Informácie

Hmotnostná spektrometria verzus western blotting na overenie

Hmotnostná spektrometria verzus western blotting na overenie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mám údaje z hmotnostnej spektrometrie (LC-MS/MS) z kôry potkanov buď pri medikamentóznej alebo kontrolnej liečbe. Výsledky sa uskutočnili trojmo (tri páry potkanov, liek alebo kontrola na pár). Okrem niektorých bioinformatických analýz, ktoré robím, budem musieť overiť niektoré násobné zmeny z hmotnostnej spektrometrie pomocou Western blotu, aby boli moje výsledky publikované.

Niektoré z proteínov, ktoré som si vybral na overenie, fungujú veľmi pekne pomocou Western blotu, ktorý zachytáva rovnaký trend ako hmotnostná spektrometria. Avšak iné proteíny, ktoré som sa pokúsil overiť, idú presne opačným smerom.

Moje otázky:

  1. Vo všeobecnosti, aká presná je hmotnostná spektrometria v porovnaní s Western blottingom?
  2. Je nezvyčajné mať veľkú variabilitu medzi výsledkami týchto dvoch metód? Obávam sa, že možno budem musieť vyskúšať viacero proteínov, kým uvidím replikované výsledky, a to sa mi zdá problematické. To ma vedie k tretej otázke.
  3. Akému výsledku mám dôverovať?

Ďalšie informácie - Niektoré z proteínov, ktoré som si vybral na validáciu, pochádzajú z nižšie uvedeného zoznamu, kde sa nezistilo toľko peptidových fragmentov. V niektorých prípadoch boli fragmenty detegované iba v 2 z 3 biologických replikátov. Nevybral som si overenie proteínov, kde sa 2 alebo 3 replikáty značne líšili v normalizovaných hodnotách spektrálneho počtu, takže by som očakával, že tieto hodnoty budú presné. Okrem toho časť experimentu s hmotnostnou spektrometriou vykonalo renomované laboratórium, ktoré filtrovalo chybné údaje pomocou medzných hodnôt FDR. Celkovo existuje vysoká korelácia medzi všetkými tromi replikátmi pre konkrétnu liečbu a nízka štandardná chyba medzi vzorkami v populácii, takže štatisticky verím výsledkom hmotnostnej špecifikácie.

Ak potrebujete viac informácií, opýtajte sa - neviem, čo presne bude užitočné na zodpovedanie mojich otázok.

UPRAVIŤ:

Tento článok pojednáva o opodstatnenosti použitia Western blottingu na overenie výsledkov hmotnostných špecifikácií. Ako alternatívu navrhuje použitie vybraných testov na monitorovanie reakcie. Niektoré body vyjadrené komentátormi v tomto vlákne sú zopakované v tomto článku.


Je bežnou praxou dokázať výsledok pomocou ortogonálnej techniky. Ako RNAseq, po ktorej nasleduje qRT-PCR atď.

Western blot nie je robustná technika a krížové porovnania sú ťažké kvôli rozdielom v aviditách/afinitách rôznych protilátok. Takže porovnania možno vykonať iba s jedným párom proteín-kontrola v rôznych podmienkach.

LC-MS je citlivejšia a menej zaujatá (IMO). Takže všeobecný trik je – nerobte westerny pre všetky proteíny, len nahláste tie, ktoré sa správajú dobre (povedzte, že ste si ich „vybrali“, pretože sú dôležité). Viem, že je to nesprávny postup a nemal by som ho obhajovať. Pre svoje vlastné vedecké overenie to skúste s inou technikou MS; ak ste použili ESI-Quadrupole/ion-Trap atď., skúste to s MALDI-TOF alebo iTRAQ. Niektorí luddisti budú naďalej lipnúť na westerne.

Myslím si, že je lepšie netestovať proteíny, ktoré majú nízky počet peptidov. Pozrite sa, čo je známe ako MA plot. Toto sa často používa pre mikročipy. TuMoznačuje záhybovú zmenu aAoznačuje celkovú expresiu v oboch vzorkách. Nevyberajte proteíny, ktoré majú nízku expresiu v oboch vzorkách; nemusia byť zmysluplné. Napríklad ak máte2molekulyXa100molekulyYv kontrolnom stave a5molekulyXa200molekulyYv teste; potom sa záhyb zmeníXby sa zdalo dôležité; táto zmena však nemusí byť relevantná a môže byť výsledkom stochastickej fluktuácie/chyby merania. Ak máte veľa vzoriek, môžete vidieť, či je niečo stochastické alebo nie, ale obmedzením je počet vzoriek.

Poznámka: Nehovorím, že prírastok 2→5 molekúl by mal byť nezmyselný. Aby ste však vedeli, či majú význam alebo nie, vyžadovali by ste zložitejšie modely; radšej sa im v tejto chvíli vyhnite.


Proteomika hmotnostnou spektrometriou: prístupy, pokroky a aplikácie

Hmotnostná spektrometria (MS) je najkomplexnejším a najuniverzálnejším nástrojom vo veľkom meradle proteomiky. V tomto prehľade rozoberáme celkový rámec experimentu MS na jeho kľúčové komponenty. Diskutujeme o základoch proteomických analýz, ako aj o poslednom vývoji v oblasti separačných metód, prístrojového vybavenia a celkového experimentálneho dizajnu. Zdôrazňujeme prirodzené silné stránky a obmedzenia proteínovej MS a ponúkame hrubý návod na výber experimentálneho dizajnu na základe cieľov analýzy. Zdôrazňujeme všestrannosť Orbitrapu, nového hmotnostného analyzátora, ktorý sa vyznačuje vysokým rozlíšením (až 150 000), vysokou presnosťou hmotnosti (2-5 ppm), rozsahom hmotnosti na nabíjanie 6000 a dynamickým rozsahom väčším ako 10 ( 3). Vysoká presnosť hmotnosti Orbitrapu rozširuje arzenál prístupov k získavaniu údajov a analýze v porovnaní s prístrojom s nízkym rozlíšením. Diskutujeme o rôznych chromatografických technikách vrátane viacrozmernej separácie a ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie. Technológia multidimenzionálnej identifikácie proteínov (MudPIT) zahŕňa prípravu kontinuálnej vzorky, ortogonálne separácie a MS a softvérové ​​riešenia. Diskutujeme o niekoľkých aspektoch aplikácií MudPIT na kvantitatívnu fosfoproteomiku. Aplikácia MudPIT na analýzu fosfoproteínov vo veľkom meradle zahŕňa (a) postup frakcionácie pre motívovo špecifické obohatenie fosfopeptidov, (b) vývoj nástrojov informatiky na skúmanie a overovanie údajov o fosfopeptidoch brokovníc a (c) hĺbkovú analýzu údajov pre simultánne stanovenie proteínovej expresie a hladín fosforylácie, analogicky k meraniam Western blot. Ilustrujeme aplikáciu MudPIT na kvantitatívnu fosfoproteomiku beta adrenergnej dráhy. Diskutujeme o niekoľkých biologických objavoch uskutočnených prostredníctvom potrubí hmotnostnej spektrometrie so zameraním na proteomiku bunkovej signalizácie.


