Informácie

Ako charakterizovať stabilitu proteínu z kriviek fluorescencie Trp vs [denaturant]?

Ako charakterizovať stabilitu proteínu z kriviek fluorescencie Trp vs [denaturant]?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Môj kolega vykonal merania fluorescencie Trp z diméru v kombinácii s rôznymi ligandami v rozsahu koncentrácií denaturačného činidla.

Ide o to, že ligandy, ktoré sa viažu pevnejšie na dimér, ho stabilizujú a oneskoria zmeny vo fluorescencii. Takto vyzerajú naše údaje:

Celková fluorescencia klesá, pravdepodobne v dôsledku zhášania denaturantom. Dokumenty, ktoré som videl pri použití tejto metódy, ukazujú, že je možné vypočítať frakciu denaturovaného proteínu analýzou posunu v špičkovej emisnej vlnovej dĺžke. Používajú však monomérne proteíny s malým počtom Trp, zatiaľ čo ja mám dimér s niekoľkými Trp plus určitú dodatočnú variabilitu zavedenú rôznymi ligandami.

Okrem toho máme údaje zo scintilačného proximitného testu, ktorý naznačuje, že afinita ligandu je usporiadaná ako 1<… <5 a 6<… <11. V ideálnom prípade by sme chceli zopakovať rovnaké poradie prostredníctvom analýzy vykonanej na údajoch uvedených vyššie. Ocenil by som akékoľvek návrhy metód, ktoré nám umožnia takéto porovnania uskutočniť.


Dokumenty, ktoré som videl pri použití tejto metódy, ukazujú, že je možné vypočítať frakciu denaturovaného proteínu analýzou posunu v špičkovej emisnej vlnovej dĺžke.

Skúsili ste to urobiť so svojimi údajmi? Čo získate, ak vykreslíte vlnovú dĺžku maximálnej emisie ako funkciu koncentrácie denaturačného činidla? Ak vyzerajú ako sigmoidálne krivky (možno budete potrebovať logaritmickú stupnicu na osi X) s jasnou hornou plošinou, potom môžete použiť metódu spomínanú v týchto dokumentoch, pretože signál, ktorý pozorujete, koreluje s frakciou denaturovaného proteínu a nasýtených látok ( táto časť je dôležitá: signál sa musí nasýtiť pri určitej koncentrácii denaturačného činidla, pretože všetky molekuly bielkovín sú plne denaturované a preto pridanie ďalšieho denaturačného činidla nespôsobí ďalšiu zmenu signálu; ak sa váš signál nenasýti, niečo nie je v poriadku) .

Používajú však monomérne proteíny s niekoľkými Trp, zatiaľ čo ja mám dimér s niekoľkými Trp

Oligomérny stav a počet zvyškov Trp by nemali záležať, pretože vlnová dĺžka maximálnej emisie koreluje iba s frakciou denaturovaného proteínu. Celková intenzita sa bude zvyšovať s väčším počtom zvyškov Trp, ale nepoužívate intenzitu ako meradlo frakcie denaturovaného proteínu (a ak niečo, je dobré mať na začiatok väčšiu intenzitu vzhľadom na zhášací účinok, ktorý pozorujete so zvyšujúcou sa koncentráciou denaturačného činidla. ).

plus nejaká ďalšia variabilita zavedená rôznymi ligandami.

Na vyriešenie tohto problému potrebujete dva ovládacie prvky, ktoré:

  1. dokázať, že žiadny z ligandov nemení fluorescenciu vášho proteínu,
  2. dokážte, že žiadny z ligandov nevyžaruje fluorescenciu medzi 300 a 450 nm, alebo ak áno, musíte ju zmerať, aby ste ju mohli odpočítať od vášho celkového spektra, aby ste získali podiel proteínu na celkovej fluorescencii.

Pre 1 zaznamenajte fluorescenčné emisné spektrá proteínu bez denaturačného činidla, ale ako funkciu koncentrácie ligandu (rozsah niekoľkých rádov) a zistite, či sa vlnová dĺžka maximálnej emisie mení s väzbou ligandu (môže sa zmeniť, čo znamená, že rovnaký test môže výnosové väzbové krivky a hodnoty Kd pre vaše ligandy, čo môže byť tiež užitočné!). Úplné titračné krivky ligandu by boli najrobustnejšou kontrolou, ale môžete jednoducho použiť rovnaké koncentrácie ligandu, aké sa používajú v denaturačných experimentoch.

Pre 2 by bol najjednoduchší prípad, že vaše ligandy nie sú fluorescenčné, ale nemôžete to jednoducho predpokladať. Preto je dôležitou kontrolou, ktorú tiež potrebujete, je zaznamenať emisné spektrá pre každý z vašich ligandov pri koncentráciách použitých v denaturačných experimentoch, a to pri každej koncentrácii denaturačného činidla (alebo jednoducho pri 0 a maximálnej koncentrácii: ak medzi nimi nie je rozdiel. dve spektrá, nemusíte zaznamenať jedno pri každej koncentrácii medzi nimi). Ak ligandy vyžarujú fluorescenciu medzi 300 a 450 nm, musíte ju odpočítať od vášho celkového spektra, aby ste získali fluorescenciu pochádzajúcu iba z proteínu.


Šiesta kapitola - Kvantové skladanie proteínov ☆

Aby sa vytvoril základný rámec pre pochopenie biomolekúl z prvého princípu kvantovej mechaniky, rukopis skúma prácu autorskej skupiny o skladaní proteínov a RNA, aby preukázal existenciu spoločného kvantového mechanizmu pri konformačnom prechode biomolekúl. Na základe všeobecnej rovnice konformačno-prechodovej rýchlosti sa odvodzuje niekoľko teoretických výsledkov a porovnáva sa s experimentálnymi údajmi prostredníctvom bioinformatických metód. Hlavné výsledky, ktoré sme získali, sú: Odvodila sa závislosť rýchlosti skladania proteínu od teploty a od koncentrácie denaturačného činidla a porovnala sa s experimentálnymi údajmi. Kvantitatívny vzťah medzi rýchlosťou skladania proteínu a číslom torzného módu (alebo dĺžkou reťazca) je odvodený a získaný vzorec možno použiť aj na skladanie RNA. Kvantová teória prechodu dvojstavového proteínu je úspešne zovšeobecnená na viacstavové skladanie proteínov. Potom sa diskutuje o tom, ako vykonať priame experimentálne testy na kvantovú vlastnosť konformačného prechodu biomolekuly, čo zahŕňa štúdium fotoskladania proteínov a pozorovanie fluktuácie intenzity fluorescencie emitovanej z udalosti skladania/rozbaľovania proteínu. Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že kvantová mechanika poskytuje zjednocujúce a logicky jednoduché teoretické východisko pri štúdiu konformačnej zmeny biologických makromolekúl. Očakávajú sa ďalekosiahle výsledky v praktickej aplikácii teórie.


Skladanie a stabilita bielkovín pomocou denaturantov

Merania skladania proteínov a termodynamickej stability poskytujú pohľad na sily a energetiku, ktoré určujú štruktúru, a môžu informovať o organizácii proteínovej domény, medzidoménových interakciách a účinkoch mutácií na štruktúru. Táto kapitola popisuje metódy, teóriu a analýzu údajov pre najdostupnejšie prostriedky na určenie termodynamiky skladania proteínov: chemickú denaturáciu. Témy zahŕňajú celkové vlastnosti reakcie skladania, pokroky v prístrojovom vybavení, optimalizáciu čistoty činidiel, mechanické modely na analýzu a štatistickú a štrukturálnu interpretáciu prispôsobených termodynamických parametrov. Príklady, v ktorých merania stability poskytli pohľad na štruktúru a funkciu, budú prevzaté zo štúdií o signálnej dráhe Notch v laboratóriu autora. Dúfame, že táto kapitola umožní molekulárnym, bunkovým a štrukturálnym biológom vykonať presné merania stability proteínov a tiež poskytne silný základ pre študentov biofyziky, ktorí chcú uskutočniť experimentálne štúdie skladania proteínov.


Výsledky

Účinky mutácií na konformácie apoCopC

Ako je znázornené na obrázku 1, zložený CopC (apoCopC a rôzne mutanty) vykazuje negatívny CD signál okolo 210 až 220 nm, čo je charakteristika štruktúry β-listu. Ďaleké UV CD spektrá týchto piatich proteínov sú podobné, čo naznačuje, že štyri mutácie nespôsobili žiadne významné zmeny v sekundárnych štruktúrach. Hoci štruktúra proteínu neprešla veľkými zmenami, mali by sa analyzovať jemné zmeny. Údaje z CD odhalili, že obsah listu β (Y79F, Y79W) sa znížil o 11 a 8 % v porovnaní s apoCopC, v danom poradí [obr. 1 (A)]. Podobne, obsah β listov pre Y79WW83L vykazoval stratu 5 %, zatiaľ čo pre Y79WW83F sa zvýšil o 2 % v porovnaní s Y79W, ako je znázornené na obrázku 1 (B).

Ďaleko-UV CD spektrá proteínu (25 μM) (A: apoCopC, Y79F a Y79W) (B: ​​Y79W, Y79WW83L a Y79WW83F) s použitím kremenných článkov s dĺžkou dráhy 1 mm v 2 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C. [Farebný obrázok si môžete pozrieť v online vydaní, ktoré je k dispozícii na http://wileyonlinelibrary.com.]

Emisné fluorescenčné spektrá

Na posúdenie vplyvu mutácie na fluorescenčné charakteristiky proteínu sme analyzovali ich emisné spektrá pomocou fluorescenčnej spektroskopie. Mutantné proteíny vykazovali jemný posun v emisnej vlnovej dĺžke, čo naznačuje, že polarita mikroprostredia okolo Trp sa trochu zmenila, ale stále boli hydrofóbne. Ako je znázornené na obrázku 2 (A), emisné maximum Y79W bolo 325 nm a emisné maximum Y79F bolo 320 nm. Pre Y79WW83L a Y79WW83F, ako je znázornené na obrázku 2 (B), boli emisné maximá 331 a 328 nm. Pre apoCopC a Y79F bol jediný Trp umiestnený na pozícii 83. Avšak pre Y79WW83L a Y79WW83F bol jediný Trp umiestnený na pozícii 79. Parametre fluorescencie zvyškov Trp sú citlivé na prostredie (na životné prostredie citlivé fluorofóry). Emisné maximum fluorescenčného spektra Trp závisí od vlastností prostredia okolo zvyškov Trp v proteínoch. Vysvetlením bolo, že mikroprostredie okolo Trp83 bolo iné ako okolo Tyr79.

Emisné fluorescenčné spektrá (A: apoCopC (1), Y79F (2) a Y79W (3)). (B: apoCopC (1), Y79WW83F (2) a Y79WW83L (3)), excitované pri 295 nm v 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C.

Účinky mutácií na väzbovú kapacitu Cu(II)

Proteín apoCopC je malá rozpustná molekula (10,5 kDa) s β-valcovou štruktúrou, ktorá má dve odlišné miesta viažuce meď, ktoré sú vysoko špecifické pre Cu(I) a Cu(II). Na preskúmanie účinkov mutácií na funkciu proteínov sa uskutočnil experiment na proteínoch v kombinácii s meďou. Titrácia proteínov s Cu(II) zháša intenzitu fluorescencie lineárne, kým sa nenaviaže 1 ekv. Cu(II), ako je znázornené na obrázku 3 (A). Intenzita fluorescencie klesla o 60 % pre Y79F a apoCopC. Intenzita sa však znížila o 40 % pre Y79WW83L a Y79WW83F, čo naznačuje, že fluorescencia bola zhášaná Cu(II) vo veľkej miere, keď bol Trp v proteíne umiestnený v polohe 83. Tento výsledok môže byť spôsobený skutočnosťou, že miesta viažuce meď umiestnené na N-konci a Trp83 boli bližšie k miestam viažucim meď ako Trp79. Jobov graf je znázornený na obrázku 3 (B), na ktorom intenzita fluorescencie pri 320 nm klesala lineárne v dvoch smeroch a stechiometria väzby Cu(II) s Y79F bola 1:1. Keď [Cu(II)]/([Cu(II)]+[Y79F]) π,5, intenzita fluorescencie bola pozorovaná z voľného Y79F a Cu(II)-Y79F. Keď však [Cu(II)]/([Cu(II)]+[Y79F]) 𢙐.5, intenzita fluorescencie bola pozorovaná len z Cu(II)-Y79F a obsah Cu(II) -Y79F sa znížil so znížením koncentrácie Y79F.

A: Fluorescenčné spektrá Y79F (50 µM) pri rôznych koncentráciách Cu(II) v 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C. Koncentrácia Cu2+ od a do i je 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 60 µM, resp. B: Jobov graf intenzity fluorescencie pri 320 nm proti [Cu(II)]/([Cu(II)]+[Y79F]) v 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C. Súčet koncentrácie Y79F a Cu(II) je 2,0 × 10 𢄦 M a [Cu(II)]/([Cu(II)]+[Y79F]) je 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 a 1,0, v tomto poradí. C: Titračná krivka Y79F pomocou Cu(II) (a) alebo Cu(II)-EDTA (1:0,5) (b).

