Informácie

Ako podrobne sledovať embryo zebričky?

Ako podrobne sledovať embryo zebričky?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aký veľký zoom mikroskopu by som potreboval, aby som mohol sledovať vývoj embrya Zebrafish v určitých detailoch? Ďakujem chlapci!


Z osobnej skúsenosti by malo postačovať pozorovanie zebričiek pri 10-20-násobnom zväčšení pre rozsiahle štrukturálne zmeny počas vývoja. Ak má váš mikroskop 10x okulár, potom by to bolo 1-2x priblíženie. Ak pozorujete subcelulárne zmeny, prospelo by vám vyššie zväčšenie.


Zebrafish

Abstraktné

Zebrafish je uznávaný ako ideálny modelový organizmus na skúmanie bunkových a molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom tvorby a regenerácie srdca. Zebrafish má uzavretý kardiovaskulárny systém a srdcový cyklus, ktorý veľmi pripomína ľudskú kardiovaskulárnu fyziológiu. Zebrafish môže byť geneticky manipulovaný a ich genóm bol plne sekvenovaný. Genetické štúdie u zebričiek objavili nové gény a cesty v kardiovaskulárnom vývoji a funkcii, s úzkou koreláciou s kardiovaskulárnymi ochoreniami. K regenerácii srdca zebrafish dochádza po poranení prostredníctvom dediferenciácie a proliferácie zrelých kardiomyocytov. Skríningy malých molekúl založené na embryách objavili chemické sondy a kandidátov liekov na zlepšenie kardiovaskulárneho vývoja, funkcie a regenerácie.


Zebrafish, živé zrkadlo

V suteréne budovy Life Sciences Building je v radoch na kovových policiach systematicky rozmiestnených okolo 1 500 akvárií s rybami, od kufríkov až po malé prepravky. Od oplodneného vajíčka po dospelého jedinca predstavuje približne 20 000 rýb celý životný cyklus zebričiek, čo Bruceovi Draperovi poskytuje komplexný pohľad na ich rast.

„Ak sa pozeráte na proces vývoja – teda prechod od oplodneného vajíčka k plávajúcemu organizmu, ktorý sa živí – celý tento proces sa u cicavcov deje v maternici, takže v skutočnosti musíte obetovať mamu, aby ste dostali embryá na štúdium. ich,“ hovorí Draper. "U zebričiek je to všetko vonkajšie oplodnenie."

Časť Draperovho výskumu sa zameriava na problémy reprodukčného vývoja. Zebrafish (Danio rerio) sa na tento výskum dobre hodí, pretože ich embryá sú čisté a poskytujú okno do biologického aparátu za ich formovaním. Ako ryby starnú, vytvárajú pruhy a strácajú svoju priehľadnosť.

Výskumníci tento problém obchádzajú genetickou modifikáciou zebričky pomocou gonády – orgánu zodpovedného za produkciu spermií a vajíčok – ktorá žiari pod ultrafialovým svetlom. To umožňuje nepretržité monitorovanie vývoja pohlavných žliaz, keď ryby rastú, poskytujúc informácie o chorobách reprodukčného vývoja, ako je rakovina vaječníkov.

Predtým Draper a jeho kolegovia identifikovali gén fgf24 ako dôležitý pre vývoj gonád u zebričiek. Mutantné zebričky vyvinuli chybné pohlavné žľazy a mali obmedzené reprodukčné schopnosti. Aj keď nie je známe, že by sa táto špecifická génová signalizácia podieľala na vývoji pohlavných žliaz u cicavcov, mnohé agresívne rakoviny vaječníkov korelujú s hyperaktívnou signálnou dráhou súvisiacou s týmto génom. Celkovo asi 84 percent génov spojených s ľudskými chorobami má náprotivky v zebričkách.

Docent Bruce Draper používa zebrafish na štúdium vývoja gonád. Dizajn: Steve Dana/UC Davis

Draper a jeho kolegovia skúmajú, ako by jednobunkové sekvenovanie RNA mohlo pomôcť posunúť ich výskum. Táto technika umožňuje pohľad na jednotlivé bunky a gény, ktoré exprimujú, s vysokým rozlíšením.

"Teraz identifikujeme na oveľa jemnejšej úrovni, aké gény sú exprimované v konkrétnych bunkách," hovorí a poznamenáva, že najagresívnejšie formy rakoviny vaječníkov sa zvyčajne vyskytujú v bunkových výstelkách orgánu. "Máme veľký záujem pokúsiť sa identifikovať tieto epitelové bunky v našom súbore údajov, aby sme sa mohli začať pýtať, aké ďalšie gény sú tam exprimované."

Draperove techniky pre tento projekt sú informované Celinou Juliano, ktorej kancelária je len pár dverí od jeho.


Zebrafish pomôže odhaliť stopy ľudskej choroby

Máj 2018 – Od podlahy po strop, v rade za radom malých bublajúcich nádrží, 30 000 malých tropických rýb odhaľuje tajomstvá chorôb, ktoré trápili generácie výskumníkov a lekárov.