Validácia merania proteínového karbonylu: multicentrická štúdia

Proteínové karbonyly sú široko analyzované ako miera oxidácie proteínov. Na ich určenie existuje niekoľko rôznych metód. Predchádzajúca štúdia opísala rádové rozdiely, ktoré existovali, keď sa proteínové karbonyly analyzovali v jedinom laboratóriu pomocou ELISA s použitím rôznych komerčných súprav. Ďalej sme skúmali potenciálne príčiny rozptylu v karbonylovej analýze v kruhovej štúdii. Rozpustná proteínová frakcia sa pripravila z potkanej pečene a vystavila sa 0, 5 a 15 minút UV žiareniu. Lyofilizované prípravky boli distribuované do šiestich rôznych laboratórií, ktoré bežne vykonávali analýzu karbonylu proteínov v celej Európe. Techniky ELISA a Western blotting detegovali zvýšenie tvorby proteínového karbonylu medzi 0 a 5 minútami UV žiarenia bez ohľadu na použitú metódu. Po ožiarení počas 15 minút polovica laboratórií zistila menej oxidácie ako po 5 minútach ožarovania. Tri zo štyroch karbonylových výsledkov ELISA spadali do 95 % intervalov spoľahlivosti. Pravdepodobné chyby vo výpočte absolútnych hodnôt karbonylu možno pripísať rozdielom v štandardizácii. Z až 88 proteínov identifikovaných ako obsahujúce karbonylové skupiny po tryptickom štiepení ožiarených a kontrolných pečeňových proteínov bolo iba sedem bežných vo všetkých troch pečeňových prípravkoch. Lyzínové a arginínové zvyšky modifikované karbonylmi sú pravdepodobne odolné voči tryptickej proteolýze. Použitie kokteilu proteáz môže zvýšiť regeneráciu oxidovaných peptidov. Záverom je, že štandardizácia je kritická pre karbonylovú analýzu a silne oxidované proteíny nemusia byť účinne analyzované žiadnou existujúcou technikou.

Kľúčové slová: Aldehydová reaktívna sonda Karbonyl ELISA Hmotnostná spektrometria Oxidovaný proteín Western blot Oxidácia proteínu.

Copyright © 2015. Vydal Elsevier B.V.

Figúrky

Primárne a sekundárne proteínové karbonyly…

Primárne a sekundárne proteínové karbonyly a ich derivatizácia pomocou DNPH.

Výpočet kvantifikácie karbonylu podľa…

Výpočet na kvantifikáciu karbonylu analýzou aduktov DNP.

Semikvantitatívny rozpustný pečeňový proteín karbonyl…

Semikvantitatívny obsah karbonylu rozpustného pečeňového proteínu po 0–15 minútach UV ožiarenia. (A) Coomassie...

Kvantifikácia proteínových karbonylov…

Kvantifikácia proteínových karbonylov v rozpustnom proteínovom extrakte z pečene potkana. Denzitometrická analýza…

Karbonylácia proteínov v pečeni potkanov…

Karbonylácia proteínov vo frakcii rozpustných proteínov v pečeni potkanov po zvýšení ožiarenia o…


Možnosti prístupu

Získajte úplný prístup k denníku na 1 rok

Všetky ceny sú ceny NET.
DPH bude pripočítaná neskôr v pokladni.
Výpočet dane bude dokončený pri pokladni.

Získajte časovo obmedzený alebo úplný prístup k článku na ReadCube.

Všetky ceny sú ceny NET.


Nové prístupy k validácii protilátok pomocou imunoprecipitácie a hmotnostnej spektrometrie

Protilátky sa používajú v širokom spektre výskumných a diagnostických aplikácií na obohatenie, detekciu a kvantifikáciu proteínov a ich modifikácií. Proti tisíckam proteínov a ich modifikáciám sú komerčne dostupné státisíce protilátok. Bohužiaľ, mnohé protilátky sú nedostatočne charakterizované, čo vedie k strate času a nákladov, ako aj k potenciálne chybným záverom výskumu. Na overenie výkonnosti a špecifickosti protilátok Thermo Scientific sme vytvorili komplexný pracovný postup na posúdenie špecifickosti protilátok pomocou imunoprecipitácie kombinovanej s hmotnostnou spektrometriou (IP-MS). V predbežných experimentoch sme skrínovali viac ako 500 protilátok proti takmer 100 kľúčovým rakovinovým signalizačným proteínom exprimovaným v 12 kultivovaných nádorových bunkových líniách. Približne 70 % protilátok predtým validovaných na imunozachytenie sa mohlo použiť na zachytenie a identifikáciu zamýšľaného cieľa, interagujúcich proteínov a mimocieľových cieľov a

40 % protilátok, ktoré neboli predtým validované na IP, bolo pozitívnych pomocou IP-MS. Na preukázanie účinnosti týchto protilátok sme použili súbor týchto protilátok na súčasné imunozachytenie dvanástich proteínov v dráhe Akt/mTOR a potom sme kvantifikovali proteíny a ich fosforyláciu v štyroch IGF-stimulovaných bunkových líniách pomocou cielenej kvantifikácie založenej na MS. Benchmarking týchto multiplexných IP-MS testov ukázal miernu koreláciu ku kvantifikácii s tradičnejšími Western blotting, ELISA a Luminex testami.