Na výpočet väzbových konštánt medzi Cu (II) a mutantmi sme použili EDTA ako kompetitívny ligand. Intenzita fluorescencie (Fhodnoty pri 320 nm boli odvodené z titrácie Y79F s EDTA-Cu(II) a titračné krivky boli pripravené vynesením F proti [Cu(II)] [obr. 3 (C)]. Za predpokladu, že pokles intenzity fluorescencie pri danom [Cu(II)] sa pripisuje zmene Cu(II)-Y79F na Cu(II)-EDTA, väzbovú konštantu možno vypočítať pomocou vzorcov (1) až (7) (Pozrite si podporné informácie). Konštanty ostatných mutantov možno získať rovnakým spôsobom. Väzbové konštanty Cu(II) a proteínov sú uvedené v tabuľke I. Údaje ukázali, že väzbová schopnosť Cu(II) nebola ovplyvnená mutáciami.

Tabuľka I

Väzbové konštanty Cu(II) a proteínov

ProteínK (M 𢄡 )R 2
apoCopC(2,24 ± 0,36) × 10 14 0.97
Y79F(0,19 ± 0,04) × 10 14 0.94
Y79W(1,53 ± 0,16) × 10 14 0.98
Y79WW83L(0,31 ± 0,03) × 10 14 0.98
Y79WW83F(0,28 ± 0,42) × 10 14 0.96

Životnosť fluorescencie apoCopC a jeho mutantov

Skúmanie vnútornej fluorescencie z proteínu je účinnou metódou na štúdium konformačnej dynamiky proteínov. CopC má jeden zvyšok Trp, takže bol študovaný s použitím jedného zvyšku Trp ako vlastného fluorofóru. Indolový dvojitý krúžok má dvojitú fyzickú povahu. Tento kruh má veľký hydrofóbny van der Waalsov povrch, ale má vysoko polárnu NH skupinu. Pre �xponované” tryptofyly je najvýhodnejšia situácia, keď je indol čiastočne pochovaný vo svojom benzolovom kruhu a interaguje s vodou prostredníctvom svojej NH skupiny. Podľa modelu navrhnutého Bursteinom 27 fluorescenčné vlastnosti zvyškov Trp v proteínoch naznačujú existenciu troch diskrétnych spektrálnych tried: jedna je ukrytá v nepolárnych oblastiach proteínu (λem = 330� nm, τ = 2,1 ns) a dva na povrchu. Jeden z nich je úplne vystavený vode (λem = 350� nm, τ = 5,4 ns), zatiaľ čo druhý je v obmedzenom kontakte s vodou, ktorá je pravdepodobne imobilizovaná väzbou na makromolekulárnom povrchu (λem = 340� nm, τ = 4,4 ns). Fluorescenčný rozpad CopC a jeho mutantov v 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C sú znázornené na obrázku 4. Obrázok 4 (A) ukazuje rozpady apoCopC, Y79F a Y79W, pričom ich životnosť bola odlišná, hoci fluorescenčné spektrum pre Y79F bolo rovnaké ako pre apoCopC. Podobne obrázok 4 (B) ukazuje rozpady apoCopC, Y79WW83L a Y79WW83F. Životnosť Y79WW83L a Y79WW83F bola dlhšia ako životnosť apoCopC. Pre apoCopC bol jediný Trp umiestnený na pozícii 83, zatiaľ čo jediný Trp pre Y79WW83L a Y79WW83F bol umiestnený na pozícii 79. Inými slovami, životnosť Trp v proteínoch sa zvyšuje spôsobom závislým od polohy zvyšku Trp. Z hodnôt životnosti uvedených v tabuľke II predpokladáme, že exponovaný stupeň Tyr79 v hydrofilnom prostredí je viac zvýšený v porovnaní s Trp83. Výsledky sa zhodovali s údajmi z fluorescenčných emisných spektier. Y79W má dve životnosti, čo naznačuje, že prostredia okolo týchto dvoch zvyškov Trp sú odlišné. Jeden zvyšok bol umiestnený v hydrofóbnom prostredí, zatiaľ čo druhý bol umiestnený v relatívne hydrofilnom prostredí.

Tabuľka II

Fluorescenčné parametre apoCopC a jeho mutantov

ProteínAmplitúda (Bi)Život, τi (ns)χ 2
apoCopC0.0921.851.079
Y79F0.0653.691.018
Y79W0.040, 0.0431.67, 4.651.060
Y79WW83L0.0555.191.117
Y79WW83F0.0634.721.079

Fluorescencia sa rozkladá [A: apoCopC (a), Y79F (b) a Y79W (c)]. [B: ApoCopC (a), Y79WW83F (b) a Y79WW83L (c)] v 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C.

Kalenie akrylamidu a KI

Fluorescenčné zhášadlá sa široko používajú pri štúdiu relatívnej dostupnosti fluorescenčných skupín v proteínoch. KI a akrylamid sú univerzálne tlmiace činidlá. Kalenie akrylamidu je veľmi citlivé na stupeň dostupnosti Trp pre rozpúšťadlo obsahujúce akrylamid. Vzhľadom na to, že akrylamid môže difundovať do vnútra proteínu, dostupnosť akrylamidu môže vyplývať z existencie kanálov vedúcich do vnútra proteínu. Jodidový ión je hydratovaný a je obmedzený svojou veľkou veľkosťou a nábojom na zhášanie zvyškov Trp ležiacich na povrchu proteínov alebo blízko neho. 28 Zhášanie fluorescencie proteínu Trp pomocou KI zahŕňa mechanizmus zhášania kolízie. 29 Eftink a Ghiron 30 to oznámili KSV odvodené zo sklonu Stern–Volmerovho grafu, možno v skutočnosti považovať za hrubý odhad dostupnosti zvyškov Trp v proteínoch. Stern–Volmerove grafy pre KI zhášanie fluorescencie proteínov, s fluorescenčnou emisiou monitorovanou pri 320 nm, sú znázornené na obrázku 5 (A). Paralelné zhášacie experimenty sa uskutočnili s akrylamidom, polárnou, nenabitou molekulou rozpustnou vo vode, ktorá môže preniknúť do proteínovej matrice ako funkcia veľkosti a dynamiky proteínu. 31 Lineárne Stern–Volmerove grafy F0/F oproti koncentrácii akrylamidu sú znázornené na obrázku 5 (B). Analýzy parametrov zhášania získané zo Stern–Volmerových grafov sú uvedené v tabuľke III. Zoznam údajov v tabuľke III ukazuje, že stupeň ochladzovania akrylamidom je výrazne vyšší ako stupeň zhášania KI. Tento jav naznačuje, že Trp je hlboko pochovaný v proteíne a akrylamid, neutrálny tlmič, má k Trp ľahký prístup. Okrem toho, stupeň zhášania pre Trp nachádzajúci sa na 79 bol väčší ako stupeň umiestnený na 83, čo je v súlade so záverom odvodeným z KI.

Stern–Volmerove grafy zhášania jodidu (A) a akrylamidu (B) apoCopC (х), Y79W (☆), Y79F (•), Y79WW83F (&x025b&#), Y79WW83F (Ȼ&#) ) za 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C.

Tabuľka III

Stern–Volmerove konštanty apoCopC a jeho mutantov s použitím rôznych zhášačov

KSV (M 𢄡 )
ProteínakrylamidKI
apoCopC12,45 ± 0,363,62 ± 0,24
Y79F15,91 ± 0,196,12 ± 0,28
Y79W20,83 ± 0,349,15 ± 0,20
Y79WW83F15,61 ± 0,366,54 ± 0,12
Y79WW83L18,53 ± 0,297,31 ± 0,27

GdnHCl/močovina indukované rozvinutie apoCopC a jeho mutantov

Denaturačné činidlo sa vzťahuje na činidlo, ktoré znižuje stabilitu proteínu a vedie k štrukturálnej zmene z jeho špecifickej, kompaktnej a trojrozmernej štruktúry do nezvinutého stavu. Z hľadiska štruktúry sú močovina a GdnHCl veľmi podobné, ale GdnHCl je kladný ión. Preto sa môžeme domnievať, že GdnHCl, ktorý vedie k vzniku nabitých druhov vo vode, by mohol účinne interferovať s priaznivými elektrostatickými interakciami medzi nabitými skupinami na povrchu proteínu.Molekulárne mechanizmy denaturácie GdnHCl a močoviny sú odlišné 32 – 36 a skríning priaznivých elektrostatických interakcií na povrchu globulárnych proteínov môže byť jediným skutočným rozdielom medzi týmito dvoma denaturantmi.

Termodynamická stabilita apoCopC a jeho mutantov bola testovaná v experimentoch s rozvinutím vyvolaným GdnHCl/močovinou v 10 mM Hepes, pH 7,4, pri 25�°C. V proteínoch je Trp vysoko citlivý na polaritu okolitého prostredia. Natívny apoCopC vykazoval maximálnu emisiu pri 320 nm. V 3M GdnHCl, spektrá zostali podobného tvaru, ale emisné maximum sa posunulo z 320 na 350 nm, čo zodpovedá fluorescenčnému maximu Trp vo vodnom roztoku. Fluorescenčné spektrá Y79F pri rôznych koncentráciách GdnHCl sú uvedené na podporných informáciách na obrázku S1. Na najlepšie posúdenie tvaru prechodov apoCopC je potrebný pomer intenzít fluorescencie pri 400 a 310 nm (ja400 nm/ja310 nm) bola vynesená ako funkcia koncentrácie denaturačného činidla. Pri nízkej koncentrácii denaturačného činidla bola rozbalovacia frakcia 0, čo naznačuje, že proteín bol v zloženom stave. Rozvinutá frakcia sa zvyšovala s ďalšou akumuláciou denaturačného činidla. Keď koncentrácia dosiahla určitú hodnotu, rozvinutá frakcia bola 1 a proteín sa úplne rozvinul. Krivky rozvinutia mutantov sa získali rovnakým spôsobom. Ako je znázornené na obrázku 6 (A), krivky rozvinutia Y79F, Y79W a apoCopC boli podobné a prechody rozvinutia najlepšie vyhovovali dvojstavovému modelu, stredné body prechodu rozvinutia pre Y79F a Y79W sa posunuli na nižšie koncentrácie GdnHCl. Údaje uvedené v tabuľke V ukazujú, že stability Y79F a Y79W sa znížili a Y79F bol menej stabilný v porovnaní s Y79W. Zodpovedajúce experimenty s rozvinutím močoviny sú znázornené na obrázku 6 (B). Podobne rozvinutie Y79F a apoCopC bolo rovnaké ako vyššie, čo potvrdilo dvojstavové procesy. Je pozoruhodné, že rozvinutie mutantu Y79W indukovaného močovinou najlepšie zapadá do trojstavového modelu. V prechodovej oblasti od 6 do 6,2 bola prítomná malá plošinaM močoviny, čo naznačuje väčšiu populáciu čiastočne zloženého medziproduktu v rámci koncentrácie močoviny. Údaje o vývoji rovnováhy sa riadili trojstavovým modelom so strednými bodmi 4,6 a 7,1M močovina pre prvý a druhý prechod. Podľa modelu konštrukčného prvku môže byť krivka rozvinutia Y79W vybavená kombináciou Y 1 a Y 2 (pozri analýzu údajov o denaturácii v podporných informáciách obr. S2). Termodynamické parametre rozvinutia proteínov indukovaného močovinou a GdnHCl sú uvedené v tabuľkách IV a ​ a V, V, v tomto poradí.

GdnHCl (A a C) alebo močovina (B a D) indukovali rozvinutie apoCopC a jeho mutantov. Denaturácia proteínu bola monitorovaná fluorescenčnou spektroskopiou. Vzorky pevnej koncentrácie proteínu (2 μM) boli titrované GdnHCl od 0 do 3M a nechali sa rozvinúť počas 30 minút pri 25 °C pred meraním intenzity fluorescencie. Experiment s rozvinutím indukovaný močovinou sa uskutočnil za rovnakých podmienok.