Skromný zebrafish, palec a pol dlhý sladkovodný člen čeľade mieňovitých, pochádza z potokov, rybníkov a mlák v himalájskej oblasti. Nevyzerá veľmi ako zebra, aj keď má päť vodorovných pruhov, ktoré zdobia obe strany.

Jednou z najzaujímavejších vecí na zebričkách je, že keď niečo stratia – oko, plutvu, chvost, dokonca aj jednotlivé typy buniek – narastie im nové.

Keďže ich genetický profil je nápadne podobný nášmu, zebričky sa nachádzajú aj v Miller Research Building v lekárskom areáli Univerzity Johna Hopkinsa, kde vedcom poskytujú genetické stopy k lekárskym záhadám. Ryby pomohli vyšetrovateľom z Johns Hopkins urobiť dôležité prelomy smerom k regenerácii očného tkaniva, pochopeniu rakoviny štítnej žľazy a pochopeniu spleti DNA, ktoré regulujú bunkovú aktivitu.

Centrum pre funkčné vyšetrovanie v Zebrafish - alebo centrum FINZ - je hlavným výskumným zariadením Inštitútu genetickej medicíny McKusick-Nathans. Tridsať rôznych jadier z oddelení na Univerzite Johna Hopkinsa ponúka viac ako 500 rôznych služieb súvisiacich s výskumom. Centrá umožňujú vyšetrovateľom zdieľať cenné zdroje a odborné znalosti, čím šetria čas aj doláre.

Spoluriaditeľ centra FINZ Jeff Mumm z Wilmer Eye Institute a McKusick-Nathans Institute hovorí, že okrem troch výskumníkov Johns Hopkins, ktorí tam v súčasnosti udržiavajú nádrže s rybami, centrum spolupracuje s ďalšími vedcami.

Za poplatok ponúka FINZ kolegom v celej inštitúcii množstvo genetických služieb vrátane úpravy genómu na produkciu rýb so znakmi, ktoré chcú výskumníci študovať. Napríklad výskumník, ktorý chce študovať, ako sa pečeň vyvíja a funguje, môže požiadať centrum FINZ, aby produkovalo zebrafish so žiariacimi pečeňami. Tím FINZ, ktorý prevzal gén z medúzy, ktorý umožňuje ich žiarivú žiaru, vnesie tento gén do zebričky, čím rozsvieti pečeň a umožní výskumníkom pozorovať jej rast a funkciu.

„Toto je druh práce, ktorú robíme stále,“ hovorí mama. "Je to lacný a efektívny proces spolupracovať s nami na vytvorení geneticky modifikovaných zebričiek pre špecifické výskumné potreby."

V roku 2004 genetik Andy McCallion spolu s bývalými kolegami Shannonom Fisherom a Stevenom Leachom navrhli, aby Johns Hopkins vybudoval vlastné zariadenie na lov zebričiek. McCallion, ktorý spoluriadi centrum FINZ, a Fisher, teraz člen fakulty na Bostonskej univerzite, presvedčili vedenie lekárskej fakulty, že zebrafish ponúka efektívnejší a menej nákladný spôsob výskumu genetiky.

McCallion a jeho tím laboratória prenikajú hlboko do genetických kódov, ktoré riadia, kedy a kde sa gény zapínajú/vypínajú, pričom kombinujú špičkové genomické nástroje a výpočtovú umelú inteligenciu, aby našli abnormality, ktoré môžu ovplyvniť choroby, ako je Parkinsonova choroba. Hovorí, že hoci táto práca zostáva namáhavá, na začiatku jeho kariéry to bolo oveľa ťažšie.

"Mohli sme vidieť sekvencie, ktoré boli medzi rôznymi druhmi veľmi podobné, ale nemali sme rozsiahly a genómový spôsob, ako otestovať naše hypotézy," spomína McCallion. „Potrebovali sme spôsob, ako otestovať stovky a stovky týchto vecí. Z mnohých dôvodov nám štúdium rýb dáva túto schopnosť.“

Okrem genetickej podobnosti s ľuďmi majú zebričky aj ďalšie atribúty, ktoré ich robia príťažlivými pre vedcov, ktorí potrebujú skúmať veľké množstvo toho istého organizmu. Ryby sa rýchlo rozmnožujú a dospievajú, ľahko sa udržiavajú a ich vajíčka sú oplodnené mimo tela, čo umožňuje výskumníkom zbierať novo oplodnené embryá. Na vytvorenie požadovanej vlastnosti u rýb môžu zaviesť nové gény alebo odstrániť gény z odobratých embryí. A keďže embryá zebričiek sú priesvitné, vedci môžu sledovať ich vývoj v reálnom čase a sledovať, ako orgány a celé systémy rastú z kmeňových buniek.

Mumm hovorí, že zatiaľ čo sa veda zamerala na myši ako modely na štúdium chorôb od vytvorenia prvej geneticky zmenenej myši v roku 1980, zebričky sa v posledných rokoch ukázali ako dôležitý modelový druh.