Abstraktné

Proteínové karbonyly sú široko analyzované ako miera oxidácie proteínov. Na ich určenie existuje niekoľko rôznych metód. Predchádzajúca štúdia opísala rádové rozdiely, ktoré existovali, keď sa proteínové karbonyly analyzovali v jedinom laboratóriu pomocou ELISA s použitím rôznych komerčných súprav. Ďalej sme skúmali potenciálne príčiny rozptylu v karbonylovej analýze v kruhovej štúdii. Rozpustná proteínová frakcia sa pripravila z potkanej pečene a vystavila sa 0, 5 a 15 minútovému UV žiareniu. Lyofilizované prípravky boli distribuované do šiestich rôznych laboratórií, ktoré bežne vykonávali analýzu karbonylu proteínov v celej Európe. Techniky ELISA a Western blotting detegovali zvýšenie tvorby proteínového karbonylu medzi 0 a 5 minútou UV žiarenia bez ohľadu na použitú metódu. Po 15 minútach ožarovania polovica laboratórií zistila menej oxidácie ako po 5 minútach ožarovania. Tri zo štyroch karbonylových výsledkov ELISA spadali do 95 % intervalov spoľahlivosti. Pravdepodobné chyby vo výpočte absolútnych hodnôt karbonylu možno pripísať rozdielom v štandardizácii. Z až 88 proteínov identifikovaných ako obsahujúce karbonylové skupiny po tryptickom štiepení ožiarených a kontrolných pečeňových proteínov bolo iba sedem bežných vo všetkých troch pečeňových prípravkoch. Lyzínové a arginínové zvyšky modifikované karbonylmi sú pravdepodobne odolné voči tryptickej proteolýze. Použitie kokteilu proteáz môže zvýšiť regeneráciu oxidovaných peptidov. Záverom je, že štandardizácia je kritická pre karbonylovú analýzu a silne oxidované proteíny nemusia byť účinne analyzované žiadnou existujúcou technikou.


Úvod

Väčšina biologických procesov zahŕňa pôsobenie a reguláciu multiproteínových komplexov. V mnohých prípadoch sú oddelené vlastnosti, ako je subcelulárna lokalizácia, katalytická aktivita a substrátová špecifickosť, určené rôznymi polypeptidmi v holoenzýmovom komplexe a špecifickí proteínoví interakční partneri môžu byť prítomní v nestechiometrických množstvách. Napríklad katalytické podjednotky, ako je proteínová fosfatáza 1 (PP1), môžu interagovať so spektrom alternatívnych proteínových partnerov, ktorí sa tak nestechiometricky viažu a vytvárajú rad holoenzýmov s rôznymi špecifickosťami (prehľad pozri Moorhead et al., 2007). To môže sťažiť odlíšenie špecifických interagujúcich proteínov s nízkou abundanciou od väčšieho počtu kontaminujúcich proteínov s nízkou afinitou, ale s hojným výskytom, ktoré sa nevyhnutne získavajú pomocou bežne používaných metód, ako sú stratégie sťahovania alebo imunoprecipitácie. Kľúčovým cieľom vo väčšine oblastí bunkovej biológie je preto charakterizácia proteínových zložiek multiproteínových komplexov prostredníctvom spoľahlivej identifikácie špecifických proteínových interakčných partnerov.

Akýkoľvek predpokladaný interakčný partner identifikovaný afinitnou purifikáciou alebo biochemickou frakcionáciou musí byť validovaný, aby sa potvrdila jeho fyziologická relevantnosť. Tieto následné validačné experimenty zahŕňajúce podrobnú molekulárnu charakterizáciu sú nákladné a časovo náročné, a preto je nevyhnutné zamerať zdroje na tie podskupiny potenciálnych interakcií s vysokou pravdepodobnosťou biologického významu. Pokračujúce zlepšovanie citlivosti a rozlíšenia technológie hmotnostnej spektrometrie na identifikáciu proteínov napríklad umožňuje identifikáciu stále väčšieho počtu proteínov v imunoafinitných a pull-down experimentoch. Okrem bona fide interakčných partnerov však tieto rozširujúce sa zoznamy zahŕňajú zvýšený počet kontaminujúcich proteínov, vrátane tých, ktoré sa nešpecificky viažu na afinitnú matricu. Problém nešpecifickej väzby nemožno uspokojivo prekonať použitím vysoko prísnych purifikačných metód, hoci to môže znížiť úroveň nešpecifickej väzby, nevyhnutne to tiež odstráni špecifické partnerské proteíny s nízkou abundanciou a nízkou afinitou. Najefektívnejšia stratégia preto musí zachovať všetky špecifické interakčné udalosti, čo nevyhnutne vedie k veľkému počtu nešpecifických proteínov, ktoré sa tiež spolučistia, ktoré musia byť identifikované a zlikvidované.

Na vyriešenie tohto problému sme my a iní preukázali, že prístup založený na kvantitatívnej hmotnostnej spektrometrii v kombinácii s izotopovým značením môže pomôcť rozlíšiť, ktoré z mnohých proteínov identifikovaných v experimente s roztiahnutím alebo imunoprecipitáciou predstavujú špecifickú väzbu. To sa dosiahne zahrnutím negatívnej kontroly, ktorá poskytuje pozadie kontaminujúcich proteínov, ktoré sa nešpecificky viažu na afinitnú matricu a/alebo fúzny tag, oproti ktorým jasne vyčnievajú proteíny, ktoré sa viažu špecificky na požadovaný proteín (prehľad pozri Vermeulen a kol., 2008). Napríklad pomocou kombinácie stabilného izotopového značenia s aminokyselinami v kvantitatívnej proteomike založenej na bunkovej kultúre (SILAC) (Ong a kol., 2002) s imunoprecipitáciou fúznych proteínov označených GFP sme odhalili rozdiely vo väzbových partneroch pre dve rôzne izoformy. jadrovej proteínovej fosfatázy, PP1 (Trinkle-Mulcahy et al., 2006). Iné skupiny použili podobný prístup založený na označených návnadových proteínoch na mapovanie spektra proteínov interagujúcich s ľudským 26S proteazómom (Wang a Huang, 2008) a na detekciu dynamických členov komplexov transkripčných faktorov (Mousson et al., 2008). Kvantitatívne prístupy založené na izotopoch sa tiež použili na definovanie značených proteínových komplexov v kvasinkách (Ranish et al., 2003 Tackett et al., 2005) a značených aj endogénnych proteínových komplexov v cicavčích bunkách (Blagoev et al., 2003 Cristea et al. ., 2005 Selbach a Mann, 2006).

Hoci stratégia izotopového značenia používaná v prístupe afinitnej purifikácie SILAC poskytuje veľkú pomoc pri oddeľovaní špecifických od nešpecifických interaktorov, skúsenosti ukazujú, že nie všetky špecifické interakcie možno jednoznačne určiť, najmä blízko prahovej úrovne, kde sú pomery signálu k šumu blízke pozadiu. . Tu popisujeme novú stratégiu hmotnostnej spektrometrie založenú na SILAC, ktorá špecificky rieši tento problém, pričom zahŕňa metódy na zvýšenie signálu, tj množstvo purifikovaných proteínových komplexov, pri znížení alebo odfiltrovaní šumu, tj proteínov, ktoré sa viažu nešpecificky na afinitu matricu, značku a/alebo protilátku.