Tabuľka IV

Termodynamické parametre apoCopC a jeho mutantov z rozvinutia indukovaného močovinou pri pH 7,4, 25ଌ

ProteínParametreF (I/U)ja (U)G 0 element> (kJ/mol)Δ<ΔG 0 element> (kJ/mol)
apoCopC[D]1/2 (M)5.68
m (kJ/M/mol)4,36 ± 0,05 24.350
ΔG 0 i (kJ/mol)24,35 ± 0,35
Y79XY79F[D]1/2 (M)4.13
m (kJ/M/mol)3,80 ± 0,02 17.84𢄦.51
ΔG 0 i (kJ/mol)17,84 ± 0,82
Y79W[D]1/2 (M)4.67.1
m (kJ/M/mol)4,08 ± 0,046,78 ± 0,1322.32𢄢.03
ΔG 0 i (kJ/mol)18,86 ± 0,1848,61 ± 0,08
Y79W[D]1/2 (M)4.67.1
m (kJ/M/mol)4,08 ± 0,046,78 ± 0,1322.320
ΔG 0 i (kJ/mol)18,86 ± 0,1848,61 ± 0,08
W83LY79WW83L[D]1/2 (M)3.00
m (kJ/M/mol)3,62 ± 0,06 10.88�.44
ΔG 0 i (kJ/mol)10,88 ± 0,21
Y79WW83F[D]1/2 (M)4.27.2
m (kJ/M/mol)4,88 ± 0,024,76 ± 0,0324.141.82
ΔG 0 i (kJ/mol)20,55 ± 0,1033,70 ± 0,18

Tabuľka V

Termodynamické parametre apoCopC a jeho mutantov z GdnHCl-indukovaného rozvinutia pri pH 7,4, 25ଌ

ProteínParametreF (I/U)ja (U)G 0 element> (kJ/mol)Δ<ΔG 0 element> (kJ/mol)
apoCopC[D]1/2 (M)1.55
m (kJ/M/mol)16,16 ± 0,22 24.980
ΔG 0 i (kJ/mol)24,98 ± 0,31
Y79XY79F[D]1/2 (M)0.99
m (kJ/M/mol)17,30 ± 0,39 17.04𢄧.94
ΔG 0 i (kJ/mol)17,04 ± 0,38
Y79W[D]1/2 (M)1.33
m (kJ /M/mol)15.13 ± 0.11 20.16𢄤.82
ΔG 0 i (kJ/mol)20,16 ± 0,13
Y79W[D]1/2 (M)1.33
m (kJ/M/mol)15.13 ± 0.11 20.160
ΔG 0 i (kJ/mol)20,16 ± 0,13
W83XY79WW83L[D]1/2(M)0.64
m (kJ/M/mol)16,92 ± 1,19 10.75𢄩.41
ΔG 0 i (kJ/mol)10,75 ± 0,74
Y79WW83F[D]1/2 (M)1.161.54
m (kJ/M/mol)17,79 ± 0,2217,04 ± 0,7323.583.42
ΔG 0 i (kJ/mol)20,65 ± 0,2326.27 ± 1.32

Obrázok 6 (C,D) sa získal použitím metód na obrázku 6 (A,B). Naproti tomu krivka rozvinutia Y79W bola pridaná na obrázok 6 (C, D), na ktorom rozvinutie Y79WW83L najlepšie vyhovovalo dvojstavovému modelu indukovanému močovinou alebo GdnHCl. Dve stavové krivky rozvinutia poskytli stredy 0,64M GdnHCl a 3M močovina pre Y79WW83L [obr. 6 (C,D)]. Stredný bod prechodu pre Y79WW83L bol oveľa menší ako pre Y79W. Je zaujímavé, že prebiehajúce experimenty s Y79WW83F odhalili určité rozdiely. Zdá sa, že krivky rozvinutia získané pre Y79WW83F zahŕňajú dva postupné prechody (pozri analýzu údajov o denaturácii v podporných informáciách, obr. S3 a S4). Tento výsledok naznačuje, že rovnovážne rozvíjajúce sa reakcie majú tri stavy. Krivka rozvinutia Y79WW83F indukovaná GdnHCl ukázala, že stred prvého prechodu bol 1,16M, zatiaľ čo hodnota druhého prechodu bola 1,54M GdnHCl [obr. 6 (C)]. Podobne ako GdnHCl, rozvinutý prechod indukovaný močovinou mal tri stavy so stredným bodom prechodu 4,2M močovina pre prechod z natívneho na stredný a stredný bod 7,2M močovina pre prechod do rozvinutého prechodu [obr. 6 (D)]. Termodynamické parametre rozvinutia proteínov indukovaného močovinou a GdnHCl sú uvedené v tabuľkách IV a ​ a V, V, v tomto poradí.

Obrázok 6 a tabuľky IV a ​ a V V ukazujú, že stability apoCopC, Y79W a Y79F sledovali sériu apoCopC>Y79W>Y79F. Rozdiel medzi týmito tromi proteínmi bol len v 79. aminokyseline. Schopnosti tvorby vodíkových väzieb postupne klesali, čo odhalilo, že schopnosť 79. amínovej kyseliny vytvárať H-väzby má dôležitú úlohu pri udržiavaní štruktúry apoCopC. Stability Y79W, Y79WW83L a Y79WW83F nasledovali sériu Y79WW83F>Y 79W>Y79WW83L. Nahradenie Trp83 Phe a Leu vyvolalo úplne opačný účinok, čo naznačuje, že aromatický kruh Trp83 bol dôležitý pri udržiavaní hydrofóbneho jadra apoCopC.


Výsledky

Na zvýšenie objemu vnútorných dutín proteínu (obr. 1, Hore v ľavo) (10, 11), bolo vytvorených 10 variantov veľmi stabilného variantu SNázy označovaného ako Δ + PHS (11,8 kcal/mol pri 298 K (10), v porovnaní s 5,4 kcal/mol pre WT SNase), so substitúciami vnútorné pozície do Ala na vytvorenie ďalších vnútorných dutín.

Štruktúry A + PHS SNázy a varianty obsahujúce dutinu. Ľavý panel, od Hore do Spodná časť: Štruktúra Δ + PHS SNázy (3BDC) s C α polohy 10 variantov obsahujúcich dutinu označených červenými guľôčkami a s povrchovou reprezentáciou centrálnej dutiny fialovou. Objem dutiny sa vypočítal pomocou gule 1,1 Á a McVol (11). Štruktúry dutinových mutantov L125A (3NXW), I92A (3MEH) a V66A (3NQT) so skonštruovanými dutinami zelenou farbou a mutovaným zvyškom červenou farbou. Pravý panel: Odhad hustoty dutín (Hore) a hustota hydratácie (Spodná časť) pre každé C α polohu referenčného proteínu A + PHS. Pozri Materiály a metódy SI v Príloha SI a (9) podrobnosti týkajúce sa výpočtu pórovitosti a hustoty hydratácie. Stručne povedané, 1 000 konfigurácií vyplývajúcich z 10 ns celoatómovej MD simulácie v explicitnom rozpúšťadle bolo podrobených bodovému oversamplingu Monte Carlo. Všetky body, ktoré spadali do štruktúry a nie na atóm rozpúšťadla alebo proteínu, boli spočítané ako hustota dutín. Hustota vody sa vypočítala ako počet atómov kyslíka molekúl vody v rámci 5 Á od každého C α uhlík, normalizovaný na najväčší počet nájdený pre C α uhlíka.

Kryštálové štruktúry.

Kryštálové štruktúry všetkých variantov, riešené pri 1 atm, ukázali, že substitúcie viedli k vytvoreniu vnútorných dutín v zloženom stave. Štruktúry boli medzi sebou navzájom veľmi podobné a štruktúre Δ + PHS (obr. 1 a obr. S1 a tabuľka S1 v Príloha SI), hlavným rozdielom je buď zväčšenie prirodzene sa vyskytujúcej mikrodutiny, alebo zavedenie novej dutiny. V žiadnej z dutín neboli pozorované žiadne vnútorné molekuly vody, dokonca sa nenašla ani stopa elektrónovej hustoty.

Simulácie molekulárnej dynamiky.

Pretože dutiny môžu byť prechodne hydratované alebo vyplnené prostredníctvom dynamickej reorganizácie bočného reťazca, pretrvávanie prirodzene sa vyskytujúcej dutiny v referenčnom proteíne Δ + PHS sa skúmalo pomocou simulácií molekulárnej dynamiky (MD) v explicitnom rozpúšťadle (Materiály a metódy SI v Príloha SI). Hustota prázdnoty a hydratácie na každom C α (obr. 1, Správny), definovaný ako počet bodov Monte Carlo (normalizovaný na maximum pre všetky C α atómy), ktoré by mohli byť vložené do 5 Á od svojej polohy a počet atómov kyslíka vody (normalizovaný na maximálny počet) do 5 Á, v tomto poradí, podporujú názor, že dokonca aj prirodzene sa vyskytujúca mikrodutina pozorovaná v štruktúre proteínu divokého typu je prítomná a dehydratovaná aj po dynamickej reorganizácii a prechodnej hydratácii.

Rozvíjanie rovnováhy monitorované Trp fluorescenciou.

Rozvíjanie tlaku monitorované fluorescenciou Trp-140 (12) (obr. 2A a Obr. S2 in Príloha SI) odhalili, že všetky varianty s upravenými dutinami vykazovali výrazne väčšie hodnoty zdanlivej zmeny objemu po rozvinutí ΔVu( = -AVf) ako proteín A + PHS (obr. 2 A a B a Tabuľka 1). Stredné body rozvinutých profilov sa posunuli na nižšie tlaky so zvyšujúcim sa GuHCl, ale sklony neboli ovplyvnené, čo naznačuje, že denaturant destabilizoval proteín bez akéhokoľvek účinku na AVu.

Rozvíjanie tlaku monitorované fluorescenciou Trp. (A) Profil vlnovej dĺžky priemernej emisie vysokotlakovej fluorescencie pre (Ľavý panel) Variant Δ + PHS pri 2,0 M (kruh), 2,3 M (trojuholník) a 2,6 M (štvorec) GuHCl a (Pravý panel) I92A dutinový mutant pri 0,8 M (kruh), 1,0 M (trojuholník) a 1,2 M (štvorec) GuHCl. (B) Zmena sklopného objemu, ΔVf( = -AVu) hodnoty získané z analýzy profilov rozvinutia fluorescencie pri vysokom tlaku pre A + PHS a 10 variantov obsahujúcich dutinu za predpokladu dvojstavového modelu. Prerušovaná čiara označuje hodnotu pre proteín A + PHS použitý ako referenčný. Merania sa uskutočňovali v prítomnosti guanidíniumchloridu (GuHCl), aby sa zabezpečilo úplné rozvinutie v rozsahu tlaku použitého prístrojového vybavenia (< 3 kbar).


Výsledky

Ďaleko-UV CD spektrá a analýza sekundárnej štruktúry

Ďaleko-UV CD spektrá MixH a PrgI (obr. 2 𠂲)) ukazujú, že majú podobnú sekundárnu štruktúru s vysokým helikálnym obsahom. Dekonvolúcia a analýza spektier pomocou Dichrowebu (Whitmore a Wallace 2004) naznačujú, že Prgl obsahuje viac špirály ako MxiH (tabuľka 1 ​ 1). ). Pri 10ଌ má rekombinantne exprimovaný MxiH malý 㹐% α-helikálny obsah a

20% β-listu, zatial co PrgI ma takmer 70%α-helix a

10%β-list. Okrem toho sa zdá, že MxiH má viac náhodnú a obratovú štruktúru ako jeho Salmonella homológ. Zdá sa, že pri teplotách tak nízkych ako 25ଌ oba proteíny strácajú značné množstvo sekundárnej štruktúry, najmä s ohľadom na helikálny obsah (tabuľka 1 ​ 1). ). To naznačuje, že oba proteíny môžu byť relatívne nestabilné (pozri nižšie).

Stôl 1.

Súhrn výsledkov z dekonvolúcie ďalekého UV CD spektier na rôzne zložky sekundárnej štruktúry v MxiH a PrgI

Uvedené hodnoty sú percentá z celkovej štruktúry s odhadovanou neistotou 2,3 ​​%.

Ďaleko-UV CD spektrá pre MxiH a Prgl pri 10 °C pri koncentrácii proteínu 50μM s použitím bunky s dĺžkou 0,01 cm. Kruhy znázorňujú spektrum pre MxiH a trojuholníky znázorňujú spektrum PrgI. Zobrazené údaje sú v priemere väčšie alebo rovné dvom pokusom.

Tepelne indukované rozvinutie monitorované CD a UV absorbančnou spektroskopiou druhého derivátu

Na preskúmanie relatívnej stability MxiH a Prgl sa oba proteíny skúmali ako funkcia teploty. Každý demonštruje 㺐% reverzibilitu tepelného rozvinutia po zahriatí na 90 °C, ako je monitorované CD (obr. 3 ​ 3)) a UV absorbančnou spektroskopiou (obr. 4 ​ 4, 5 ​ 5). ). Analýza kriviek rozvinutia CD na obrázku 3 𠂳 poskytuje približnú hodnotu Tm 42 °C a 37,5 °C pre MxiH a Prgl, v danom poradí. Zodpovedajúco takmer na nerozoznanie ΔH sú viditeľné hodnoty 22,3 a 23,9 kcal/mol.

Tepelné rozvinutie MxiH (A) a PrgI (B), ako je monitorované CD. Plné čierne stopy predstavujú rozvinutie a prerušované čiary rozvinutie proteínov predtým zahriatych na 㺐ଌ a potom ochladených.

Tepelné rozvinutie MxiH monitorované UV absorbančnou spektroskopiou. Údaje sú odvodené z druhých derivátov UV spektier ako funkcie teploty. Vrcholy 1, 2, a 3 predstavujú príspevky z vrcholov Phe 3, 4, a 5 z Tyru a vrchov 5 a 6 z Trp. (Píky 3 a 5 sú kombinované vrcholy.) Čiara v údajoch pre vrcholy 4 a 5 je prispôsobenie dvojstavového rozvíjajúceho sa modelu k údajom.