Výskum zebrafish | Zo zákulisia zariadenia Johns Hopkins Zebrafish Facility

Zebrafish hrá dôležitú úlohu vo výskume v Johns Hopkins. Frazer Matthews a Hannah Edelman nás vezmú na prehliadku zariadenia, kde 30 000 rýb pomáha výskumníkom odhaliť stopy choroby.

Po mnoho rokov boli ovocné mušky preferovaným druhom genetických výskumníkov, ktorí zdieľali viac ako 61 percent génov s ľuďmi. A zatiaľ čo hmyz stále hrá dôležitú úlohu, kľúčové fyziologické rozdiely robia ryby, ako ostatné stavovce, príťažlivými.

Zatiaľ čo zebričky zdieľajú asi 71 percent ľudského genómu, v niektorých kľúčových prípadoch sú rybie gény pre ľudí takmer dokonalé. Podľa štúdie britských vedcov z roku 2013 má 82 percent génov spojených s ľudskými chorobami a poruchami náprotivok zebričky.

Myši a ľudia sú si geneticky bližšia, asi na 85 percent. Mumm však hovorí, že „zebrička poskytuje novú perspektívu a poskytuje jedinečné príležitosti nad rámec toho, čo je možné u myší.“ Mumm Lab sa špecializuje na „vysoko výkonnú biológiu“, kde automatizované zariadenia spracúvajú veľké množstvo vzoriek, aby umožnili rozsiahly chemický a genetický skríning.

Tento prístup je ťažké a nákladné aplikovať na myši, a preto bol do značnej miery obmedzený na prácu s bunkovou kultúrou. Avšak kvôli svojej malej veľkosti sa zebrafish objavil ako platforma živého modelu choroby na objavovanie liekov s vysokou priepustnosťou. Laboratórium Mumm vyvinulo skríningový prístup na báze zebričiek, ktorý vyhodnocuje účinky liekov rýchlejšie ako kedykoľvek predtým a spracováva desiatky tisíc rýb denne.

Pretože ich gény môžu byť modifikované tak lacno a vo veľkom počte, Mumm hovorí, že zebrafish umožňuje vedcom vykonávať aj rozsiahle iniciatívy v oblasti genetického výskumu a skúmať funkciu väčšieho počtu génov v kratšom čase.

Chirurg Johns Hopkins Jason Prescott udržiava v centre FINZ početné akváriá so zebričkami. Tri dni v týždni operuje pacientov, ktorí majú rakovinu štítnej žľazy. Má však aj výskumné laboratórium, ktorého cieľom je jedného dňa zvrátiť vývoj choroby a eliminovať potrebu chirurgického zákroku. Zebrafish pomáha Prescottovi lepšie pochopiť, ako môžu genetické mutácie spôsobiť, že sa zdravá štítna žľaza zmení na rakovinu.

„Cieľom je vyradiť sa z chirurgického biznisu,“ hovorí.

Prescott a jeho laboratórny tím skúmajú chybné génové kódovanie u pacientov, ktorí k nemu prichádzajú na operáciu rakoviny štítnej žľazy. Keď izolujú chybný gén pacienta, zavedú podobný gén do zebričiek. Potom pozorujú ryby, aby sa dozvedeli pôvod rakovinových buniek a ako sa replikujú.

"Ryby majú štítnu žľazu, ktorá je veľmi podobná tej našej," hovorí Prescott. „Anatomicky sú takmer na rovnakom mieste a vykonávajú podobnú funkciu. A keďže žijú, môžeme skutočne vidieť biológiu v reálnom čase, ako sa to stáva."

Ryby tiež umožňujú rýchle a efektívne testovanie liekov na boj proti chorobám.
"Obchádzaním primitívnejších skríningových techník sme schopní ušetriť čas a peniaze testovaním liekov na stovkách rýb naraz," hovorí. V jednom príklade Prescottovho výskumu sa jednotlivé ryby, geneticky modifikované tak, aby mali rakovinové štítne žľazy, umiestnili do plytkých nádob s vodou. Ryby boli navrhnuté tak, aby ich štítna žľaza žiarila, keď konkrétny liek spôsobí konkrétnu reakciu. Vedci zavádzajú do vody rôzne liečivé zlúčeniny a študujú výsledky.

Zebrafish zohral kľúčovú úlohu v úsilí Prescotta o farmaceutické objavy v boji proti rakovine štítnej žľazy.

„Zlatým štandardom pre predklinické štúdie liekov je práca so živým organizmom,“ hovorí. "Umožňuje nám to oveľa realistickejšie prostredie ako práca s bunkami rastúcimi na tanieri."

Kapacita samoopravy

Študentka medicíny Hannah Edelman má za sebou šesť rokov M.D./Ph.D. program, výskum ľudskej genetiky a detského diabetu. Trávi veľa hodín v centre FINZ, kde študuje, ako zebrička nikdy nedostane túto chorobu.

Pri cukrovke 1. typu imunitný systém pacienta napáda a ničí bunky v pankrease, ktoré produkujú inzulín, hormón, ktorý reguluje hladinu cukru v krvi. Kým ľudia nedokážu tieto bunky regenerovať, zebrička áno.