Účinnosť detekcie interakčných partnerov závisí od efektívneho vyčerpania cieľového komplexu. Tu ukazujeme, že proteíny označené GFP môžu byť takmer kvantitatívne vyčerpané pomocou nedávno vyvinutého spojiva GFP (Rothbauer et al., 2008). GFP spojivo je an Escherichia coli– exprimovaný 16-kD proteín odvodený z protilátky ťažkého reťazca lamy, ktorá sa viaže s vysokou afinitou a špecifickosťou na GFP. To podčiarkuje užitočnosť použitia GFP ako duálnej značky na afinitnú purifikáciu aj in vivo fluorescenčnú mikroskopiu. Okrem toho, charakterizácia proteínov, ktoré sa nešpecificky viažu na tri z najbežnejšie používaných afinitných matríc, buď v celých bunkových, jadrových alebo cytoplazmatických extraktoch cicavčích buniek, poskytuje filter „perličkový proteóm“. To uľahčuje rozlíšenie špecifických väzbových proteínov od nešpecifických, a tým umožňuje objektívne stanovenie priorít vhodných cieľov na podrobnú molekulárnu charakterizáciu.

V súhrne tu uvádzame výkonný a spoľahlivý pracovný postup, ktorý možno použiť na analýzu afinitne purifikovaných proteínových komplexov izolovaných buď pomocou označených fúznych proteínov, alebo prostredníctvom imunoprecipitácie endogénnych proteínov.


Materiály a metódy

Biologické materiály

V tejto štúdii boli cDNA knižnice, expresné vektory pET-30a (Novagen) a pET30a-GST, verzia pET30a obsahujúca glutatión S-transferázu (GST), vytvorené v našom laboratóriu ( Cao a kol., 2010) a použili sa bakteriálne kmene (DH5a, BL21 a ER2566). Reštrikčné enzýmy BamAHOJ, Xhoja, EcoRI, HindIII, T4 DNA ligáza a Ex Taq DNA polymeráza boli zakúpené od TAKARA.

Vzorky ryže

V tejto štúdii sa odobrali štyri druhy vzoriek ryže, ktoré sa použili na analýzu westernovým prenosom: (i) 10 vzoriek zo semenáčika (výhonky a koreň), odnože (list a stonka), vykorčovania (vlajkový list a mladá metlina), kvitnutia (vlajka list a metlina) a fázy plnenia (vlajkový list a semená) odrody ryže 93-11 (Oryza sativa L.) (ii) sedem vzoriek listov odobratých v 4-hodinových intervaloch počínajúc o 12:00 v priebehu jedného dňa (iii) osem vzoriek z listov homozygotnej transgénnej ryže línie 4021-3 s génom rezistencie voči bakteriálnej plesni Xa21 (Xiang a kol., 2006), očkované nezlučiteľnou filipínskou rasou 6 of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) po 0, 1, 2, 4 a 8 hodinách a 1, 3 a 5 dňoch a (iv) štyri vzorky z pšenice, kukurice, bavlny a A. thaliana listy počas vegetačného obdobia. Všetky materiály boli zmrazené pomocou tekutého dusíka a skladované pri -70 °C až do použitia.

Predikcia antigénneho peptidu a návrh primérov

Softvér BEPITOPE (Odorico a Pellequer, 2003) sa použil na predpovedanie antigénnych fragmentov, z ktorých sa tie, ktoré boli jedinečné v genóme ryže, po overení BLASTP, vybrali ako antigén na vytvorenie špecifických protilátok proti cieľovým proteínom. Softvér PrimerCE (Cao a kol., 2010) sa použil na navrhnutie primérov na základe kódujúcej sekvencie (CDS) stiahnutej z databázy TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/), ako je uvedené nižšie. Podčiarknuté písmená sú miesta rozpoznávania reštrikčných enzýmov. Podrobné pozície v cDNA plnej dĺžky a peptidové sekvencie sú uvedené v tabuľke 1. Os09g30418.1F, 5'-CG GGATCC TTCGCCTTCCAGGCCGAGAT-3' Os09g30418.1R, 5'-CCG CTCGAG′CCAG0418.1F Os050415G05050505G0TT -G GAATTC CTTGGCGCTCGTCTTACGGAGG-3 'Os05g04510.1R, 5'-CCC AAGCTT GCCACTAGCAACAATGCTCTTGG-3' Os06g46770.2F, 5'-G GAATTC ATGCAGATCTTTGTGAAGACCC-3 'Os06g46770.2R, 5'-CCC AAGCTT CCTGAGCCTGAGCACAAGGTG-3' Os03g08020.1F, 5'-G GAATTC AAGAACGTTGCGGTGAAGG-3 'Os03g08020.1R, 5'-CCC AAGCTT TCATTTCTTCTTGGCGGCAG-3' Os03g50890.1F, 5'-G GAATTC ACCATTGGTGCTGAGCGTTTC-3 'Os03g50890.1R, 5'-CCC AAGCTT TTAGAAGCATTTCCTGTGCACAAT-3'.

Kandidáti na referenčný ryžový proteín

Názov génu Číslo miesta Anotácia Mol. wt (kDa) Antigén Dĺžka (poloha) fragmentu/peptidová sekvencia
HSP Os09g30418.1 Proteín tepelného šoku 94 Exprimovaný proteín 182 aminokyselín (8–189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubikvitín obsahujúci 7 monomérov ubikvitínu 60 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (1-150)
VAŇA Os01g59150.1 Tubulín beta-4 reťazec 50 Syntetizovaný peptid QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1a Os03g08020.1 Faktor predĺženia 1-α 49 Exprimovaný proteín 148AA(301–448)
eIF-4a Os02g05330.1 Eukaryotický iniciačný faktor 4-α 47 Syntetizovaný peptid DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S- adenozylmetionín syntetáza 1 43 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (151 – 300)
ACT Os03g50890.1 Aktín-1 42 Exprimovaný proteín 128 aminokyselín (251 – 378)
GAPDH Os04g40950.1 Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, cytosol 37 Syntetizovaný peptid DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Enzým E2 konjugujúci ubikvitín 18 Syntetizovaný peptid PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY
Názov génu Číslo miesta Anotácia Mol. wt (kDa) Antigén Dĺžka (poloha) fragmentu/peptidová sekvencia
HSP Os09g30418.1 Proteín tepelného šoku 94 Exprimovaný proteín 182 aminokyselín (8–189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubikvitín obsahujúci 7 monomérov ubikvitínu 60 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (1-150)
VAŇA Os01g59150.1 Tubulín beta-4 reťazec 50 Syntetizovaný peptid QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1a Os03g08020.1 Faktor predĺženia 1-α 49 Exprimovaný proteín 148AA(301–448)
eIF-4a Os02g05330.1 Eukaryotický iniciačný faktor 4-α 47 Syntetizovaný peptid DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S- adenozylmetionín syntetáza 1 43 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (151 – 300)
ACT Os03g50890.1 Aktín-1 42 Exprimovaný proteín 128 aminokyselín (251 – 378)
GAPDH Os04g40950.1 Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, cytosol 37 Syntetizovaný peptid DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Ubikvitín-konjugujúci enzým E2 18 Syntetizovaný peptid PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY

Kandidáti na referenčný ryžový proteín

Názov génu Číslo miesta Anotácia Mol. wt (kDa) Antigén Dĺžka (poloha) fragmentu/peptidová sekvencia
HSP Os09g30418.1 Proteín tepelného šoku 94 Exprimovaný proteín 182 aminokyselín (8–189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubikvitín obsahujúci 7 monomérov ubikvitínu 60 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (1-150)
VAŇA Os01g59150.1 Tubulín beta-4 reťazec 50 Syntetizovaný peptid QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1a Os03g08020.1 Faktor predĺženia 1-α 49 Exprimovaný proteín 148AA(301–448)
eIF-4a Os02g05330.1 Eukaryotický iniciačný faktor 4-α 47 Syntetizovaný peptid DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S- adenozylmetionín syntetáza 1 43 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (151 – 300)
ACT Os03g50890.1 Aktín-1 42 Exprimovaný proteín 128 aminokyselín (251 – 378)
GAPDH Os04g40950.1 Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, cytosol 37 Syntetizovaný peptid DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Ubikvitín-konjugujúci enzým E2 18 Syntetizovaný peptid PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY
Názov génu Číslo miesta Anotácia Mol. wt (kDa) Antigén Dĺžka (poloha) fragmentu/peptidová sekvencia
HSP Os09g30418.1 Proteín tepelného šoku 94 Exprimovaný proteín 182 aminokyselín (8–189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubikvitín obsahujúci 7 monomérov ubikvitínu 60 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (1-150)
VAŇA Os01g59150.1 Tubulín beta-4 reťazec 50 Syntetizovaný peptid QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1a Os03g08020.1 Faktor predĺženia 1-α 49 Exprimovaný proteín 148AA(301–448)
eIF-4a Os02g05330.1 Eukaryotický iniciačný faktor 4-α 47 Syntetizovaný peptid DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S- adenozylmetionín syntetáza 1 43 Exprimovaný proteín 150 aminokyselín (151 – 300)
ACT Os03g50890.1 Aktín-1 42 Exprimovaný proteín 128 aminokyselín (251 – 378)
GAPDH Os04g40950.1 Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, cytosol 37 Syntetizovaný peptid DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Enzým E2 konjugujúci ubikvitín 18 Syntetizovaný peptid PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY

Klonovanie génov, expresia proteínov a čistenie proteínov

PCR sa uskutočnila s použitím plazmidov z ryžových cDNA knižníc ako templátov. Uvedené reštrikčné enzýmy sa použili na štiepenie amplikónov a vektorov, ktoré sa potom purifikovali na géli. Ďalej boli ligované produkty transformované do E. coli DH5a a rekombinanty boli overené pomocou sekvenčnej analýzy (Beijing Genomics Institute, Peking, Čína). Rekombinanty boli transformované do E. coli expresného kmeňa ER2566 alebo BL21 a kultivovali sa cez noc v LB médiu doplnenom kanamycínom (50 ug ml -1) pri 37 °C. Kultúry boli zriedené v pomere 1:100 čerstvým médiom Luria-Bertani (LB médium) doplneným kanamycínom (50 μg ml -1) a 1% glukózou a kultivované pri 37 ° C až OD600 0,6–0,8. Ďalej sa na 3 hodiny pridal izopropyl-p-d-tiogalaktopyranozid (IPTG 0, 4 uM), aby sa vyvolala expresia fúznych proteínov. Bakteriálne bunky boli zozbierané, rozbité pomocou sonikácie a purifikované niklovou stĺpcovou chromatografiou. Cieľové proteíny sa potom oddelili pomocou SDS-PAGE a zafarbili sa Coomassie modrou.

Generovanie protilátok

Polyklonálne protilátky boli vytvorené imunizáciou zdravých králikov s použitím purifikovaných fúznych proteínov alebo syntetizovaných peptidov ako antigénov. Proteínové konjugácie, imunizácie a purifikácie antiséra boli uskutočnené spoločnosťou BPI (Beijing Protein Innovation Co., Ltd, Peking, Čína).

Extrakcia ryžových bielkovín a stanovenie ich koncentrácie

Ryžové tkanivo sa rozdrvilo na jemný prášok v tekutom dusíku. 800 μl alikvot extrakčného pufra [62,5 mM TRIS-HCl (pH 7,4), 10 % glycerol, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 5 % (v/v) β-merkaptoetanol] pridaný ku každej 300 mg práškovej vzorke. Zmes sa vortexovala a potom sa chladila na ľade počas 10 minút. Vzorky sa centrifugovali pri 12 000 ot./min. počas 10 minút pri 4 °C a supernatant sa odobral a skladoval pri –70 °C. Koncentrácie proteínov vo vzorkách ryže boli stanovené pomocou Bradfordovej metódy (Bradford, 1976). Rovnaké množstvo ryžového proteínu bolo nanesené a oddelené pomocou SDS-PAGE a potom zafarbené Coomassie modrou.

Western blotting a analýza kvantifikácie signálu

Rovnaké množstvá ryžového proteínu z rôznych tkanív/orgánov boli oddelené pomocou SDS-PAGE a elektrotransferované na membránu PVDF (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) pri 100 V počas 60 minút. Membrána sa ponorila do 5 % odtučneného mlieka v roztoku TTBS [0,2 M TRIS-HCl (pH 7,6), 1,37 M NaCl, 0,1 % Tween-20] na 1 hodinu pri teplote miestnosti. Proteíny sa inkubovali s polyklonálnymi protilátkami v 5 % odtučnenom mlieku v roztoku TTBS počas 3 hodín pri teplote miestnosti a podrobili sa trom 5 minútovým preplachom v roztoku TTBS. Membrána sa potom inkubovala s kozou anti-králičou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co., Ltd, Peking, Čína) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a podrobila sa trom 5 minútovým preplachom v roztoku TTBS. Blot sa vyvinul pomocou súpravy SuperECL Plus (Applygen, Peking, Čína) a signál sa exponoval röntgenovým filmom.

Obrázky boli naskenované a intenzita každého pásu bola zachytená pomocou ImageMaster 2D Platinum verzie 5.0 (GE Healthcare Amersham Bioscience). Intenzita každého pásu bola štandardizovaná ako percento z celkovej intenzity a výsledky boli označované ako relatívny objem, ktorý predstavuje relatívnu abundanciu expresie génu v testovaných vzorkách. Relatívna abundancia expresie sa použila na vyhodnotenie stability expresie proteínu. Western blotovanie a kvantifikačná analýza sa uskutočnili v najmenej troch biologických replikáciách.