Tepelné rozvinutie Prgl monitorované UV absorbanciou. Údaje sú odvodené z druhých derivátov UV spektier pri rôznych teplotách, ako je opísané v legende k obrázku 4𠂴.

Na preskúmanie účinkov tepelného namáhania na terciárnu štruktúru sa použila UV absorpčná spektroskopia druhého derivátu s vysokým rozlíšením. Táto technika má tú výhodu, že tri rôzne typy aromatických zvyškov majú tendenciu byť rozptýlené nerovnomerne vo väčšine proteínových štruktúr, čím poskytuje trochu iný pohľad na správanie proteínu ako vnútorná fluorescenčná spektroskopia, ktorá sa v tomto prípade spolieha na zmeny v jednom zvyšku Trp ( Pozri nižšie). Spektrum druhého derivátu s vysokým rozlíšením ihlových proteínov pozostáva zo šiestich píkov (nie je znázornené). Vrcholy 1, 2 a 3 predstavujú príspevky od Phe 4 a 5, od Tyr a 5 a 6 od Trp (vrchol 5 je kombinovaný vrchol) (obr. 4 ​ 4, , 5 ​ 5). ). Tri Phe a najvyššia vlnová dĺžka píkov Trp ukazujú málo dôkazov pre dobre definované tepelné prechody pre oba proteíny. Naproti tomu vrcholy Tyr vykazujú typické krivky tepelného rozloženia. Za predpokladu dvojstavového modelu rozkladania sa profily Tyr poddali Tm a zodpovedajúce ΔH hodnoty, ktoré sú v medziach chýb podobné tým, ktoré sa pozorovali v štúdiách CD (tabuľka 2 𠂲).

Tabuľka 2

Súhrn termodynamických parametrov extrahovaných z analýzy tepelne indukovaných kriviek rozvinutia monitorovaných pomocou CD a UV absorbančnej spektroskopie druhého derivátu

UV
CDTmΔH
ProteínTmΔHVrchol 4Vrchol5Vrchol 4Vrchol5
MxiH42 ± 0.122.3 ± 2.148,0 ± 2,342,7 ± 2,328.8 ± 3.024.9 ± 1.9
PrgI37,5 ± 0,523,9 ± 0,436,0 ± 3,435.7 ± 4.822.0 ± 7.626.0 ± 1.1

Všetky Tm uvádzané hodnoty sú v jednotkách ଌ a hodnoty entalpie sú v kcal/mol. Zobrazené hodnoty sú ± štandardná chyba s n = 2 alebo 3.

Optická hustota roztoku sa tiež monitorovala pri 350 nm ako funkcia teploty na hľadanie makroskopickej agregácie. Pri zvyšovaní teploty nebolo pozorované žiadne zistiteľné zvýšenie optickej hustoty (nezobrazené). Pozorované tepelné prechody teda nevedú k detegovateľnej agregácii v súlade s ich reverzibilitou.

Močovinou indukované rozvinutie monitorované pomocou CD

Na ďalší prístup k stabilite týchto proteínov sa uskutočnili štúdie rozbaľovania močoviny s použitím vlastného CD signálu proteínov pri 222 nm, aby sa monitorovali zmeny v sekundárnej štruktúre ako funkcia koncentrácie močoviny. Krivky rozvinutia, ako je vidieť na obrázku 6 ​ 6, ukazujú určitý stupeň kooperativity (10ଌ) (obr. 6A1,A2 ​ 6A1,A2), ), ktorý sa zmenšuje so zvyšujúcou sa teplotou (25ଌ ) (obr. 6B1,B2 ​ 6B1,B2). ). Hyperbolická povaha rozvinutých kriviek pri 25ଌ, na rozdiel od sigmoidnejšej krivky pozorovanej pri experimentoch pri nižších teplotách, naznačuje stratu kooperativity. Z údajov o rozvinutí močoviny, vnútornej voľnej energie rozvinutia (ΔG°0,un) a ich závislosť od koncentrácie denaturačného činidla (m-hodnoty) proteínov sa vypočítali pomocou nelineárnej analýzy najmenších štvorcov pre dvojstavový rozkladový prechod. Tieto výsledky sú uvedené v tabuľke 3 ​ 3. . Výsledky ukazujú, že MxiH je o niečo stabilnejší ako PrgI a má tiež vyšší m-hodnota, čo naznačuje, že väčšia plocha povrchu MxiH je vystavená počas rozvinutia ako počas rozvinutia Prgl.

Tabuľka 3.

Súhrn výsledkov z dvojstavovej analýzy močovinou indukovaného rozvinutia MxiH a PrgI pri 10ଌ a 25ଌ

10ଌ25ଌ
ProteínΔG°0,un (kcal/mol 1− )m (kcal/mol 𢄡 M 𢄡 )ΔG°0,un (kcal/mol 𢄡 )m (kcal/mol 𢄡 M 𢄡 )
MxiH1,62 ± 0,010,82 ± 0,020,89 ± 0,160,69 ± 0,00
PrgI1,19 ± 0,030,77 ± 0,010,44 ± 0,020,62 ± 0,02

Hlásené chyby sú štandardné chyby (s n=2). Voľná ​​energia rozvíjania (ΔG°0,un) je extrapolovaná voľná energia rozvinutia späť na nulovú koncentráciu denaturačného činidla.

Močovinou indukované rozvinutie MxiH a Prgl monitorované CD pri 222 nm. Panely A1 a A2 zobraziť MxiH a panely B1 a B2 ukážka PrgI. The horný panely (A1,B1) zobraziť údaje získané pri 10ଌ a nižšie panely (A2,B2) ukazujú údaje získané pri 25ଌ.

Vnútorná fluorescencia tryptofánu

Fluorescenčné emisné spektrá MxiH a PrgI (obr. 7 ​ 7) ) vykazujú len veľmi jemné rozdiely s λmax hodnoty 349,5 a 347,5 nm. Tieto hodnoty naznačujú rozsiahlu expozíciu proteínov’ jednotlivého Trp zvyšku rozpúšťadlu. To je v súlade s polohou 290 nm absorpčného píku (vrchol 6 na obr. 4 ​ 4, 5 ​ 5). ). Obe techniky naznačujú, že MxiH indol je o niečo viac exponovaný ako zodpovedajúci zvyšok v Prgl.

Typické normalizované fluorescenčné emisné spektrá MxiH a Prgl (50 μM) v PBS pri pH 7,0. Vzorky boli excitované pri 295 nm a emisia bola monitorovaná od 302 nm do 450 nm. Prgl je znázornený plnou farbou a MxiH je znázornené prerušovanou čiarou.

Močovinou indukované rozvinutie monitorované fluorescenciou Trp (obr. 8 𠂸)) ukazuje lineárnu zmenu fluorescencie Trp so zvýšenou koncentráciou močoviny, so sklonom kriviek pri 0,04 a 0,07 M𢄡 pre MxiH a PrgI, v tomto poradí . Modelové štúdie s derivátom tryptofánu, N-acetyltryptofánamidom (NATA), zistili, že existuje lineárna závislosť fluorescencie indolu od koncentrácie močoviny so sklonom 0,07 M 𢄡 (Eftink 1994). Naše výsledky teda naznačujú, že tu pozorované zmeny vyvolané močovinou sú jednoducho spôsobené priamymi účinkami močoviny na bočné reťazce indolu MxiH a Prgl. Štúdie tepelného rozvinutia založené na fluorescencii ukazujú krivkovú závislosť fluorescencie Trp od teploty (obr. 9 ​ 9). ). Okrem toho sa poloha emisného vrcholu nemení s teplotou, čo podporuje záver, že prostredie Trp sa výrazne nemení.

Močovinou indukované rozvinutie MxiH a Prgl pri 10 °C, ako bolo monitorované Trp fluorescenciou s excitáciou pri 295 nm. Proteíny sa skúmali pri 50 μM. Panely A a B predstavujú MxiH a Prgl so sklonmi 0,05 a 0,07 M𢄡, v tomto poradí.

Krivky tepelného rozloženia MxiH a Prgl, ako sú monitorované fluorescenciou Trp. Panely A1 a A2 predstavujú PrgI, zatiaľ čo panely B1 a B2 predstavujú MxiH. The horný panely (A1,B1) ukazujú intenzitu fluorescenčnej emisie pri 340 nm ako funkciu teploty. The nižšie panely (A2,B2) ukazujú vlnovú dĺžku emisného maxima ako funkciu teploty.

Diferenciálna skenovacia kalorimetria PrgI

Prgl vytvára zreteľnú endotermu DSC s a Tm z 38ଌ a ΔH 27,9 kcal/mol, vo výbornej zhode s výsledkami CD a absorbancie (obr. 10 ​ 10). ). Prekvapivo, z dôvodov, ktoré sú v súčasnosti neznáme, sme nedokázali získať dobre definovanú endotermu DSC pre MxiH, a to ani pri vysokých koncentráciách proteínov.

PrgI DSC endoterma s odčítaním pufra a korekciou základnej línie pri koncentrácii proteínu 1,82 mg/ml. Na prispôsobenie údajov a hodnôt sa použil dvojstavový model rozloženia Tm=38,1ଌ ± 0,3 a ΔH=27,9 kcal/mol ± 0,1. Plná čiara je z reprezentatívneho experimentu, pričom prerušovaná čiara ukazuje analýzu najlepšieho prispôsobenia.


Aplikácia tryptofánového fluorescenčného diagramu maximálnej šírky pásma pri analýze štruktúry monoklonálnych protilátok

Monoklonálne protilátky sa v posledných rokoch stali najrýchlejšie rastúcimi proteínovými terapeutikami. Stabilita a heterogenita jeho fyzikálnych a chemických štruktúr zostáva veľkou výzvou. Fluorescencia tryptofánu sa ukázala ako všestranný nástroj na monitorovanie terciárnej štruktúry proteínov. Modelovaním obálky tryptofánovej fluorescenčnej emisie s log-normálnymi distribučnými krivkami možno kvantitatívne meranie použiť na rutinnú charakterizáciu celkovej terciárnej štruktúry monoklonálnej protilátky. Okrem toho môžu byť výsledky log-normálnej dekonvolúcie prezentované ako dvojrozmerný graf so šírkou pásma tryptofánovej emisie vs. emisné maximum na zvýšenie rozlíšenia pri porovnávaní vzoriek alebo ako funkcia aplikovaných porúch. Demonštrujeme to štúdiom štyroch rôznych monoklonálnych protilátok, ktoré vykazujú rozdiel v grafe s maximálnou šírkou emisného pásma napriek ich podobnosti v celkových aminokyselinových sekvenciách a terciárnych štruktúrach. Táto stratégia sa tiež používa na demonštráciu porovnateľnosti terciárnej štruktúry medzi rôznymi šaržami vyrobenými pre jednu z monoklonálnych protilátok (mAb2). Okrem toho v štúdiách rozvíjajúcich sa prechodov mAb2 ako funkcie koncentrácie guanidín hydrochloridu je možné jasne sledovať vývoj terciárnej štruktúry v grafe maximálnej šírky emisného pásma.

Toto je ukážka obsahu predplatného, ​​prístup cez vašu inštitúciu.


ÚVOD

V našom chápaní mechanizmu skladania a agregácie proteínov in vitro sa dosiahol značný pokrok, čo poskytuje základ na objasnenie patológií nesprávneho poskladania proteínov, ako sú neurodegeneratívne ochorenia – Alzheimerova, Parkinsonova a iné amyloidné ochorenia. 1 Je však potrebné zvážiť zložitosť bunkového prostredia, aby sme mohli čeliť výzvam skladania a nesprávneho skladania proteínov in vivo. 2, 3 Skladanie in vivo sa vyskytuje v preplnenom, priestorovo organizovanom, heterogénnom bunkovom prostredí s množstvom skladacích asistentov, toto prostredie sa výrazne líši od vysoko zriedených roztokov a optimalizovaných pufrov využívaných na štúdie skladania in vitro. Teoretické predpovede, ako aj niektoré prieskumné experimenty naznačujú, že vysoká koncentrácia makromolekúl (350–400 mg/ml) výrazne ovplyvní konformačnú dynamiku a energetiku skladacích polypeptidov, čo uprednostňuje kompaktné stavy. 4, 5 Okrem toho proteíny vychádzajú vektorovo z ribozómu s rýchlosťou porovnateľnou s rýchlosťami pozorovanými pre základné kroky pri skladaní proteínov in vitro, rýchlosť translácie v baktériách je ~10–50 aminokyselín za sekundu a v eukaryotoch 4–5 aminokyselín. kyseliny za sekundu. N-terminálne oblasti rastúceho polypeptidu in vivo teda budú skúmať konformačný priestor predtým, ako sa C-terminálne oblasti objavia z ribozómu. Sekvenčný kód pre skladanie vznikol na základe in vivo selekčných tlakov a musí nevyhnutne odrážať tento vektorový konformačný proces vyhľadávania. Okrem toho molekulárne chaperóny interagujú s veľkou frakciou vznikajúcich a novo syntetizovaných polypeptidov a tieto interakcie môžu ovplyvniť energetickú krajinu pre skladanie. 3 Napriek tomu množstvo dôkazov nahromadených za posledné polstoročie presvedčivo argumentuje, že vnútorná štrukturálna tendencia primárnej sekvencie proteínu obsahuje informácie o jeho prípadnom natívnom zložení. Čo ešte nie je dobre pochopené, je, ako sa táto sekvenčná informácia vyjadruje in vivo.