"Môžu znovu vyrásť beta bunky pankreasu," hovorí, pričom odkazuje na bunky, ktoré uchovávajú a uvoľňujú inzulín. „Chcem vedieť, čo je také výnimočné, čo im to umožňuje. Snažíme sa nájsť spôsob, ako by ľudia dokázali tieto bunky regenerovať. To by znamenalo veľa pri liečbe cukrovky 1. typu.“

V práci Mumm, ktorá študuje degeneratívne očné choroby, využíva skutočnosť, že ľudia a zebričky majú spoločnú vlastnosť – špecifický bunkový typ, ktorý sa môže premeniť na kmeňovú bunku – ktorá im umožňuje produkovať nové bunky ako odpoveď na zranenie alebo ochorenie v sietnica. Oba druhy teda majú schopnosť produkovať nové bunky na liečenie oka.

„Niekde počas svojej evolučnej selekcie si zebričky vyvinuli schopnosť samoopravy,“ hovorí Mumm.

Rozdiel, hovorí Mumm, je v tom, že zatiaľ čo nové bunky vedú k úplne novej sietnici u zebričky, ľudia také šťastie nemajú. "Pre nás sa nové bunky stávajú zjazveným tkanivom." V skutočnosti to ľuďom viac škodí ako pomáha.“ V bunkovej kultúre však tieto ľudské retinálne kmeňové bunky reagujúce na poškodenie majú schopnosť produkovať nové neuróny.

Dúfa, že keď sa dozvieme, ako sú kontrolované silné regeneračné schopnosti zebričky, môžeme využiť spiace regeneračné schopnosti u pacientov s degeneratívnymi ochoreniami očí. Hovorí, že ryby urýchľujú proces tým, že pomáhajú odstraňovať vedecké slepé uličky rýchlejšie ako kedykoľvek predtým.

Spojením týchto štúdií s vysokovýkonnými skríningovými technikami vo svojom laboratóriu Mumm hovorí: „Môžeme zistiť, čo nefunguje v prvom kroku, a nie v kroku 52. To predstavuje veľa ušetreného času a peňazí.“


Dynamika fotoreceptorových progenitorov v sietnici embrya zebrafish a jej modulácia primárnymi mihalnicami a N-kadherínom

Pozadie Fotoreceptory neurálnej sietnice stavovcov pochádzajú z neuroepitelu a podobne ako iné neuróny musia podstúpiť translokáciu bunkového tela a prechod polarity, aby získali svoju konečnú funkčnú morfológiu, ktorá zahŕňa znaky neurónových a epitelových buniek.

Metódy Tento proces sme podrobne analyzovali na embryách zebričiek in vivo konfokálna mikroskopia a elektrónová mikroskopia. Progenitory fotoreceptorov boli označené transgénnou expresiou EGFP pod reguláciou promótora špecifického pre fotoreceptory crxa gény, ktoré nás zaujímali, boli vyradené pomocou morfolínových oligomérov.

Výsledky Progenitory fotoreceptorov sa oddelili od bazálnej sietnice v premitotických štádiách, čím sa rýchlo stiahol krátky bazálny proces, keď sa bunkové telo translokovalo apikálne. Zostali v apikálnej polohe na neurčito, aby vytvorili vonkajšiu jadrovú vrstvu (ONL), spočiatku sa rozťahovali a zaťahovali vysoko dynamické procesy podobné neuritom, tangenciálne k apikálnemu povrchu. Mnoho progenitorov fotoreceptorov malo krátke apikálne primárne cilium. Počet a dĺžka týchto mihalníc sa postupne zmenšovala, až takmer vymizli okolo 60 hpf. Ich narušenie zrútením IFT88 a Elipsa spôsobilo notoricky známu poruchu retrakcie bazálneho procesu. Časozberná analýza knock-down N-kadherínu, liečby, o ktorej je známe, že spôsobuje vážne narušenie ONL, ukázala, že progenitory ektopických fotoreceptorov spočiatku migrovali zdanlivo náhodným spôsobom, čím výrazne predĺžili bunkové procesy, kým sa nestretli s inými bunkami, aby vytvorili bunkové rozety, v ktorých zostali a získali polaritu podobnú fotoreceptoru.

Záver Celkovo naše pozorovania naznačujú komplexnú reguláciu dynamiky progenitorov fotoreceptorov na vytvorenie sietnicového ONL pred štádiami postmitotického dozrievania.


Biomedicínsky výskum III: komunikácia medzi mozgom a inými orgánmi

Ľudská puberta je dynamický proces, ktorý iniciuje komplexné interakcie hypotalamo-hypofýzy-gonadálnej osi (os HPG), ktorá označuje jednotlivé endokrinné žľazy ako jednotlivé entity. HPG os hrá rozhodujúcu úlohu pri vývoji a regulácii mnohých telesných systémov, najmä reprodukcie 39 . Hormón uvoľňujúci gonadotropín (GnRH), vylučovaný hypotalamom v mozgu, cirkuluje cez prednú časť hypofýzového portálneho systému hypofýzy a viaže sa na receptory na sekrečných bunkách adenohypofýzy40. V reakcii na stimuláciu GnRH tieto bunky produkujú luteinizačný hormón a folikuly stimulujúci hormón, ktoré cirkulujú v krvnom obehu 41 . Preto sa z adolescenta vyvinie zrelý dospelý s telom schopným sexuálnej reprodukcie 42 . Kallmannov syndróm (KS) je genetická porucha, o ktorej je známe, že bráni človeku začať alebo úplne dokončiť pubertu. V štúdii, ktorá ukazuje, že WDR11 génová mutácia sa podieľa na patogenite KS, zebrafish wdr11 Ukázalo sa, že gén je exprimovaný v oblasti mozgu, čo naznačuje potenciálnu úlohu pre interakciu proteínu WDR11-EMX143.