Analýza stability expresie proteínu

Stabilita proteínovej expresie bola hodnotená pomocou geNorm v.3.5 (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) (Vandesompele a kol., 2002) a softvér Microcal Origin 6.0 (Microcal Software, Northampton, MA, USA). Hodnoty relatívnej expresie proteínu boli importované do geNorm, ktorý vypočítava stabilitu génovej expresie [M hodnota alebo priemer štandardnej variácie daného kandidátskeho génu vzhľadom na všetky ostatné gény v danej sade vzoriek (Murthi a kol., 2008 Silveira a kol., 2009)] na klasifikáciu proteínov v rôznych vzorkách tkanív. Čím nižšia je hodnota M, tým stabilnejšia je expresia proteínu. Okrem toho boli relatívne hodnoty expresie proteínu importované do Microcal Origin 6.0, ktorý generuje krabicový graf na odhadnutie stability expresie potenciálnych referenčných proteínov.

Generovanie štandardných kriviek Western blotting a stanovenie koncentrácie referenčných proteínov v ryži

Koncentrácia rekombinantných proteínov bola vynesená do grafu proti signálu Western blotting generovanému zodpovedajúcimi protilátkami, aby sa odhadol lineárny rozsah detekcie a dolné hranice detekcie rekombinantných proteínov. Potom sa séria zriedených rekombinantných proteínov a celkových ryžových proteínov testovala na rovnakej membráne Western blotting, aby sa vytvorila štandardná krivka. Štandardná krivka sa použila na výpočet koncentrácie proteínu a percenta referenčných proteínov v ryži. Séria riedení celkových ryžových proteínov sa tiež analyzovala pomocou Western blottingu, aby sa určili spodné limity detekcie pre referenčné ryžové proteíny.

Transkripčná analýza referenčných génov ryže

Transkripčné údaje o ryžových listoch, koreni, stonke, metline a semene boli stiahnuté z MPSS (http://mpss.udel.edu/rice/) (Nakano a kol., 2006) a databázy EST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbEST/) (Boguski a kol., 1993). Úroveň transkripcie bola rozdelená do štyroch stupňov na základe intenzity expresného signálu, aby sa porovnala s výsledkami Western blotting.


Základ Western Blot

V molekulárnej biológii existuje veľa techník „Blot“, ako je Southern blot, Northern blot, eastern blot a western blot. Princíp a proces týchto blotovacích techník sú podobné. Southern a Northern blot sú techniky blotovania nukleových kyselín, z ktorých Southern blot je na detekciu špecifickej sekvencie DNA vo vzorkách DNA a Northern blot je na štúdium génovej expresie detekciou RNA (alebo izolovanej mRNA) vo vzorke. Eastern blot sa používa na analýzu proteínových posttranslačných modifikácií (PTM), ako sú lipidy, fosfoskupiny a glykokonjugáty.

Na rozdiel od vyššie opísaných techník blot, Western blot, tiež nazývaný proteínový imunoblot, je analytická technika používaná na detekciu špecifických proteínov v danej vzorke, ako sú bunkové lyzáty, tkanivový homogenát alebo extrakt. Je široko používaný v molekulárnej biológii. Základom identifikácie Western blot sú dve rozlišujúce vlastnosti: molekulová hmotnosť a väzbová špecificita protilátky. Používa gélovú elektroforézu (zvyčajne SDS-PAGE) na oddelenie natívnych proteínov podľa 3-D štruktúry alebo denaturovaných proteínov podľa dĺžky polypeptidu. Potom sa vzorka proteínu prenesie na membránu (zvyčajne nitrocelulóza alebo PVDF), kde sa sonduje so značenými protilátkami a zafarbí sa farbivami na vizualizáciu a priamo identifikuje N-koncovým sekvenovaním, hmotnostnou spektrometriou alebo imunodetekciou. Imunodetekcia zahŕňa identifikáciu proteínu prostredníctvom jeho reakcie so špecifickou protilátkou. Prostredníctvom priestorového rozlíšenia táto metóda poskytuje informácie o molekulovej hmotnosti jednotlivých proteínov a rozlišuje izoformy, alternatívne produkty spracovania a iné posttranslačne modifikované formy.

2. Základný princíp Western blotu

Základným princípom western blotu sú proteínová elektroforéza a ELISA. Elektroforéza je bežne používaná metóda na separáciu proteínov na základe veľkosti, tvaru alebo náboja. Proteins are large molecules with charge, they can migrate in the polyacrylamide gels under electric field. The migrating speed depends on the molecular weight of proteins: heavy proteins move slower than light proteins. This is just like the runners running through a jungle, the polyacrylamide molecule in the gel is like the branches along the sideline, which could slow the runner down. The bulky runner would be affected more by the “branches” than the small runner so that they runs slower. That’s why we could separate those runner proteins. If we load the mixed protein samples on one side of the gel, add a constant electric field on the gel, and let the protein migrating on the gel for a period of time, the mixed protein sample could be separated into different bands on gel (Figure 1). If we put several proteins with known molecular weight under the same electrophoresis condition along with the tested samples as control, we may further measure the molecular weight of proteins within the tested samples by compare the location of sample proteins with control proteins. These control proteins are commonly known as molecular weight marker or protein ladders.

Figure 1. Protein electrophoresis: proteins separated under electric fields based on different molecular weight.

When the proteins were successfully separated, we still use an electric field to transfer the protein bands onto another polyvinylidene fluoride (PVDF) or nitrocellulose (NC) membrane for the following detection. After the proteins band transferred onto PVDF/NC membrane, we use anti specific protein primary antibodies to probe the sample protein, and then use a labeled secondary antibody for further visualization (Figure 2). This procedure is basically an indirect ELISA process (know more about indirect ELISA at ELISA Guide).

Creative Diagnostics provides a variety of high quality primary antibodies and secondary antibodies for western blot use.

Figure 2. Indirect ELISA procedure. To probe and visualize the separated protein bands.

3. The experimental equipment of western blot

As western blot is a very mature technology in molecular biology, there are a full set of commercialized reagent and equipment that support the experiment of WB (Figure 3). Here we list several frequently used tools and materials for western blot:

  1. Gel: usually made of polyacrylamide, need precast before western blot.
  2. Gel comb: used for toothing one side of the gel as sample loading area.
  3. Gel cassette: used for gel formation.
  4. Gel knife: help to move the gel from cassette.
  5. Electrode chamber: used for holding the gel cassette and cathode buffer.
  6. Electrophoresis tank: used for holding the electrode chamber and anode buffer
  7. Power source: provide a constant electric field
  8. Cassette: clamp the multilayer films when doing protein transfer
  9. Sponges: protect the gel and membrane, keep a wet and conductive condition.
  10. Filter paper: protect the gel and membrane, keep a wet and conductive condition.
  11. PVDF/NC membrane: receive the proteins.
  12. Rolling brush: exclude bubbles within the multilayer membrane.
  13. Washing dish: hold the membrane for washing.