Hlavné technické výzvy bránia našej schopnosti charakterizovať skladanie proteínov in vivo pomocou širokej škály sofistikovaných prístupov, ktoré boli tak informatívne in vitro. Pozorovania sledovaného proteínu sa musia uskutočňovať pri fyziologických koncentráciách na pozadí všetkých ostatných bunkových zložiek. Kinetické experimenty musia monitorovať populáciu synchronizovaných molekúl v systéme, kde je množstvo reakcií obrovské. V ideálnom prípade sa snažíme pozorovať, ako dochádza k tvorbe štruktúry, aké prechodné stavy navštevuje vznikajúci alebo novo syntetizovaný polypeptid a aké energetické rozdiely existujú medzi dostupnými stavmi. Musíme byť schopní „vidieť“ proteín, ktorý nás zaujíma, v prvom rade, čo vedie k potrebe signálov, ktoré sú pozorovateľné nad bunkovým pozadím. Signál musí informovať o konformačných prieskumoch značeného proteínu. A potom musíme byť schopní manipulovať so systémom, aby sme položili otázky týkajúce sa tvorby štruktúry v proteíne.

Použili sme prevažne β-listový proteín, bunkový proteín viažuci kyselinu retinovú I (CRABP), ktorého skladanie in vitro sme podrobne preskúmali, 6-9 na štúdium skladania a agregácie in vivo. Začlenili sme väzbové miesto (tetra-cysteínový motív) pre fluorescenčné farbivo, 4',5'-bis(1,3,2-ditioarsolan-2-yl)fluoresceín (FlAsH), 10, 11 do slučky v oboch divoký typ CRABP a pomaly sa skladajúci mutant náchylný na agregáciu, P39A CRABP (obrázok 1). 12 Fluorescencia FlAsH nám umožnila posúdiť zjavnú stabilitu CRABP in vivo, 12 objasniť mechanizmus agregácie P39A tetra-Cys CRABP in vitro, 13 a skúmať správanie chimér CRABP a exónu 1 huntingtínu (Htt), 14 proteín, ktorý sa agreguje pri Huntingtonovej chorobe. Naše zistenia naznačujú, že agregácia P39A nasleduje mechanizmus nukleácie-polymerizácie z monomérneho jadra. 13 Okrem toho osmolyt prolín ruší túto agregáciu in vitro aj in vivo. 15 Napokon expanzia polyglutamínového opakovania v exóne 1 Htt ​​destabilizuje lemujúci CRABP a vedie k agregácii, ktorej na začiatku dominuje CRABP a neskôr polyglutamínový trakt. 14 Tieto a ďalšie nové výsledky nám umožňujú prejsť zo skúmavky do bunky pri našom skúmaní skladania a agregácie proteínov.

Návrh tetra-Cys CRABP. (A) Štruktúra hlavného reťazca CRABP (PDB kód 1CBI) ukazujúca polohu motívu tetra-Cys vo vysoko variabilnej Ω-slučke. (B) Fluorescenčné spektrá tetra-Cys CRABP značeného FlAsH v jeho natívnom stave (zložené) a denaturované 8M močovina (rozložená). [Obrázok upravený podľa Ignatovej, Z. Gierasch, L. M. Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101, 523–528.]

V tomto článku stručne zhrnieme výsledky, ktoré sme doteraz získali, a otázky, ktoré tieto výsledky vyvolávajú. Potom uvádzame zaujímavé nové zistenia, ktoré naznačujú zásadné rozdiely v spôsobe skladania in vivo a ako skúmame dôvody týchto rozdielov.


Materiály a metódy

Výroba a čistenie SP-BN

Ľudský propeptid divokého typu bol exprimovaný v E. coli ako fúzny proteín (MBP-SP-BN) s maltózovým väzbovým proteínom (MBP) a purifikovaný po štiepení fúzie s faktorom Xa, ako je opísané [13]. Frakcie obsahujúce purifikovaný SP-BN v 20 mM Tris-HCl tlmivom roztoku pH 7, 500 mM NaCl sa dialyzovalo na tlmivý roztok potrebný v nasledujúcich experimentoch. Priemerný čistý náboj propeptidu je definovaný ako čistý náboj pri pH 7 [18] vydelený celkovým počtom zvyškov. Hydrofóbnosť v každej sekvenčnej polohe bola vypočítaná Kiteovou a Doolittlovou stupnicou [19] s použitím veľkosti okna 5 aminokyselín a normalizovaná na stupnicu 0–1. Stredná hydrofóbnosť je definovaná ako súčet normalizovaných hydrofobicít všetkých zvyškov delený počtom zvyškov propeptidu.

Experimenty s cirkulárnym dichroizmom vzdialeného UV

Spektrá cirkulárneho dichroizmu SP-BN boli zaznamenané pri 25 °C v spektropolarimetri Jasco J-715 s použitím termostatovaných kremenných buniek s dĺžkou dráhy 0,1 cm, pri 50 nm·min-1 (doba odozvy 1 s) pre spektrálny rozsah vzdialeného UV (250–195 nm) , pričom každé spektrum je akumuláciou 5 skenov. Spektrá sa získali v 200 ul 5 mM acetátu, 5 mM MES, 5 mM Tris-HCl pufra (AMT pufor) 150 mM NaCI pH 7 pri 0,115 mg.ml-1 proteínu. Stredná zvyšková molárna elipticita [θ] sa vypočítala z nameranej elipticity s prihliadnutím na koncentráciu proteínu, molekulovú hmotnosť SP-BN (19 902 Da, program DNAstar) a počet aminokyselín na molekulu (177). Odhady obsahu sekundárnej štruktúry z CD spektier sa uskutočnili pomocou programu CDPro suite a obsah α-helixu a β-listu sa vypočítal pomocou troch rôznych metód, CONTIN/LL, SELCON3 a CDSSTR s použitím ich strednej hodnoty [20]. CD spektrá v prítomnosti chaotropov sa získali po predinkubácii vzoriek s denaturantom počas 1 hodiny pri 25 °C. Vzorky v zodpovedajúcej koncentrácii chaotropu, 0,8–8 M GdmCl a 0,5–7,5 M močoviny, boli pripravené zo zásobných roztokov 9,75 M GdmCl (Sigma) a 9,87 M močoviny (Sigma). Kontrolné vzorky v neprítomnosti proteínu sa použili na odčítanie základnej línie od vzoriek s proteínom. Reverzibilita chemického rozvinutia sa analyzovala extenzívnou dialýzou vzoriek s najvyššou koncentráciou chaotropu smerom k 5 mM AMT pufru, 150 mM NaCI pH 7 pri 4 °C a potom zaznamenávaním spektier.

Teplotné štúdie sa uskutočňovali s 0,115 mg.ml-1 proteínu v 5 mM AMT pufri pH 7 so 150 alebo 500 mM NaCI. Teplotná závislosť CD signálu bola stanovená zahrievaním vzoriek z 25 na 85 °C pri 30 °C·h-1 a zberom elipticity pri 208 nm každých 0,2 °C. Po T rampe sa vzorka ochladila späť na 25 °C a znovu sa zaznamenalo CD spektrum.

Štúdie vnútornej a vonkajšej fluorescencie

Vnútorné fluorescenčné emisné spektrá propeptidu sa zaznamenali pri 25 °C v spektrofluorimetri SLM-Aminco AB2 s použitím 1 cm kremennej kyvety s excitáciou (290 nm) a emisnými štrbinami nastavenými na 4 nm a rýchlosťou skenovania 2 nm.s - 1. Vzorky obsahovali 0,09 mg·ml -1 proteínu v 5 mM AMT pufri, 150 mM NaCl pH 7. Spektrá proteínu v prítomnosti chaotropov, 0,8 – 6,6 M GdmCl alebo 0,5 – 7,5 M močoviny boli zaznamenané po predinkubácii vzoriek na 4 h pri 25 °C. Spektrá boli tiež zaznamenané u vzoriek dialyzovaných, ako je opísané vyššie, aby sa skontrolovala reverzibilita rozloženia proteínu.

Vonkajšia fluorescencia 11 μM bis-ANS sondy (4,4´-bis-1-fenylamín-8-naftalénsulfonát od Thermo Fisher Scientific) bola stanovená nasledovne. Vzorky obsahujúce chaotropy boli pripravené v konečnom objeme 200 μl pridaním 11 μl sondy z 200 μM roztoku v metanole k 29 μg proteínu v 5 mM AMT pufri, 150 mM NaCl pH 7 so zodpovedajúcim množstvom GdmCl alebo močoviny. Po inkubácii pri 37 °C počas 5 minút sa zaznamenali emisné spektrá (400–625 nm) v spektrofluorimetri pripojenom na vodný kúpeľ termostatizovaný na 37 °C. Excitačná vlnová dĺžka bola 395 nm a vzorky bez proteínu boli použité ako slepé pokusy. Rýchlosť skenovania a šírky štrbiny boli také, ako je opísané vyššie.

Analýza údajov CD a fluorescenčnej emisie

Krivky prechodu získané pomocou CD a fluorescenčnej spektroskopie z experimentov s rozvinutím propeptidu sa analyzovali podľa nasledujúcich rovníc: (1) (2) (3) (4)

V procese odvíjania chaotropmi v rovniciach (1) a (2): Yobs je pozorovaný parameter ([θ] 220 alebo FI350) pri každej koncentrácii denaturačného činidla YN a YU sú hodnoty parametrov v natívnych a nezložených podmienkach, D je koncentrácia denaturačného činidla (mol·L -1 ), ΔG 0 H2O je zmena voľnej energie v neprítomnosti denaturačného činidla (kJ·mol -1 ), m je mierou závislosti voľnej energie od koncentrácie denaturačného činidla (kJ·mol -1 ·M -1 ), R je plynová konštanta (8,314 J·mol -1 ·K -1 ) a T je absolútna teplota ( K). Stred krivky rozvinutia (D1/2) je koncentrácia denaturačného činidla, pri ktorej sa polovica proteínu rozvinie a možno ju vypočítať ako D1/2 = AG0 H2O/m od ΔG 0 H2O a m sa získajú z rovnice (1). Prípadne D1/2 možno určiť priamo z prispôsobenia rovnakých údajov rovnici (2). b a a konštanty. V teplotnej analýze D a D1/2 v rovnici (2) boli nahradené T a teplotami prechodu (všetky sú v °C pre ľahké rozpoznanie) a Yobs bolo [8] 208 v Rovniciach (2) a (3). Zmena voľnej energie AGo bola vypočítaná pre každú teplotu (K) podľa rovnice (3). Zmena entalpie ΔH 0 (kJ·mol -1 ) a zmena entropie ΔS 0 (kJ·mol -1 ·K -1 ) boli priesečníkom a sklonom v rovnici (4).

Analytická ultracentrifugácia

Hydrodynamické štúdie 0,15 mg·ml -1 SP-BN v 5 mM Tris-HCl pH 7,0 obsahujúcom buď 0, 150 alebo 500 mM NaCl sa uskutočňovali pri 20 °C a 48 000 otáčkach za minútu v analytickej ultracentrifúge Optima XL-1 (Beckman-Coulter Inc) vybavenej UV-viditeľnou optikou. Čiastočný špecifický objem SP-BN bola 0,73 ml·g -1 odhadnutá z jeho zloženia aminokyselín pomocou programu SEDNTERP, verzia 1.09 (získané zo servera RASMB) [21] hustota rozpúšťadla ρ bola 1,000 g·mL -1 a viskozita rozpúšťadla η bola 1,002 cpoise v neprítomnosť soli, 1,005 g.ml-1 a ​​1,017 cpoise so 150 mM NaCI a 1,019 g.ml-1 a ​​1,049 cpoise s 500 mM NaCI, v danom poradí, odhadnuté pomocou rovnakého programu.

Diferenciálna skenovacia kalorimetria

Experimenty s diferenciálnou skenovacou kalorimetriou (DSC) sa uskutočňovali na diferenciálnom skenovacom mikrokalorimetri VP-DSC (MicroCal) s objemom buniek 514,9 ul. Propeptid (0,2–0,6 mg·ml-1 ) v 5 mM Tris-HCl tlmivom roztoku pH 7, 150 alebo 500 mM NaCl a zodpovedajúci tlmivý roztok sa odplynili počas 3 minút pri teplote miestnosti v komore vo vákuu a za jemného miešania a potom sa naplnili do vzorky a referenčných kyviet, kde sa udržiaval pretlak, aby sa zabránilo odplyneniu. Merania sa uskutočňovali každých 0,1 °C a rýchlosť skenovania bola 60 °C.h-1. DSC skenovanie začalo pri 20 °C a skončilo pri najvyššej možnej teplote vo VP-DSC (

120 °C). Druhé skenovanie sa získalo opätovným zahriatím vzoriek po ich ochladení počas 20 minút po dokončení prvého skenovania. Zdanlivé Cp profily sa získali odčítaním inštrumentálnej základnej línie (získanej s pufrom v oboch bunkách) od experimentálnych termogramov. Potom sa termogramy normalizovali na koncentráciu proteínu na základe monoméru 19 902 Da a odčítali sa základné hodnoty pred a po prechode.