Okrem toho je známe, že akútny zápal spúšťa regeneračnú reakciu po traumatickom poranení v mozgu dospelých zebričiek. Cysteinylleukotriénový receptor 1 (cysltr1)-leukotrién C4 (LTC4) dráha je potrebná a dostatočná pre zvýšenú proliferáciu a neurogenézu44. LTC4, jeden z ligandov pre CysLT1, sa viaže na svoj receptor Cysltr1 exprimovaný na radiálnych gliových bunkách v mozgu zebričky44. V štúdii Kyritsis et al. cysltr1 sa vo zvýšenej miere exprimoval na radiálnych gliových bunkách po traumatickom poranení mozgu, čo naznačuje krížovú komunikáciu medzi zložkami zápalovej reakcie a centrálnym nervovým systémom počas traumatického poranenia mozgu44.

Rodina nikotínamid adenín dinukleotid fosfát (NADPH) oxidázy (NOX) sa podieľa na produkcii reaktívnych foriem kyslíka v reakcii na rôzne extracelulárne signály. Duálna oxidáza (DUOX) člena rodiny NOX bola identifikovaná ako NADPH oxidáza štítnej žľazy. U ľudí boli mutácie DUOX2 identifikované u detí s diagnostikovanou vrodenou hypotyreózou. Nedávno sa preukázalo, že okrem strumy štítnej žľazy a spomalenia rastu boli zistené defekty v reakcii na úzkosť a sociálnej interakcii duox-knokaut zebrafish 45 . Tieto výsledky tomu nasvedčujú duox- zebrička s knockoutom by mohla slúžiť ako účinný zvierací model pre štúdie vývoja štítnej žľazy a súvisiacich neurologických ochorení vrátane mentálneho postihnutia a autizmu.

Je známe, že veľké percento detí s PAS má gastrointestinálne problémy, ako je zápcha, hnačka a bolesť brucha. Nedávne štúdie o osi mozog-črevo tiež ukázali, že interakcie s mikrobiálnymi komunitami spojenými s hostiteľom, buď priamo prostredníctvom mikrobiálnych metabolitov alebo nepriamo prostredníctvom imunitného, ​​metabolického alebo endokrinného systému, môžu pôsobiť ako zdroje environmentálnych podnetov. Molekulárne signály z čreva poskytujú environmentálne podnety pre komunikáciu medzi črevom a mozgom počas epizód súvisiacich s úzkosťou, depresiou, kogníciou alebo poruchou autistického spektra (ASD) 46 . Okrem toho modulácia vnútorných signálnych dráh a vonkajších podnetov v rezidentných črevných baktériách zvyšuje stabilitu β-katenínu v črevných epiteliálnych bunkách, čím podporuje bunkovú proliferáciu 47 .


Proteínová sekrečná dráha

Sekrečná dráha vytvára, transportuje a spracováva proteíny určené pre extracelulárny priestor alebo plazmatickú membránu. Zahŕňa endoplazmatické retikulum (ER), ER-Golgiho intermediárny kompartment (ERGIC), Golgiho komplex a vezikuly, ktoré medzi sebou nesú náklad (obr. 2). Syntéza proteínov a glykozylácia sa vyskytujú v ER a Golgiho, v danom poradí. Komplex plášťového proteínu II (COPII) uľahčuje selekciu nákladu, tvorbu vezikúl a anterográdny prenos z ER do Golgiho aparátu, zatiaľ čo retrográdny transport sa vyskytuje vo vezikulách COPI (obr. 1F, obr. 2). Rôzne proteínové komplexy fungujú v každom kroku tejto dráhy na získavanie Rab GTPáz a SNARE proteínov, ktoré nasmerujú a pripútajú vezikuly na cieľové organely a uľahčia membránovú fúziu.

Komponenty sekrečnej dráhy študované u zebričiek a zapojené do ľudských chorôb. Proteíny sekrečnej dráhy, ktoré sa podieľajú na ľudských chorobách, sú zobrazené čiernou farbou so zodpovedajúcimi nástrojmi zebrafish na ich štúdium červenou farbou. NTD, defekty neurálnej trubice CLSD, kranio-lentikulárno-suturálna dysplázia CDAII: vrodená dyserytropoetická anémia II CMRD, chylomikrónová retencia LGMD, svalová dystrofia pletenca končatín SEDL, X-viazaná spondyloepifýzová dysplázia tarda ID, mentálne postihnutie.

