Informácie

Hydrofóbne proteíny v tele?

Hydrofóbne proteíny v tele?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Viem, že môžeme získať hydrofóbne aminokyseliny, ale sú v tele nejaké bielkoviny, ktorých povrch je hydrofóbny? Ak áno, aká je ich typická funkcia a kde sa zvyčajne nachádzajú a ak nie, prečo nie?


Existujú v tele nejaké bielkoviny, ktorých povrch je hydrofóbny?

Samozrejme. Hoci máte pravdu v tom, že väčšina proteínov má hydrofilný povrch, niektoré sú veľmi hydrofóbne. Môj obľúbený príklad je Elastín, je to hlavná zložka pokožky, ktorá jej dodáva pružnosť. V skutočnosti je hydrofóbna povaha elastínu to, čo mu dáva jeho funkciu. Stručne povedané, myšlienka je taká, že nerozpustná/hydrofóbna štruktúra bude mať tendenciu minimalizovať svoju povrchovú plochu vodou, takže ak takú látku natiahnete (t.j. zväčšíte povrch), stiahne sa späť do stavu minimálnej povrchovej plochy.

Odkaz: Li, Daggett. Molekulárny základ pre rozťažnosť elastínu. Journal of Muscle Research & Cell Motility (2002).


Mastné štítky na odstránenie bielkovín

Väčšina bielkovín v ľudskom tele je ťažkým cieľom pre lieky s malou molekulou. Tento problém mohol byť prekonaný objavom molekúl, ktoré indukujú degradáciu proteínov, čo naznačuje nové, modulárne prístupy k objavovaniu liekov.

Nedávno sa zistilo 1,2, že proteíny kovalentne „označené“ malými, syntetickými, hydrofóbnymi molekulami sú degradované mechanizmom kontroly kvality bunky. Zapisovanie Chémia a biológia, Dlhý a kol. 3 teraz uvádzajú, že nekovalentná väzba takýchto molekúl tiež označuje proteíny na degradáciu. Toto zistenie by mohlo otvoriť širokú škálu proteínov ako cieľov programov na objavovanie liekov.

Nedostatok novo schválených liekov v poslednom desaťročí odráža výzvy, ktorým čelí farmaceutický priemysel. Hoci pokroky v genomike identifikovali veľa proteínov, ktoré sa podieľajú na chorobách, mnohé z týchto proteínov – najmä tie, ktoré nie sú enzýmami – nie sú v súčasnosti životaschopnými cieľmi liekov. V skutočnosti sa odhaduje, že len asi 15 % ľudského proteómu je „liečiteľných“ malými molekulami 4 .

Mnoho atraktívnych drogových cieľov bolo preto nazvaných „nevyliečiteľné“. Napríklad existuje približne 1 400 ľudských transkripčných faktorov – proteínov, ktoré regulujú syntézu messengerovej RNA z DNA, ale ktorým chýba enzymatická aktivita. Tieto proteíny zostávajú do značnej miery neliečiteľné, napriek skutočnosti, že je známe, že aberantná expresia niektorých z nich spôsobuje rakovinu. Jedným z možných riešení tejto výzvy bol vývoj malých interferujúcich RNA (siRNA), ktoré zasahujú do génovej expresie väzbou na mRNA. Avšak dodávanie siRNA do svojich cieľov in vivo bola ťažko prekonateľná prekážka, a preto sú potrebné malé molekuly, ktoré môžu ovplyvniť funkciu neliečiteľných bielkovín.

Ďalším novým prístupom je skôr deštrukcia než inhibícia cieľových proteínov v bunkách. Normálny obrat proteínov v bunkách je sprostredkovaný hlavne systémom ubikvitín-proteazóm (UPS), ktorý označuje nežiaduce alebo nesprávne poskladané proteíny reťazcami ubikvitínového proteínu. Po ubikvitinácii sú označené proteíny rozpoznané proteazómom, veľkým, sudovitým molekulárnym strojom, ktorý štiepi proteíny na malé peptidy. Účinné odstránenie nežiaducich proteínov je kľúčom k prežitiu buniek, čo dokazuje vývoj inhibítorov proteazómu ako účinných protinádorových činidiel 5 .