Reverzibilné prechody sa podrobili termodynamickej dekonvolučnej analýze a termogramový vrchol každého nasledujúceho skenovania bol prispôsobený modelu bez dvoch stavov s dvoma vrcholmi podľa Eq (5) v príručke DSC so softvérom Origin Microcal, ako tento model zohľadňoval. pre najlepšie prispôsobenie údajov (najnižšie χ 2 / DoF (stupeň slobody)). (5), kde Tm1 (teplota topenia), ΔHVH1 (zmena van't Hoffovej entalpie) a ΔHcal1 (zmena kalorickej entalpie) zodpovedá za tepelný prechod domény 1, zatiaľ čo Tm2ΔHVH2 a AHcal2 zodpovedá za tepelný prechod domény 2.Cp je prebytočná tepelná kapacita (kJ·mol -1 ·K -1 ).

Aktivačná energia pre ireverzibilné prechody (EA), považované za jednokrokové procesy z natívneho do ireverzibilne inaktivovaného stavu proteínu [22], bola určená rovnicou (6), kde Cp ex max je maximálny prebytok tepelnej kapacity získaný pri Tm.

Vzorky 0,6 mg·ml -1 proteínu v 5 mM Tris-ClH tlmivom roztoku 150 mM NaCl pH 7 s obsahom 2 M močoviny v rovnakom tlmivom roztoku sa podrobili DSC v teplotnom rozsahu 20–120 °C pri 60 °C·h-1 rýchlosť skenovania. Chaotrop bol pridaný do referenčnej cely v rovnakej koncentrácii, aká bola pridaná do vzorkovej cely.

Analytické postupy

Počas procesu výroby a čistenia propeptidu sa koncentrácia proteínu rutinne určovala kolorimetrickými metódami, ako je opísané [13], ale po prečistení sa koncentrácia propeptidu vypočítala z jeho absorbancie pri 280 nm s použitím 20 790 M -1 · cm -1 ako molárneho extinkčného koeficientu pri 280 nm [14].

Voľné tioly purifikovaného SP-BN sa titrovali pridaním 40 μl 5 mM kyseliny 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoovej) (DTNB, Sigma) k 38,4 μg proteínu v 960 μl 5 mM Tris-HCl pH 8,2, 150 mM NaCl ( testovací pufor). Proteín bol predtým dialyzovaný smerom k rovnakému pufru pri 4 °C. Absorbancia pri 412 nm bola zaznamenaná po 2 hodinách pri 22 °C na kontrolu uvoľňovania kyseliny 5-tiobis-(2-nitrobenzoovej) (TNB) [23]. L-cysteín (Fluka) bol štandard a ε412 = 13 800 M-1 cm-1 sa použilo na kvantifikáciu cysteínov. Na titráciu za denaturačných podmienok sa použil rovnaký protokol okrem toho, že proteín sa predinkuboval s testovacím pufrom obsahujúcim 5,7 M GdmCl, ktorý sa pridal 30 minút pred pridaním DTNB. Vo fúzii MBP-SP-B sa analyzovali aj voľné tiolyN (33,5 ug) a v MBP (75,2 ug uvoľnených z fúzie faktorom Xa) po odstránení 2-merkaptoetanolu obsiahnutého v purifikačnom pufri extenzívnou dialýzou smerom k testovaciemu pufru.


Ako stabilizovať proteín: Obrazovky stability pre testy tepelného posunu a nano diferenciálnu skenovaciu fluorimetriu v projekte Virus-X

Je prezentovaný protokol na rýchle testovanie tepelnej stability proteínov v rôznych podmienkach prostredníctvom testov tepelného posunu a nano diferenciálnej skenovacej fluorimetrie. Pufrové systémy, soli a aditíva, ktoré spolu obsahujú tri jedinečné testy stability, sa testujú s proteínmi, aby sa identifikovali vhodné tlmivé roztoky pre funkčné a štrukturálne štúdie.

Abstraktné

Projekt Horizon2020 Virus-X bol založený v roku 2015 s cieľom preskúmať virosféru vybraných extrémnych biotopov a objaviť nové vírusové proteíny. Na vyhodnotenie potenciálnej biotechnickej hodnoty týchto proteínov je ústrednou výzvou v tomto programe analýza proteínových štruktúr a funkcií. Stabilita proteínovej vzorky je nevyhnutná na poskytnutie zmysluplných výsledkov testu a zvýšenie kryštalizovateľnosti cieľov. Test tepelného posunu (TSA), technika založená na fluorescencii, je zavedená ako populárna metóda na optimalizáciu podmienok pre stabilitu proteínu pri vysokom výkone. V TSA sú používané fluorofóry vonkajšie, environmentálne citlivé farbivá. Alternatívnou podobnou technikou je nano diferenciálna skenovacia fluorimetria (nanoDSF), ktorá sa spolieha na natívnu proteínovú fluorescenciu. Predstavujeme tu nové osmolytové sito, 96-stavové sito organických prísad určené na vedenie kryštalizačných pokusov prostredníctvom predbežných experimentov TSA. Spolu s predtým vyvinutými pH a soľnými screenmi poskytuje sada troch screenov komplexnú analýzu proteínovej stability v širokom rozsahu tlmivých systémov a aditív. Užitočnosť skríningu je demonštrovaná v TSA a nanoDSF analýze lyzozýmu a Proteínu X, cieľového proteínu projektu Virus-X.

Úvod

Mnoho biotechnologicky užitočných enzýmov pochádza z vírusových zdrojov, ako je proteáza 1 tabakového etch vírusu (TEV) a proteáza 2 ľudského rinovírusu typu 3C (HRV 3C). Projekt Horizon2020 Virus-X (postava 1) 3. Cieľom tohto programu je (a) rozšíriť rozsah vlastností známych rodín enzýmov a (b) charakterizovať nové enzýmy zatiaľ neznámej funkcie (enzým X). Stanovenie kryštalografickej štruktúry hrá kľúčovú úlohu pri charakterizácii cieľového proteínu, najmä v tých prípadoch, keď sa proteínové sekvencie vyvinuli na nepoznanie 4 . Stabilita proteínu je kľúčovým faktorom v procese kryštalizácie, vzorky musia byť konformačne homogénne a štrukturálne zdravé po určitú dobu, aby vytvorili vysokokvalitné difrakčné kryštály. Okrem toho je pre testy aktivity nevyhnutné, aby proteíny existovali vo svojej aktívnej konformácii, čo môže byť tiež uľahčené priaznivým molekulárnym prostredím.

Napriek vývoju technológie dostupnej pre kryštalografov zostáva kryštalizácia proteínov časovo náročným a prácne empirickým procesom 5 . Predbežné biofyzikálne experimenty na zlepšenie stability proteínu v roztoku poskytujú jasne lepší východiskový bod pre kryštalizáciu proteínu a zvyčajne spotrebujú len pomerne malé množstvo vzorky proteínu 6, 7, 8, 9. Veľký počet cieľových proteínov, ktoré sa majú študovať v tomto projekte, si tiež vyžaduje škálovateľné, vysoko výkonné testy stability. Jednou z najpopulárnejších metód pre predkryštalizačnú biofyzikálnu charakterizáciu proteínov je test tepelného posunu (známy aj ako TSA alebo diferenciálna skenovacia fluorimetria, DSF)10,11.

TSA využívajú fluorescenčné farbivo citlivé na životné prostredie na sledovanie tepelnej denaturácie proteínových vzoriek. Mnohé bežne používané farbivá majú premenlivú fluorescenčnú aktivitu v závislosti od polarity ich prostredia, pričom často vykazujú vysoký fluorescenčný výstup v hydrofóbnom prostredí, ale v polárnych prostrediach podliehajú rýchlemu zhášaniu 12 . Proteíny vo všeobecnosti spôsobujú výrazné zvýšenie fluorescencie farbiva, keď sa ich hydrofóbne jadrá obnažia počas denaturácie, často nasleduje zníženie fluorescencie farbiva pri veľmi vysokých teplotách, keď sa proteíny začnú agregovať (Obrázok 2).

Zatiaľ čo farbivo citlivé na hydrofóbnosť je často dobrou voľbou pre farbivo TSA na všeobecné použitie, môže byť nevhodné pre proteíny s veľkými hydrofóbnymi oblasťami vystavenými rozpúšťadlám, ktoré často vykazujú škodlivo vysokú fluorescenciu pozadia. Fluorofóry s alternatívnymi spôsobmi účinku existujú (pozri diskusiu), ale namiesto toho môže byť žiaduce sledovať denaturáciu prostredníctvom vnútornej proteínovej fluorescencie s nanoDSF.

Tryptofánové zvyšky, ktoré sú pochované v nepolárnych oblastiach proteínu, fluoreskujú s emisným maximom 330 nm. Keď sa vzorka proteínu rozvinie a tieto zvyšky sa vystavia polárnemu rozpúšťadlu, ich emisné maximum podlieha batochromickému posunu na 350 nm13. nanoDSF využíva tento posun v emisnom maxime na skúmanie rozvinutia vzorky proteínu bez potreby vonkajších fluorofórov 14 .

Krivky taveniny ukazujúce jednotlivé kroky denaturácie možno analyzovať prispôsobením údajov Boltzmannovmu sigmoidálnemu modelu. Teplota v inflexnom bode rozvíjajúceho sa prechodu (Tm) sa používa ako kvantitatívna miera tepelnej stability proteínu a referenčná hodnota na porovnanie priaznivosti rôznych podmienok.

Krivky topenia toho istého proteínu v rôznych podmienkach niekedy vykazujú určitý stupeň heterogenity, ktorý môže spôsobiť, že Boltzmannovo esovité prispôsobenie je neuskutočniteľné. Rozpoznať Tm hodnoty z údajov, ktoré sa odchyľujú od klasickej topológie kriviek, možno použiť numerické metódy, ako sú metódy používané v NAMI, open source programe na analýzu údajov TSA 11 . Alternatívne termodynamické rámce možno použiť aj na analýzu zložitejších kriviek s viacerými denaturačnými krokmi, ako je napríklad metodika ProteoPlex 15 .

Testy stability boli navrhnuté na použitie v experimentoch TSA a nanoDSF na rýchlu identifikáciu priaznivých podmienok pre cieľový proteín (Obrázok 3, kompozície obrazovky sú dostupné v doplnkových informáciách). Informácie zhromaždené pomocou obrazoviek sa môžu použiť v mnohých fázach kryštalografického potrubia vrátane: purifikácie skladovania vzorky, minimalizácie straty výťažku prostredníctvom rozvinutia proteínu počas procesu čistenia návrhu testu, posilnenia funkčnosti proteínu v testoch aktivity pomocou tepelne stabilizujúcich pufrov a nakoniec kryštalizácie, racionálneho vedenia - navrhnuté kryštalizačné pokusy.

Voľba vhodného tlmivého systému pre vzorku proteínu je životne dôležitá. Nekompatibilné hodnoty pH môžu viesť k deaktivácii alebo denaturácii proteínu. Prítomnosť kokryštalizovaných molekúl pufra sa však rozpustila vo veľkom počte rôntgenových kryštálových štruktúr (stôl 1) môže tiež naznačovať stabilizačný účinok, ktorý je oddelený od jednoduchej regulácie pH a namiesto toho pramení z chemických vlastností molekuly pufra.

pH screen, formulovaný s použitím niekoľkých Good's pufrov 17, 18, 19 spolu s inými bežne biologicky kompatibilnými pufrovými systémami, je navrhnutý tak, aby dekonvoluoval chemický účinok molekuly pufra na stabilitu proteínu od skutočného pH výsledného roztoku. Poskytnutím troch hodnôt pH pre každý tlmivý systém a začlenením redundancie hodnoty pH medzi rôzne systémy môže skríning pH identifikovať priaznivé hodnoty pH aj priaznivé tlmivé systémy pre cieľový proteín.

Soľné sito obsahuje bežne laboratórne soli, ako aj chaotropy, chelanty, ťažké kovy a redukčné činidlá. Skríning môže poskytnúť všeobecnú indikáciu afinity proteínovej vzorky k prostrediam s vysokou iónovou silou, ale každá podskupina zlúčenín môže tiež poskytnúť informácie o potenciálnej štruktúre proteínu. Napríklad chelant významne destabilizujúci proteín by mohol indikovať dôležité štrukturálne kovy vo vzorke. Ak je vzorka tiež silne stabilizovaná kovovým katiónom na obrazovke, môže to poskytnúť sľubný východiskový bod pre ďalšie štrukturálne experimenty.

