izolovaná prenosová udalosť môže byť použitá ako myšlienkový experiment na pochopenie molekulárnej biológie, a preto učebnice učia sériu udalostí synaptického prenosu.

Mohol by som tvrdiť, že synaptický prenos sa týka celej udalosti vrátane obnovy - a preto neexistuje žiadny zmysluplný rozdiel medzi synapsami pred a po prenose. Výnimkou môže byť dlhodobá potenciácia/depresia, ale tie sú podmienené väčšou aktivitou než len jedným akčným potenciálom.

Pokiaľ viem, "pre-/post-synaptické" sa nepoužívajú na označenie stavov synapsie, na čas. Môj názor je, že neexistuje taký užitočný rozdiel medzi synapsiou pred a po udalosti.

Synapsia v neurobiológii je štruktúra so smerom- teda pre- a post- má priestorový význam. Udalosť prenosu by sa nemala nazývať „synapsia“, cítim, že to prináša zmätok.


Sumácia signálu

Obrázok 8. Jeden neurón môže prijímať excitačné aj inhibičné vstupy z viacerých neurónov, čo má za následok lokálnu depolarizáciu membrány (vstup EPSP) a hyperpolarizáciu (vstup IPSP). Všetky tieto vstupy sa sčítajú na vyvýšenine axónov. Ak sú EPSP dostatočne silné, aby prekonali IPSP a dosiahli prah excitácie, neurón vybuchne.

Niekedy je jeden EPSP dostatočne silný na to, aby vyvolal akčný potenciál v postsynaptickom neuróne, ale často musia viaceré presynaptické vstupy vytvoriť EPSP približne v rovnakom čase, aby bol postsynaptický neurón dostatočne depolarizovaný, aby vyvolal akčný potenciál. Tento proces sa nazýva zhrnutie a vyskytuje sa na kopci axónu, ako je znázornené na obrázku 8. Navyše jeden neurón má často vstupy z mnohých presynaptických neurónov - niektorých excitačných a niektorých inhibičných -, takže IPSP môžu anulovať EPSP a naopak. Je to čistá zmena v postsynaptickom membránovom napätí, ktorá určuje, či postsynaptický článok dosiahol svoj prah excitácie potrebný na spustenie akčného potenciálu. Synaptický súčet a prah pre excitáciu spolu fungujú ako filter, takže náhodný „šum“ v systéme nie je prenášaný ako dôležitá informácia.

Art Connection

Rozhranie mozog-počítač

Amyotrofická laterálna skleróza (ALS, tiež nazývaná Lou Gehrigova choroba) je neurologické ochorenie charakterizované degeneráciou motorických neurónov, ktoré riadia vôľové pohyby. Choroba začína svalovým ochabnutím a nedostatkom koordinácie a nakoniec zničí neuróny, ktoré riadia reč, dýchanie a prehĺtanie, choroba môže viesť k paralýze. V tomto bode pacienti potrebujú pomoc od strojov, aby mohli dýchať a komunikovať. Bolo vyvinutých niekoľko špeciálnych technológií, ktoré umožňujú „uzamknutým“ pacientom komunikovať so zvyškom sveta. Jedna technológia napríklad umožňuje pacientom vypisovať vety zášklby na líci. Tieto vety potom môže nahlas čítať počítač.

Relatívne nová línia výskumu, ktorá má pomôcť paralyzovaným pacientom, vrátane pacientov s ALS, komunikovať a udržať si stupeň sebestačnosti, sa nazýva technológia rozhrania mozgu a počítača (BCI) a je znázornená na obrázku 9. Táto technológia znie ako niečo, sci -fi: umožňuje ochrnutým pacientom ovládať počítač iba pomocou svojich myšlienok. Existuje niekoľko foriem BCI. Niektoré formy používajú EEG záznamy z elektród nalepených na lebke. Tieto nahrávky obsahujú informácie z veľkých populácií neurónov, ktoré môže počítač dekódovať. Iné formy BCI vyžadujú implantáciu poľa elektród menších ako poštová známka do oblasti ramena a ruky motorickej kôry. Táto forma BCI, aj keď je invazívnejšia, je veľmi silná, pretože každá elektróda môže zaznamenávať skutočný akčný potenciál z jedného alebo viacerých neurónov. Tieto signály sú potom odoslané do počítača, ktorý bol vyškolený na dekódovanie signálu a jeho prenos do nástroja - napríklad kurzora na obrazovke počítača. To znamená, že pacient s ALS môže používať e-mail, čítať internet a komunikovať s ostatnými tak, že bude myslieť na pohyb rukou alebo pažou (aj keď paralyzovaný pacient nemôže vykonávať tento telesný pohyb). Nedávne pokroky umožnili paralyzovanej zamknutej pacientke, ktorá pred 15 rokmi prekonala mozgovú príhodu, ovládať robotické rameno a dokonca sa kŕmiť kávou pomocou technológie BCI.

Napriek úžasnému pokroku v technológii BCI má aj svoje obmedzenia. Technológia môže pre pacienta vyžadovať mnoho hodín školenia a dlhé obdobia intenzívnej koncentrácie, ale môže tiež vyžadovať chirurgický zákrok mozgu na implantáciu zariadení.

Obrázok 9. S technológiou rozhrania mozog-počítač sú nervové signály od paralyzovaného pacienta zozbierané, dekódované a potom privádzané do nástroja, akým je počítač, invalidný vozík alebo robotické rameno.

Odkaz na Učenie

Pozrite si toto video, v ktorom ochrnutá žena používa mozgom ovládané robotické rameno na prinesenie nápoja do úst, medzi inými obrázkami technológie rozhrania mozog-počítač v akcii.


Priama signalizácia cez Gap Junctions

Medzerové spojenia u zvierat a plazmodesmata u rastlín sú spojenia medzi plazmatickými membránami susedných buniek. Tieto vodou naplnené kanály umožňujú malým signálnym molekulám, nazývaným intracelulárne mediátory, difundovať medzi tieto dve bunky. Malé molekuly, ako sú ióny vápnika (Ca 2+), sa môžu pohybovať medzi bunkami, ale veľké molekuly, ako sú proteíny a DNA, sa cez kanály nedostanú. Špecifickosť kanálov zaisťuje, že bunky zostávajú nezávislé, ale môžu rýchlo a ľahko prenášať signály. Prenos signálnych molekúl komunikuje aktuálny stav bunky, ktorá je priamo vedľa cieľovej bunky, čo umožňuje skupine buniek koordinovať svoju odpoveď na signál, ktorý mohla dostať iba jedna z nich. V rastlinách sú plazmodesmata všadeprítomné, čo z celej rastliny robí obrovskú komunikačnú sieť.


Pozri si video: Toni Berbece: Diferenta dintre minunile lui Hristos si minunile diavolului (November 2022).