Other general equipment such as shaker/incubator for antibody incubation and imager for display the gel result are not listed here but also important for western blot experiment.

Figure 3. Western blot equipments.

Western blot is often used in research to separate and identify proteins. In this technique a mixture of proteins is separated based on molecular weight through gel electrophoresis. These results are then transferred to a membrane producing a band for each protein. The membrane is then incubated with labeled antibodies specific to the protein of interest. The unbound antibody is washed off leaving only the bound antibody to the protein of interest. The bound antibodies are then detected by developing the film. As the antibodies only bind to the protein of interest, only one band should be visible. The thickness of the band corresponds to the amount of protein present thus doing a standard can indicate the amount of protein present. The general process of western blot includes at least 9 steps as following:

Detailed information of each steps are discussed in Western blot protocols.

Although western blot is relatively an old, mature technology, there are still researchers working on it to upgrade this technique. Hughes et al. from University of California (UC) Berkeley, successfully couple western blotting with single-cell analysis, which enables the simultaneous analysis of

2,000 individual cells. Single-cell protein analysis techniques lack resolution, sensitivity or specificity, or require protein tagging. Western blotting avoids these pitfalls but is not amenable to single-cell analysis. This progress enable us use western blot to investigate single cell proteins.

Their array-based technique uses a slide coated with polyacrylamide gel and patterned with thousands of micro wells, into which a cell suspension is seeded by gravity-driven cell settling, resulting in single-cell occupancy in 40–50% of the wells. Intracellular proteins are then solubilized in the wells, subjected to thin-gel electrophoresis and immobilized. Subsequently, the serial stripping and re-probing of antibodies enables multiplexed analyses of proteins.


Antibody Validation

Antibodies are one of the important reagents in life sciences and clinical medicine. Although antibodies have been widely used, there is a lack of established criteria to guide how they should be validated before use. As a result, many commercial antibodies have not been fully validated prior to use and/or lack of further confirmation resulting in failed or unreplicable results, even projects being abandoned, resulting in significant time, money and sample loss. Therefore, the establishment of antibody verification standards has become an urgent need.

What Is Antibody Validation?

Antibody validation consists primarily of the following components: demonstrating specificity (the ability of antibodies to distinguish between different antigens), proving affinity (intensity of antibody binding epitopes), and finally demonstrating reproducibility. However, although this definition of antibody validation is reasonable, there are still some problems with the widespread application or implementation of validation standards.

The task of verifying the antibody should have been done by the antibody supplier. However, although the seller is responsible for the quality of the reagents sold, antibody performance may be affected by a number of other factors. For example, antibodies may change during transport due to improper storage at low temperatures, or although they can be successfully validated in a general biologically relevant system, end users need to use it in their own experimental systems. Therefore, the end user also needs to perform secondary verification of the antibody.

By taking a few small steps, the researcher can effectively reduce the risk of the experiment in subsequent experiments. First, the researcher should be aware of the usage information provided in the product specification, including the application that has been validated for it, the appropriate protocol and the recommended dilution.

How Can Antibodies Be Validated?

There are also different methods for antibody validation for specific applications, including Western blot (WB), immunohistochemistry (IHC), immunocytochemistry (ICC), immunofluorescence (IF), ELISA, immunoprecipitation (IP), chromatin immunoprecipitation. (ChIP) and peptide arrays, etc. In terms of verification, each assay has its advantages and disadvantages (Table 1).

Table 1. Advantages and disadvantages of several antibody validation methods.

Assay Výhoda Nevýhoda
Western Blot Easy and simple assay
Ideal for denatured proteins
Difficult to optimize
Time-consuming
A small number of antibodies can be tested per run
ELISA Quantitative assay
High throughput
Does not determine if the antibody is specific or cross-react
IHC/ICC Routinely available and relatively inexpensive Difficult standardization
Epitope accessibility can vary in fixed tissues
Difficult to quantitate
IF High throughput
Easy to optimize
Does not determine if the antibody is specific or cross-reacts
siRNA knockdown KD cell lines can be used in all assays (WB, ICC/IHC, Flow cytometry) KD is transient
Difficult to optimize-requires several siRNA sequences
Knockout cell lines and mouse models Best negative controls, since they guarantee no expression of the target gene
May be used in all assays (WB, ICC/IHC, Flow cytometry)
Cell lines for specific genes are not always available or lethal
KO mouse models take over a year to develop and are often non-viable
PANI Confirms specificity
High throughput
Requires use of mass spectrometer and trained personnel
SPR Real-time analysis
Label-free
Highly sensitive
Requires immobilization
Requires meticulous experimental design
High sample consumption
MST Rapid assay (KD in 10 min)
Low sample consumption (pM/nM) and small volume (<4 ul)
Immobilization free-in solution measurements
Label-free (optional)
Requires specialized equipment

Which method should be used and how several methods are used to validate antibodies depends not only on sensitivity, specificity and reproducibility, but also on the environment in which the particular antibody is to be used. This means that if a given antibody is only intended for WB, they only need to be tested in this case. However, if you need to use it in other assays, you should also test it again in the application environment. This helps save time and cost associated with the antibody validation process.

Screening for Antibody Specificity

Specificity is a measure of the ability of an antibody to distinguish between different antigens. Even if the antibody may be sensitive to the target protein, it will show a lack of specificity due to cross-reactivity with other proteins. In this sense, it is a basic requirement for a good antibody to confirm that the antibody specifically binds to the target protein.

Several questions need to be identified before analyzing the specificity of a given antibody. The first is what are the types of immunogens that are used to produce this antibody? How is the target protein in the sample to be analyzed constructed? The first question is not easy to answer, especially if the antibody manufacturer does not disclose the type of immunogen. The reason for understanding this information is that the specificity of an antibody depends in part on whether the type of immunogen is a synthetic peptide or a purified protein. Since synthetic peptides do not necessarily summarize the 3-D structure or post-translational modification of native proteins, antibodies produced using synthetic peptides may not recognize native proteins. If the immunogen is a purified protein, the denatured protein is difficult to bind to the antibody. Thus, when the immunogen is a synthetic peptide, the antibody can be applied to WB but not to IP or IHC.