Komponenty sekrečnej dráhy študované u zebričiek a zapojené do ľudských chorôb. Proteíny sekrečnej dráhy zapojené do ľudských chorôb sú zobrazené čiernou farbou so zodpovedajúcimi nástrojmi zebrafish na ich štúdium červenou farbou. NTD, defekty neurálnej trubice CLSD, kranio-lentikulárno-suturálna dysplázia CDAII: vrodená dyserytropoetická anémia II CMRD, chylomikrónová retencia LGMD, svalová dystrofia pletenca končatín SEDL, X-viazaná spondyloepifýzová dysplázia tarda ID, mentálne postihnutie.

Práca v jednobunkových organizmoch a kultivovaných bunkách vytvorila predpoklad, že sekrécia proteínov je rovnomerne regulovaná medzi typmi buniek. Štúdie na ľuďoch, zebričkách a iných stavovcoch však odhalili, že táto dráha je regulovaná časopriestorovým a paralogovo špecifickým spôsobom (Melville a Knapik, 2011 Unlu a kol., 2013). Hoci všetky bunky vylučujú proteíny, niektoré – vrátane B-buniek, chondrocytov, hepatocytov a endokrinných a exokrinných pankreatických buniek – sa považujú za „profesionálne“ sekrečné bunky a predpokladá sa, že tieto bunky sú obzvlášť citlivé na narušenie sekrečnej dráhy. Mutanty zebrafish v génoch sekrečnej dráhy túto hypotézu podporili aj vyvrátili: niektoré mutanty vykazujú fenotypy vo väčšine vysoko sekrečných buniek, zatiaľ čo iné majú fenotypy, ktoré sú obmedzené iba na podskupinu buniek.

Objavuje sa názor, že sekrečný mechanizmus je neoddeliteľnou súčasťou morfogenézy a funkcie orgánov bunkovo ​​špecifickým spôsobom. Dostupnosť genetických mutantov zebričiek a fluorescenčných in vivo reporters poskytuje nový pohľad na organizačné funkcie sekrečnej dráhy. Účinky narušenia sekrečnej dráhy relevantné pre vývoj a ochorenie sú diskutované nižšie.

Vývojové dôsledky narušenia sekrečnej dráhy

Komplex COPII obsahuje Sar1 GTPázu, diméry Sec23–Sec24 vnútorného plášťa a heterotetraméry Sec13–Sec31 vonkajšieho plášťa (obr. 2 Kaiser a Schekman, 1990 Novick et al., 1980). Mutantov zobričiek sek23a (drvič) a sek24d (buldog) rozvíjať kraniofaciálnu dysmorfológiu, zalomené prsné plutvy a krátku dĺžku tela (Lang et al., 2006 Sarmah et al., 2010). Tieto sa pripisujú zlyhaniu sekrécie extracelulárnej matrice (ECM) počas diferenciácie chondrocytov. Zvieratá s deficitom Sec23A a Sec24D nedokážu exportovať kolagén a iné N-glykozylované proteíny z chondrocytov ER, čím zastavujú diferenciáciu a v konečnom dôsledku spôsobujú bunkovú smrť (Lang a kol., 2006 Sarmah a kol., 2010 Unlu a kol., 2013), keďže sekrécia kolagénu a vývoj kostry sú nedotknuté po vyčerpaní blízkeho paralógu Sec24C (Sarmah et al., 2010). Mutácie Sec23B u ľudí a zebričiek narúšajú erytropoézu (Bianchi a kol., 2009 Schwarz a kol., 2009), čo je fenotyp odlišný od defektov chondrocytov pozorovaných v drvič a buldog mutantov. Tieto fenotypy COPII sa líšia od trpasličích mutantov kýchavý, šťasný a blbý, ktoré narúšajú gény kódujúce podjednotky α, β, respektíve β′ COPI komplexu (obr. 2), ktoré sú charakterizované defektmi v tvorbe notochordu a melanozómu (Coutinho et al., 2004). Tieto údaje naznačujú, že hoci COPI a COPII sú potrebné na účinnú sekréciu a recykláciu membrán vo všetkých bunkách, strata špecifických členov každého komplexu má hlboké a odlišné účinky na podskupinu buniek. Mutácie v jednotlivých komponentoch COPII spôsobujú celý rad fenotypov vo vysoko sekrečných typoch buniek v orgánoch, ako sú chrupavka, notochord, oko a črevo (Niu a kol., 2012 Schmidt a kol., 2013 Townley a kol., 2008 Townley a kol., 2012) a v erytrocytoch (Bianchi a kol., 2009 Schwarz a kol., 2009 Unlu a kol., 2013), zatiaľ čo bunky, ktoré závisia od tvorby vakuol, sú najcitlivejšie na depléciu COPI.