Osmolyty sú rozpustné zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú osmotické vlastnosti svojho prostredia. V prírode ich možno použiť ako "chemické chaperóny", ktoré vynucujú skladanie neusporiadaných proteínov a stabilizujú ich, najmä v stresových podmienkach 20 , 21 , 22 . Tieto vlastnosti z nich robia atraktívne aditíva v proteínovej kryštalografii použiteľné ako kryoprotektanty počas procesov zberu, montáže a skladovania kryštálov 23 . Potenciálne využitie osmolytov sa rozširuje aj na čistenie proteínov. Významný podiel rekombinantných proteínov exprimovaných v E. coli môžu byť nerozpustné a ťažko sa získavajú v natívnom stave použitím štandardných purifikačných metód. Osmolyty sa môžu použiť na stabilizáciu a záchranu proteínov z nerozpustných frakcií, čím sa zvyšujú výťažky čistenia24.

Osmolytový screening bol navrhnutý s použitím zavedených zlúčenín prítomných v Protein Data Bank záznamoch 25 a Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated Pathways (DEOP) 26 databázy a iteračne optimalizovaný s použitím štandardných proteínov. Obrazovka je postavená na ôsmich podtriedach osmolytu: glycerol, cukry a polyoly, nedetergentné sulfobetaíny (NDSB), betaíny a ich analógy, organofosfáty, dipeptidy, aminokyseliny a ich deriváty a posledná zmiešaná skupina. Každý osmolyt je prítomný vo viacerých koncentráciách na základe jeho rozpustnosti a účinných koncentračných rozsahov na porovnanie.

Protokol

1. Príprava vzorky proteínu

  1. Formulujte sitá stability ako 500 µL alikvóty v 96-jamkových blokoch a uzavrite na uskladnenie. Preneste 10 µ l každej podmienky skríningu stability do zodpovedajúcej jamky 96-jamkovej platne pomocou viackanálovej pipety, aby ste ušetrili čas (Obrázok 4A).
  2. Pripravte si 1 ml približne 1 mg ml -1 proteínového roztoku vo vhodnom tlmivom systéme. Zatiaľ čo zloženie vhodného pufra sa mení s každou vzorkou proteínu, dobrý prvý pufor na vyskúšanie je 10 mM fosforečnan sodný so 100 mM NaCl, pH 7,2.
    POZNÁMKA: Prijateľné koncentrácie proteínov sa líšia prípad od prípadu, ale rozsahy koncentrácií 0,5 – 5 mg ml -1 zvyčajne vytvárajú analyzovateľné krivky. Zriedené pufre sa odporúčajú na použitie s obrazovkami stability, aby sa predišlo maskovaniu účinkov každého stavu. Typické kompozície pufrov sú približne 10 mM pufor s približne 100 mM NaCI.
  3. Ak vykonávate experiment TSA, pridajte do vzorky proteínu farbivo SYPRO Orange na konečnú koncentráciu 20x. Miešajte buď prevracaním alebo krátkym vortexovaním.
  4. Preneste 10 & # 181 l proteínového roztoku do každej jamky 96-jamkovej platne pripravenej v kroku 1.1 (Obrázok 4B).
  5. Utesnite a centrifugujte 96-jamkovú platňu 2 minúty pri 600 x g aby sa zabezpečilo, že sa vzorka proteínu a zložka skríningu zmiešajú (Obrázok 4C).
  6. Opätovne utesnite blok hlbokej jamky obrazovky stability a uskladnite obrazovku pri teplote 4 °C a 176 °C až na 4 mesiace. Soľnú clonu skladujte v tme, pretože niektoré komponenty sú fotosenzitívne.
  7. Ak vykonávate experiment nanoDSF, pokračujte krokom 2. Ak vykonávate experiment TSA, preskočte na krok 4.

2. Príprava experimentu nanoDSF

  1. Uistite sa, že je zariadenie čisté, pričom venujte zvláštnu pozornosť prípadnému prachu v blízkosti stojana na vzorky. Ak má systém spätné zrkadlo, vyčistite ho etanolom a handričkou, ktorá nepúšťa vlákna.
  2. Otvorte zásuvku na vzorky stlačením Otvorte zásuvku tlačidlo. (Obrázok 5A).
  3. Naplňte kapiláry približne 10 µ l z každej jamky 96-jamkovej platne dotykom jedného konca kapiláry do roztoku, potom ich umiestnite do zodpovedajúcich držiakov kapilár stojana na vzorky (Obrázok 5B). Dávajte pozor, aby ste neznečistili stred kapilár odtlačkami prstov, atďpretože by to mohlo interferovať s fluorescenčnými hodnotami počas experimentu.
  4. Imobilizujte kapiláry pomocou magnetického tesniaceho prúžku (Obrázok 5C).

3. Programovanie experimentu nanoDSF

  1. Spustite predbežné skenovanie na zistenie polohy a intenzity každej kapiláry stlačením tlačidla Spustite vyhľadávanie zisťovania tlačidlo v Discovery Scan tab. Zvýšte alebo znížte silu dopadajúceho budenia z počiatočného výkonu 10 %, až kým vrchol každého skenovania kapilár nebude medzi 4 000 – 12 000 jednotkami (Obrázok 5D).
  2. Aby sa zabezpečilo, že vzorka je zložená a dostatočne koncentrovaná, odporúča sa počiatočné skenovanie taveniny so strmým teplotným gradientom. V Skenovanie topenia naprogramujte skenovanie taveniny nastavením Sklon teploty možnosť na 7,0 °C min -1 , Štartovacia teplota do 25 °C a Koncová teplota na 95 °C, potom spustite experiment nanoDSF stlačením tlačidla Začnite taviť tlačidlo. Ak výsledné krivky topenia neukazujú detekovateľný inflexný bod, zvážte ďalšiu koncentráciu vzorky alebo skontrolujte, či je proteín správne poskladaný.
  3. Opakujte kroky 2.1-2.4, aby ste pripravili vzorky na úplný experiment.
  4. V Skenovanie topenia naprogramujte skenovanie taveniny nastavením Sklon teploty možnosť na 1,0 °C min -1 , Štartovacia teplota do 25 °C a Koncová teplota na 95 °C, potom spustite experiment nanoDSF stlačením tlačidla Začnite taviť tlačidlo.

4. Uskutočnenie experimentu TSA

  1. Otvorte zásuvku na vzorky tak, že pevne zatlačíte na zárez na pravej strane zásuvky. Umiestnite 96-jamkovú tácku do systému RT-PCR s jamkou A1 vľavo vzadu (Obrázok 4D).
  2. Kliknite na Nový experiment tlačidlo na začatie nastavovania experimentu TSA.
  3. V Vlastnosti experimentu kliknite na kartu Krivka taveniny možnosť na požiadanie Aký typ experimentu chcete nastaviť? a Iné možnosť, keď sa opýtate Ktoré činidlá chcete použiť na detekciu cieľovej sekvencie?
  4. V Nastavenie platne/definovanie cieľov a vzoriek zadajte názov cieľa a potom nastavte Reportér ako ROX a zhášač ako žiadne.
  5. V Nastavenie platne/Priradenie cieľov a vzoriek priraďte každej jamke 96-jamkovej platne cieľový názov zadaný v predchádzajúcom kroku. Na tej istej karte nastavte Vyberte farbivo, ktoré chcete použiť ako pasívnu referenciu ako žiadne.
  6. V Run Method , odstráňte kroky, kým nebudú celkom tri. Nastavte prvý krok na 25,0 °C, rýchlosť rampy 100 %, čas 00:05 druhý krok na 95,0 °C, rýchlosť rampy 1 %, čas 01:00 tretí krok na 95,0 °C, rýchlosť rampy 100 % , čas 00:05. Vyberte zhromažďovanie údajov pomocou Zbierať dáta rozbaľovacej ponuky alebo stlačením tlačidla Zber dát ikona (Obrázok 6).
  7. Nastaviť Reakčný objem na jamku do 20 &# 181L.
  8. Stlačte tlačidlo Štart Spustiť tlačidlo na spustenie experimentu TSA.
  1. Vyberte vlnovú dĺžku, s ktorou chcete vykresliť krivku topenia. Pre experimenty nanoDSF sa bežne používa pomer intenzít fluorescencie pri 330 nm a 350 nm (zodpovedá tryptofánu v nepolárnom, respektíve polárnom prostredí)13. Pre väčšinu TSA je maximum emisie farbiva vhodné na vykreslenie krivky topenia (emisné maximum SYPRO Orange je 569 nm)12.
  2. Vypočítajte Tm hodnoty každej podmienky určením inflexného bodu (bodov) každej krivky topenia. Väčšina systémov nanoDSF automaticky vypočítava Tm hodnoty numerickou diferenciáciou kriviek topenia po získaní údajov. Ak použitý softvér automaticky nevypočítava Tm hodnoty, bezplatný, alternatívny softvér riadený grafickým používateľským rozhraním, ako je NAMI 11, môže automatizovať analýzu údajov a následné spracovanie, čo dáva možnosť vytvoriť tepelnú mapu zhrňujúcu Tm hodnoty pre celý 96-jamkový experiment (priložený odkaz poskytuje návod a zdroje na spracovanie údajov pomocou NAMI).
  3. Porovnaj Tm hodnoty všetkých skúmaných podmienok. Stabilizačné sitá obsahujú v každom sito dve jamky (A1 a A2), ktoré obsahujú iba vodu. Ak použijete hodnoty iba pre vodu ako referenčnú hodnotu, môžete vypočítať ΔTm hodnoty, ktoré riešia systematické chyby a umožňujú jednoduché porovnanie stabilizačných účinkov. Vyššie Tm hodnoty označujú tepelne stabilizujúce podmienky, ktoré sa odporúčajú pre následné použitie. Sľubné podmienky často vykazujú koncentračnú závislosť pri ich stabilizácii.

Reprezentatívne výsledky

Lysozým bol testovaný pomocou testov stability a proteín X, cieľový proteín v projekte Virus-X, bol testovaný pomocou testovania osmolytov. Oba proteíny vo všeobecnosti produkovali krivky topenia s jasne definovanými denaturačnými prechodmi v experimentoch TSA aj nanoDSF (reprezentatívne krivky pozri na sprievodných obrázkoch). V niekoľkých prípadoch, keď vzorky, ktoré nevytvorili interpretovateľné krivky s definovaným denaturačným prechodom, boli interpretované ako denaturované a neboli zahrnuté v Tm prirovnania.

Obrázok 7  ukazuje výsledky vzoriek zo soľného filtra, ktoré sú príkladom tepelne stabilizujúcich vlastností chloridu amónneho voči lyzozýmu. Závislosti na koncentrácii, ako je uvedené vyššie, často naznačujú sľubné podmienky, ale môže byť užitočné porovnať výsledky zvyšujúcej sa koncentrácie iónov s niekoľkými rôznymi soľami, aby sa zistilo, či tepelná stabilizácia vo všeobecnosti vyplýva zo zvýšenia iónovej sily pufra alebo či je prítomnosť špecifické ióny poskytujú dodatočnú stabilitu.

Porovnanie Tm hodnoty lyzozýmu pomocou pH obrazovky (Obrázok 8) odhaľuje dve informácie. Po prvé, existuje všeobecný trend zvyšovania stability s klesajúcimi hodnotami pH. Po druhé, rozsah Tm hodnoty získané použitím rôznych pufrovacích systémov s rovnakými hodnotami pH môžu byť významné.

Údaje v Obrázok 8 naznačuje, že zhoda medzi TSA a nanoDSF v tomto experimente je vo všeobecnosti dobrá, ale nanoDSF vykazuje tendenciu identifikovať mierne vyššie Tm hodnoty a o niečo väčšie Tm posuny ako TSA. Niektoré jamky s hodnotami pH nad 8,5 však vykazujú veľké rozdiely medzi Tm hodnoty získané z TSA a nanoDSF. Rozdiely by mohli byť potenciálne pripísané denaturačnému mechanizmu proteínu pri rôznych hodnotách pH, ​​napríklad farbivo citlivé na hydrofóbnosť by mohlo poskytnúť pomerne nízku Tm čítanie, či sa hydrofóbne oblasti proteínu vystavia pôsobeniu rozpúšťadla podstatne rýchlejšie, ako sa polarita okolia tryptofánových zvyškov mení.

Obrázok 9  zobrazuje teplotnú mapu Tm hodnoty získané s lyzozýmom pomocou osmolytového sita. Podmienky s najvyšším Tm nárasty v porovnaní s kontrolnými jamkami (jamky A1 a A2, obsahujúce deionizovanú vodu) sú zafarbené na tmavomodro. Najmä stabilizačné podmienky identifikované v Obrázok 9 zahŕňajú glycerol, 1 M D-sorbitol, 100 mM hypotaurín a 10 mM Ala-Gly (jamky A4-A6, A9, E7 a F8, v danom poradí).