The Preferred Method for Antibody Specific Validation - WB

WB is considered to be the first step in the evaluation of new antibodies because it is the ideal assay for specific validation of denatured protein antibodies. However, in experimental assays where the antigen is in its natural conformation (eg, IHC), it is not the ideal standard method for antibody binding. Because antibodies may recognize a particular epitope in fresh tissue, but different epitopes are recognized in the fixed tissue, the method used to fixed tissue complicates the problem. This happens because unexposed epitopes in natural proteins become accessible after fixed processing and vice versa. If you only need to verify the recognition of the denatured antigen by the antibody or whether it is suitable for WB, then the assay can be used as a first step of verification. The result when the antibody is specific for the selected target is the observation of a band on a target of known molecular weight. If multiple bands are present, they may represent different post-translational modification states, decomposition products or splice variants, or may also be non-specific binding. Therefore, the results of these experiments may appear to be incapable of determining antibody specificity.

Another disadvantage of WB is its low detection throughput because it usually only tests one antibody at a time. However, recently, by converting WB to a capture format, a high-throughput detection method called PAGE-MAP was developed for antibody verification. In this method, a biotinylated protein sample is subjected to PAGE, and then the size-separated protein is incubated with a microsphere-based barcode antibody array for multiplex IP, and the captured protein is labeled with streptavidin for flow through Magnetic cytometry (ie, microsphere affinity) was performed for magnetic bead detection. In addition, size-separated proteins can also be used for parallel readout shotgun mass spectrometry (MS), which can be used to roughly estimate specificity and for selection of antibody target levels sufficient for immunoprecipitation. This new method is powerful, screens thousands of antibodies, recognizes antibodies that bind to the same protein, and provides a means for large-scale antibody validation.

Figure 1. Overview of the western blotting procedure.

In addition to the WB method, the use of blocking peptides to assess antibody specificity is also a common approach, particularly for IHC. These peptides are identical to the peptides used to produce antibodies, and when over-incubated with them, they can be used as immunoneutralizing antibodies. In the validation experiment, the unneutralized antibody was used as a control to stain the sample tissue. If the antibody is specific, incubation with a blocking peptide will result in the disappearance of staining on the tissue. However, this assay has the disadvantage that it does not verify the selectivity of the antibody for the antigen, since the non-specific binding activity of the antibody will also be inhibited by the blocking peptide. Thus, blocking peptides can prove that antibodies are bad, but they do not prove that antibodies must be good.

In the process of antibody validation, the key to demonstrating antibody specificity is the correct use of controls. As in the antibody verification experiments on the cannabinoid CB2 receptor, it has been found that the conventional practice of using only a positive control to verify an antibody is insufficient to ensure the reliability of the antibody. In this validation study, although many techniques (eg, WB, mass spectrometry and blocking peptides) and excellent positive controls were used to obtain a number of positive results indicating the effectiveness of anti-CB2 antibodies. However, when knocking out a negative control to test antibodies, this antibody was found to be non-specific for the CB2 receptor protein. A similar situation may occur due to the similarity of relative epitope regions between proteins, or because antibodies have multiple epitopes. The best negative control is knockout cells/animals that do not express the protein of interest, and closely related proteins can also serve as good negative controls. The best positive control is a cell which non-expression the target protein and transfected with the protein of interest. If knocking out the cells is too difficult to obtain, then siRNA or shRNA knockout cells can be selected as controls. Although negative control is necessary, there is also a need for positive control.

Determination of Antibody Affinity

Antibody binding affinity is another parameter that can be used for antibody validation. It refers to the strength of the binding of an antibody molecule to an epitope. It is usually reported as the equilibrium dissociation constant (KD), which is the ratio of the antibody dissociation rate or kvypnuté (the rate of dissociation from the antigen) to the antibody association rate or antibody binding rate Kna(the rate of binding to the antibody).

Affinity determination of monoclonal antibodies can be performed with high precision because they are selective only for the same epitope, but in the case of polyclonal antibodies, since the epitopes they detect are heterogeneous and are various A mixture of antibodies with different affinities. Therefore, only the average affinity can be obtained. In order to determine antibody affinity, the following methods have existed. These include ELISA-based methods, as well as other biophysical methods such as microscale thermophoresis (MST) and surface plasmon resonance (SPR).

ELISA is the most popular method for studying antibody affinity. They do not require the use of large amounts of antibodies and antigens, nor do they require purification of the protein. In this method, a fixed concentration of antibody is incubated with the antigen in solution until a steady state is reached. Then, the concentration of the unbound antibody was measured by an indirect ELISA. This method requires prior preliminary experiments to determine the concentration of antibody used within the linear range of the ELISA reaction, and only a small fraction of the total free antibody in the solution remains on the plate (so that the measurement does not significantly affect the equilibrium in the solution).

MST is a biophysical method that detects the affinity of antibody molecules over a wide range of concentrations. It judges the affinity between molecules by measuring the movement of molecules along the infrared laser-induced microscopic temperature gradient. This movement depends on many factors, including the hydrated shell, charge and molecular size. These molecules are initially uniformly distributed in solution and free to diffuse. When the infrared laser is turned on, the unbound molecules usually move out of the heating point. The binding of one molecule to another (such as antibodies and antigens) causes the movement of the entire temperature gradient to change. The movement of the molecule can then be followed by fluorescent labeling to derive affinity parameters for the antibody molecule.

Figure 2. Determination of antibody affinity by Microscale Thermophoresis (MST).

SPR is an optical technique for detecting molecular interactions in which one molecule is immobilized in a metal film and the other molecule is mobile. The combination of these molecules changes the refractive index of the film. Therefore, when polarized light strikes the film, the extinction angle of the light changes and can be monitored by an optical detector (Figure 3).

Figure 3. Determination of antibody affinity by Surface Plasmon Resonance (SPR).

Antibody Reproducibility

Finally, verify the reproducibility of the antibody, which is an essential part of antibody detection. A common misconception in antibody testing is to assume that antibodies produce similar results, whether from the same or different batches or from different manufacturers. One of the most shocking examples is David Rim of Yale University. He developed an antibody-based assay to guide the effective treatment of melanoma and is ready to apply the assay to the clinic. However, when he ordered a new set of antibodies from the same company, he could not reproduce the original results and had to give up his work. That is to say, using antibodies from the same supplier over time, even if only the batch is different, will produce different results. Therefore, it is critical for researchers to always test for antibody repeatability. This becomes especially important when using polyclonal antibodies, as products from the same item number from the supplier may mean different antibodies.

In summary, in order to ensure that the antibody meets the specificity and affinity and reproducibility required for its use, it is necessary to perform a secondary verification strictly according to the antibody detection standard. Only in this way can the reliability of the experimental data be guaranteed.


Pozri si video: Western Blot Testing Protein Expression Levels. LabXchange. CEYDY LAZO (November 2022).