Ako teda transkripčné regulačné mechanizmy riadia sekrečnú dráhu, aby zabezpečili včasnú dostupnosť obalov špecifických pre náklad? Veľkoplošná obrazovka u zebričiek identifikovala cítiť sa dobre mutant, ktorý nesie missense variant v creb3L2 gén (Driever et al., 1996 Knapik, 2000 Neuhauss et al., 1996) – prvý známy transkripčný faktor, ktorý reguluje dostupnosť komponentov COPII sek24d a sek23a, ale nie sek24c (Melville a kol., 2011). Podobnosti medzi cítiť sa dobre, drvič a buldog mutantné fenotypy naznačujú, že „sekrečný modul“ pozostávajúci z Creb3L2 – Sec23A – Sec24D sa špecializuje na sekréciu prokolagénu. Vzhľadom na to, že zebrafish zbavená Sec24C neprejavuje kostnú dysmorfológiu a gén nie je cieľom Creb3L2, je pravdepodobné, že iné sekrečné moduly špecifické pre náklad regulujú sek24c a ďalšie gény v tejto dráhe. Budúce štúdie na zebrafish a iných zvieracích modeloch budú potrebné na rozlúsknutie kódu fyziologicky relevantných sekrečných sietí špecifických pre náklad.

Choroby spôsobené porušením sekrečnej dráhy u zebričiek a ľudí

Niekoľko ľudských syndrómov je spojených s defektmi sekrečnej dráhy (De Matteis a Luini, 2011), z ktorých niektoré sú rekapitulované v mutáciách v ortologických génoch zebričiek (obr. 2). Súbežná identifikácia drvič/sek23a mutantov u zebričiek a pacientov s variantmi SEC23A/kranio-lenticulo-suturálnej dysplázie (CLSD) (Boyadjiev a kol., 2006 Lang a kol., 2006) poskytuje vynikajúci príklad konvergencie medzi ľudskou genetikou a vývojovou biológiou zebričiek na odhalenie fyziologických dôsledkov spôsobených narušením základných bunkových biologických procesov. Obaja drvič mutanti a pacienti s CLSD majú kraniofaciálnu dysmorfológiu a defekty axiálneho skeletu pripisované nevybaveným ECM proteínom v ER (Boyadjiev et al., 2006 Lang et al., 2006). Úzko súvisiace SEC23B gén je zmutovaný u pacientov s vrodenou dyserytropoetickou anémiou typu II, ktorí majú viacjadrové erytroblasty v kostnej dreni, fenotyp rekapitulovaný u zebričiek sek23b morfantov (Bianchi a kol., 2009 Schwarz a kol., 2009).

Nie je jasné, prečo mutácie v paralógoch SEC23A a SEC23B, ktoré sa líšia iba úsekom 18 aminokyselín, spôsobujú také odlišné fenotypy. Jednou z možností je, že časopriestorové rozdiely v expresii udeľujú bunkovo ​​špecifické funkcie niektorých génov komplexu COPII. Avšak, ako sar1a a sar1b sú všadeprítomne exprimované na začiatku vývoja a neskôr sa obohacujú v odlišných tkanivách (E.W.K., nepublikované pozorovania), je nepravdepodobné, že ich vzor génovej expresie je výlučne zodpovedný za odlišné fenotypy pozorované u týchto mutantov.

Kraniofaciálne fenotypy mutantov COPII naznačujú, že chondrocyty sú vysoko citlivé na sekrečné defekty ECM. To predpovedá, že iné manipulácie, ktoré blokujú sekrečnú dráhu, by tiež spôsobili kraniofaciálnu dysmorfológiu. Toto však nepodporujú údaje od zebričiek alebo ľudí, keď sú faktory fungujúce na iných krokoch v sekrečnej dráhe vyčerpané. Komplex transportných proteínových častíc (TRAPP) pripútava vezikuly odvodené od ER k cis-Golgiho membráne (obr. 2 a Sacher et al., 2008). Fibroblasty od pacientov s TRAPPC11 alebo TRAPPC2 mutácie (Bögershausen et al., 2013 Scrivens et al., 2009) a kultivované bunky zbavené TRAPPC11 (Scrivens et al., 2011 Wendler et al., 2010) vykazujú Golgiho fragmentáciu a retenciu sekrečných proteínov. Avšak, keď sú tieto proteíny vyčerpané v celých organizmoch, ich bunkovo ​​špecifické úlohy sú odhalené: pacienti s TRAPPC2 mutácia vyvíja spondyloepifýzovú dyspláziu tarda (SEDT), ktorá sa vyznačuje skeletálnymi defektmi, nízkym vzrastom a mikrocefáliou (Gedeon a kol., 1999 Huson a kol., 1993). Toto je rekapitulované v trappc2 zebrafish morfanty, ktoré majú krátky trup a mikrocefáliu (A. M. Vacaru a K. C. Sadler, nepublikované). Krátky vzrast a/alebo fenotyp trupu môže odrážať defekt v tvorbe chondrocytov alebo v ukladaní ECM, ako u mutantov COPII, ale pacienti a zebričky s TRAPPC11 mutácia je prítomná veľmi odlišne. Mutácia TRAPPC11 u ľudí spôsobuje myopatiu, intelektuálne poškodenie a hyperkinetické pohyby (Bögershausen et al., 2013). Zaujímavé je, že zebra foie gras (foigr) mutanty nesúce mutagénnu vírusovú inzerciu v trappc11 gén vykazujú odlišný fenotyp ako iné modely narušenia komplexu TRAPP: vyvíja sa u nich stukovatenie pečene, hepatomegália, menšie črevá a čeľuste a defekty plutiev (Cinaroglu et al., 2011 Sadler et al., 2005). The foigr/trappc11 fenotyp stukovatenej pečene sa čiastočne pripisuje aktivácii rozloženej proteínovej odpovede (Cinaroglu et al., 2011), avšak ani cicavčie kultivované bunky, ktoré sú zbavené TRAPPC11, ani trappc2 morfanty vyvolávajú túto reakciu (A.M.V. a K.C.S., nepublikované pozorovania), čím sa zdôrazňuje užitočnosť in vivo štúdie bunkovej biológie na stavovcoch.