Obrázok 10  zobrazuje teplotnú mapu Tm hodnoty získané s proteínom X. Experimenty TSA a nanoDSF s Osmolytovým skríningom ukazujú, že väčšina testovaných osmolytov poskytuje buď malé zvýšenie Tm (do 1 °C) alebo majú škodlivý vplyv na stabilitu proteínu X's. Zdá sa, že najmä kyselina dipikolínová v koncentrácii 10 mM (jamka D1) denaturuje vzorku pri teplote miestnosti. Výsledky TSA a nanoDSF rýchlo identifikujú kyselinu dipikolínovú ako nekompatibilnú prísadu pre Protein X, ktorej sa treba vyhnúť pri práci s proteínom. Napriek tomu boli vysoké koncentrácie D-sorbitolu a arabinózy (jamky A9 a B9, obe pri 1 M), ako aj glycerolu a TMAO (jamky A4-A6 a E1), identifikované ako tepelne stabilizujúce.

Pre lyzozým, kombinácie podmienok poskytujúcich najvyššiu Tm hodnoty z každého skríningu stability sa testovali na sondu pre synergický kombinovaný účinok. Obrázok 11 ukazuje všeobecný nárast Tm hodnoty, pretože sa pridáva viac zložiek pufrovacieho systému (pH, soľ a osmolyt). V prípade MES, síranu amónneho a D-sorbitolu, Tm zvýšenie až 10 °C možno pozorovať, keď sú prítomné všetky zložky v porovnaní so samotným MES. Obrázok 11 ukazuje, že znateľný synergický efekt môže nastať, keď sú jednotlivé zložky pufra optimalizované a kombinované s obrazovkami stability.

Všeobecnejšie povedané, Obrázok 11 tiež ilustruje veľkosť ΔTm hodnoty, ktoré možno pozorovať v experimentoch TSA a nanoDSF. Veľkosť ΔTm dosiahnuteľný sa výrazne líši v závislosti od proteínového systému, ale akýkoľvek ΔTm hodnota okolo a nad 5 °C často poukazuje na priaznivý stabilizačný účinok.


postava 1: Bioprospecting. Zbierka vzoriek z extrémneho prostredia v projekte Virus-X. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 2Schéma TSA. Komentovaný príklad typickej krivky topenia získanej z experimentu TSA. Táto krivka je charakteristická pre klasický "dvojstavový" proteín, kde populácia vzorky prechádza z poskladanej do denaturovanej bez detegovateľných čiastočne poskladaných medziproduktov. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 3: Pracovný postup obrazoviek stability. Štandardný pracovný postup optimalizácie vyrovnávacej pamäte pomocou obrazoviek stability. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 4: Pracovný postup štandardného experimentu TSA s obrazovkami stability. Zľava doprava: (A) Pipetovanie alikvotných častí testov stability do 96-jamkovej platne. (B) Pipetovanie proteínovej vzorky s fluorescenčným farbivom do platne. (C) Utesnenie platne pred centrifugáciou. (D) Umiestnenie platne do systému RT-PCR. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 5Pracovný postup štandardného experimentu nanoDSF. (A) Otvorenie stojana na nakladanie kapilár. (B) Vloženie kapilár do stojana. (C) Imobilizácia kapilár pomocou magnetického tesniaceho prúžku. (D) Programovanie experimentu. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 6: Používateľské rozhranie pre systém RT-PCR. Bol naprogramovaný experiment TSA. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 7: Vzorové údaje soľnej obrazovky. (A) Pomer intenzít fluorescencie pri 350 nm vs 330 nm pre experiment nanoDSF bez označenia s lyzozýmom. Vzorky zodpovedajú jamkám C7-C12 soľného sita (1,5 M - 0,2 M chlorid amónny). Vypočítané Tm hodnoty pre každú podmienku sú superponované na grafe. (B) Zhrnutie Tm hodnoty vypočítané z údajov uvedených v Obrázok 7A. (C) Intenzity fluorescencie pri 590 nm pre experiment TSA s použitím lyzozýmu s reportérovým farbivom citlivým na hydrofóbnosť. Páči sa mi to Obrázok 7Avzorky zodpovedajú jamkám C7-C12 soľného sita. Vypočítané Tm hodnoty sú superponované do grafu. (D) Zhrnutie Tm hodnoty vypočítané z údajov prítomných v Obrázok 7C. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 8Údaje o vzorke pH obrazovky. Zhrnutie Tm posuny získané s lyzozýmom a pH screeningom. Každý bod predstavuje nezávislé stavové body pri rovnakej hodnote pH rôznych tlmivých systémov pri rovnakom pH. Tm posuny sa vypočítajú vzhľadom na kontrolný Tm 68,0 °C pre TSA experimenty a 71,9 °C pre nanoDSF experimenty. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 9: Osmolytové skríningové údaje vzorky (lyzozým). Zhrnutie Tm hodnoty získané z experimentu nanoDSF bez označenia s lyzozýmom a každou jamkou osmolytového sita. Tm hodnoty (v °C) sú porovnané s jamkami A1 a A2, ktoré obsahujú vodu ako kontrolu. Tepelná mapa bola vytvorená na základe ΔTm porovnávané hodnoty (modrá označuje Tm zvýšiť a červené Tm zníženie). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 10Osmolytový skríning údajov vzorky (Proteín X). (A) Zhrnutie Tm hodnoty získané z experimentu nanoDSF bez označenia s Proteínom X a osmolytovým skríningom. Tm hodnoty sú porovnávané s jamkami A1 a A2, ktoré obsahujú vodu ako kontrolu. Tepelná mapa bola vytvorená na základe ΔTm porovnávané hodnoty (modrá označuje Tm zvýšiť a červené Tm zníženie). (B) krivky nanoDSF získané z jamky A9 (1 M D-sorbitol, stabilizujúci stav) a D1 (10 mM kyselina dipikolínová, destabilizujúci stav). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.


Obrázok 11: Vplyv optimalizácie vyrovnávacej pamäte na Tm. TSA Tm hodnoty lyzozýmu v kombinácii s podmienkami každého skríningu, ktoré poskytli najväčšie zvýšenie Tm. 100 mM kyselina octová, pH 4,2, a 100 mM MES, pH 5,6, boli zvolené ako pufrové systémy, spolu s 1,5 M síranom amónnym ako soľ. Koncentrácie osmolytov boli identické s koncentráciami nájdenými pri skríningu osmolytov: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50 mM L-lyzín a 100 mM hypotaurín. Chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku šiestich replikátov. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.

Molekula Kód PNR Frekvencia spoločnej kryštalizácie
Fosfát PO4 5132
Acetát ACT 4521
Kyselina 2-(N-morfolino)-etánsulfónová (MES) MES 1334
Tris(hydroxymetyl)aminometán (tris) TRS 1155
Formátovať FMT 1072

Tabuľka 1: Súhrn frekvencie spoločnej kryštalizácie molekúl pufra v záznamoch Protein Data Bank (PDB). Údaje získané prostredníctvom PDBsum 16 z celkového počtu 144 868 záznamov (správne k 12.5.18).

Diskusia

Medzi kritické aspekty v rámci protokolu patrí krok centrifugácie a správne utesnenie 96-jamkovej platne pre experimenty TSA (krok 1.5). Centrifugácia zaisťuje, že vzorka proteínu a stav sita prídu do kontaktu a premiešajú sa. Okrem toho, ak sa na experiment TSA použije neutesnená platňa, existuje značné riziko odparovania rozpúšťadla počas experimentu, čo spôsobí zvýšenie koncentrácie vzorky a zvýši možnosť predčasného zhlukovania proteínov.

TSA a nanoDSF sú prístupné širokému spektru vzoriek proteínov, veľká väčšina vzoriek môže produkovať interpretovateľné krivky topenia pomocou reportérového farbiva na báze hydrofóbnosti alebo prostredníctvom nanoDSF bez farbiva. Ak štandardné zdroje fluorescencie nie sú vhodné pre váš proteín, najjednoduchšou modifikáciou protokolu, ktorú možno preskúmať, je výber fluorofóru. Pre experimenty TSA by mohlo byť vhodných niekoľko alternatívnych farbív. Príklady zahŕňajú N-[4-(7-dietylamino-4-metyl-3-kumarinyl)fenyl]maleimid (CPM), zlúčeninu, ktorá fluoreskuje po reakcii s tiolom27, a 4-(dikyanovinyl)julolidín (DCVJ), a zlúčenina, ktorá mení svoju fluorescenciu na základe tuhosti svojho prostredia, čím zvyšuje svoju fluorescenciu, keď sa vzorka proteínu rozvíja 28, 29 (druhé farbivo často vyžaduje vysoké koncentrácie vzorky).

Alternatívne metódy analýzy krivky topenia sú dostupné, ak Tm nie je automaticky vypočítaná softvérom prístroja. Ak sú údaje homogénne a v krivkách topenia je zrejmý iba jeden denaturačný krok, skrátený súbor údajov možno prispôsobiť Boltzmannovej sigmoide s nasledujúcou rovnicou:

Kde F je intenzita fluorescencie pri teplote T, Fmin a Fmax sú intenzity fluorescencie pred a po denaturačnom prechode, v tomto poradí, Tm je stredná teplota denaturačného prechodu a C je sklon pri Tm. Zatiaľ čo táto metóda funguje dobre pre jednoduché dvojkrokové denaturačné procesy, je nevhodná pre zložité krivky taveniny s viacerými prechodmi.

Jednou z hlavných výhod TSA je jeho dostupnosť Experimenty TSA možno vykonávať v akomkoľvek systéme RT-PCR s filtrami pri vhodných vlnových dĺžkach pre použité fluorescenčné farbivo. To spolu s nízkymi nákladmi na spotrebný materiál, jednoduchou obsluhou a relatívne nízkym množstvom potrebného proteínu robí z TSA cennú techniku ​​pre širokú škálu projektov v priemysle aj na akademickej pôde.

Okrem toho, že skríningy indikujú priaznivé podmienky pufra, obsahujú niektoré jamky, ktoré môžu poskytnúť vodítko na prítomnosť štruktúrnych kovov vo vzorke proteínu. Jamky, ktoré môžu byť obzvlášť zaujímavé v soľnom filtri, sú G6 a G7, ktoré obsahujú 5 mM EDTA a 5 mM EGTA, v danom poradí. Významná tepelná destabilizácia v týchto jamkách môže naznačovať dôležité kovové ióny v proteíne, ktoré sú sekvestrované chelantmi. Zlúčeniny v osmolytovom skríningu môžu tiež potenciálne poskytnúť kľúče k funkcii proteínu. Mnohé zo zlúčenín v skríningu patria do tried molekúl, ktoré sú bežnými substrátmi enzýmov. Napríklad všeobecná stabilizácia, ktorú poskytujú sacharidy (prítomné v jamkách A11-B10) pre lyzozým, možno pripísať ich štruktúrnej podobnosti so zavedenými substrátmi enzýmu, N-acetylglukózamínovými oligomérmi30.

Vyššie uvedené protokoly TSA a nanoDSF môžu byť tiež prispôsobené na štúdium interakcií proteín-ligand. Ligandy, ktoré sa špecificky viažu na proteín, môžu zvýšiť jeho tepelnú stabilitu zavedením nových interakcií do komplexu. Pozitívny posun v proteíne T v závislosti od dávkym je sľubným znakom úspešnej interakcie proteín-ligand. Rýchlosť, priepustnosť a nízke náklady na skríning knižníc zlúčenín pomocou TSA z neho urobili veľmi populárnu metódu v počiatočnom štádiu objavovania liekov.

Optimalizácia podmienok tlmenia cieľových proteínov a ich ligandových komplexov môže byť podstatná pre úspech projektu, ako dokazuje mnoho príkladov z literatúry 31, 32, 33, 34. Pri typickom teste trvajúcom menej ako 2 hodiny vrátane času nastavenia predstavujú TSA a nanoDSF spojené s obrazovkami stability rýchlu a lacnú techniku ​​na optimalizáciu pufra.

Zverejnenia

Autori nemajú čo prezradiť.

Poďakovanie

Tento projekt získal financovanie od Európskej rady pre výskum (ERC) v rámci programu Európskej únie pre výskum a inovácie Horizont 2020 (zmluva o grante n° 685778). Túto prácu podporila Rada pre výskum biotechnológie a biologických vied (BBSRC, grantové čísla BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB ďakuje BBSRC Doctoral Training Partnership Newcastle-Liverpool-Durham za štipendium a Durham University Department of Bisciences za prispenie k financovaniu tejto práce. Ďakujeme Ianovi Edwardsovi za jeho pomoc a Katedre hmotnostnej spektrometrie na Durhamskej univerzite za inštrumentálnu analýzu Proteínu X. Sme vďační Arnthorovi Ævarssonovi za jeho prácu na projekte Virus-X a ďakujeme aj Claire Hatty a NanoTemper GmbH za požičanie a asistenciu so systémom Prometheus NT.48 pre tento projekt. Nakoniec ďakujem Frances Gawthrop a Tozer Seeds za ich podporu v rámci ocenenia BBSRC iCASE.


Pozri si video: What is a Protein? Learn about the 3D shape and function of macromolecules (November 2022).