Jedinečné fenotypy, ktoré odlišujú narušenie komplexu TRAPP od mutácií COPII alebo COPI, naznačujú, že globálny blok v sekrécii proteínov nie je jediným mechanizmom, ktorý je základom ich súvisiacich fenotypov. Okrem toho, hoci vyčerpanie jednotlivých faktorov komplexu TRAPP alebo COP má podobné účinky v izolovaných bunkách, fyziologické dôsledky nebolo možné predpovedať bez použitia celých zvierat. Tieto zistenia poukazujú na bunkovo ​​a vývojovo špecifické úlohy pre každý gén zapojený do sekrécie proteínov a podčiarkujú potrebu komparatívnych modelov celých zvierat na dešifrovanie bunkových a fyziologických funkcií tejto dráhy.


Kapitola 9 - Analýza štruktúry a funkcie riasiniek u zebričiek

Cilia sú výbežky na báze mikrotubulov na povrchu väčšiny eukaryotických buniek. Nachádzajú sa vo väčšine, ak nie vo všetkých orgánoch stavovcov. Výrazné riasinky sa tvoria v zmyslových štruktúrach, oku, uchu a nose, kde sú rozhodujúce pre detekciu environmentálnych stimulov, ako je svetlo a pachy. Cilia sa tiež podieľajú na vývojových procesoch, vrátane tvorby ľavo-pravej asymetrie, morfogenézy končatín a vzorovania neurónov v nervovej trubici. Predpokladá sa, že niektoré riasinky, ako napríklad riasinky nachádzajúce sa v nefrických kanálikoch, majú mechanosenzorické úlohy. Zebrafish sa ukázala ako veľmi užitočná pri genetickej analýze a zobrazovaní procesov súvisiacich s riasinkami a pri modelovaní mechanizmov za abnormalitami ľudských rias, známych ako ciliopatie. Množstvo defektov zebričiek sa podobá tým, ktoré sa vyskytujú pri ľudských ciliopatiách. Forward and reverse genetic strategies generated a wide range of cilia mutants in zebrafish, which can be studied using sophisticated genetic and imaging approaches. In this chapter, we provide a set of protocols to examine cilia morphology, motility, and cilia-related defects in a variety of organs, focusing on the embryo and early postembryonic development.


Slovník pojmov

Digital scanned laser light sheet fluorescent microscopy (DSLM): An improved version of SPIM, which uses a thin laser beam rather than a full light sheet, thus reducing damage to both specimen and fluorescent dye.

Gastrulation: The phase in early embryonic development during which the three germ layers are formed: ectoderm, mesoderm and endoderm. The timing and molecular mechanism of gastrulation differ between organisms.

Genetic strain: A genetically uniform group of animals, used in laboratory experiments. A genetic strain can be developed by inbreeding, mutation or genetic engineering.

Single-plane illumination microscopy (SPIM): This method allows 3D observation of processes in living organisms, even in deep tissue layers. It detects fluorescence at an angle of 90° relative to the axis of illumination with a sheet of laser light, permitting optical cutting. The specimen is not positioned on a microscope slide but in a liquid-filled chamber which is rotated during observation.


Math Model Helps Show How Zebrafish Get Their Stripes

A mathematical model developed by Brown University researchers, including doctoral student in Applied Mathematics Alexandria Volkening, is shedding new light on how zebrafish get their iconic stripes. The model helps to demonstrate how two dynamic processes—the movement of pigment cells across the skin, and the birth and death of cells as the fish grows—combine to keep zebrafish stripes in line.

Zebrafish have become quite a popular model organism for biology researchers over the past few decades. The small freshwater fish begin life as transparent embryos and develop in just a few months to full size, giving scientists the chance to watch their development in detail. The emergence of their namesake stripes of dark blue and bright yellow has been the subject of much research. The stripes have been shown to be the result of interplay between three types of pigment cells: black melanophores, yellow xanthophores, and silvery iridophores.

“The stripe pattern forms dynamically as the fish develops,” said Volkening, who is the lead author on the new paper. “It’s not like these pigment cells are filling out some kind of prepattern that’s already there. It’s the interactions of the cells over time that causes the patterns to form. We wanted to build a model that simulates this based as much as possible on what’s known about the biology.”


Pozri si video: Vojníkove kanáriky 2 (November 2022).