Bolo hlásených niekoľko stratégií, ktoré kooptujú UPS na cielenú degradáciu proteínov. Jedna z nich využíva „chimérne molekuly zacielené na proteolýzu“ na priblíženie požadovaného proteínu k ubikvitín ligáze (enzýmu, ktorý sprostredkováva ubikvitináciu cieľového proteínu), čím dochádza k ubikvitinácii proteínu a následnej degradácii 6 .

Alternatívnym prístupom je napodobňovanie nesprávne zloženého proteínového stavu pomocou malých molekúl. Normálne sú „mastné“ (hydrofóbne) bočné reťazce polypeptidov pochované vo vnútri globulárneho proteínu, pričom hydrofilné aminokyselinové zvyšky ležia na povrchu. Dokonca aj malé zvýšenie povrchovej hydrofóbnosti môže spôsobiť, že proteín bude nestabilný. Napríklad delécia jednej aminokyseliny z proteínu CFTR je hlavnou príčinou cystickej fibrózy. Delécia vedie k odkrytiu hydrofóbnych náplastí na povrchu CFTR, čo vedie k nesprávnemu poskladaniu a následnej degradácii proteínu (obr. 1).

aBunkové chaperónové proteíny pomáhajú iným proteínom, ktoré sa čiastočne rozvinuli, aby sa znovu poskladali do správnej terciárnej štruktúry. Ak opätovné poskladanie zlyhá, chaperóny spúšťajú degradáciu rozbaleného proteínu proteazómom, čo je veľký proteínový komplex. bSyntetické hydrofóbne skupiny pripojené k povrchu proteínu môžu napodobňovať čiastočne rozvinutý stav. Pretože chaperóny nie sú schopné preskladať tieto proteíny, označené proteíny sú degradované proteazómom. Dlhé a kol. 3 uvádzajú, že hydrofóbne značky nemusia byť na vyvolanie degradácie kovalentne pripojené k proteínu.

Nedávno sme ukázali 1, 2, že kovalentné pripojenie syntetickej hydrofóbnej skupiny (ako je adamantán, objemný uhľovodík) na povrch proteínov priťahuje chaperónové proteíny, ktorých úlohou je pomáhať pri preskladaní chybne poskladaných proteínov, alebo ak ich nemožno znovu poskladať. na ich zacielenie na degradáciu proteazómom. Väčšina liekov sa však viaže na proteíny prostredníctvom nekovalentných interakcií a nebolo jasné, či nekovalentne viazané molekuly môžu tiež spustiť túto sekvenciu udalostí.

Dlhé a kol. 3 túto obavu vyriešili. Skúmali biologický účinok pripojenia hydrofóbnej skupiny (Boc3Arg, modifikovaná aminokyselina arginínu) na trimetoprim (TMP), molekulu ligandu, ktorá sa nekovalentne viaže na enzým dihydrofolátreduktázy (DHFR) z baktérie Escherichia coli. Autori zistili, že TMP–Boc3Arg indukuje 30–80 % degradáciu DHFR v cicavčích bunkách v závislosti od rýchlosti syntézy DHFR. Tento účinok môže byť blokovaný buď TMP, ktorý konkuruje TMP-Boc3Arg na väzbu k DHFR alebo inhibítormi proteazómovej aktivity.

Autori tiež preukázali, že enzým glutatión S-transferáza (GST) sa degraduje, keď sa ošetrí zlúčeninou, v ktorej Boc3Arg je naviazaný na kyselinu etakrynovú (EA), inhibítor GST, ktorý sa kovalentne viaže na aktívne miesto enzýmu. To ukazuje, že degradačný účinok Boc3Arg sa vyskytuje pre najmenej dva enzýmy. Dlhé a kol. pokračoval vo výrobe fúzneho proteínu, v ktorom je DHFR pripojený k GST, a potom sa bunky, ktoré produkujú proteín, ošetrili buď TMP-Boc3Arg alebo EA-Boc3Arg. Zistili, že DHFR-GST bol degradovaný účinnejšie EA-Boc3Arg, ktorý sa kovalentne viaže na proteín, než pomocou TMP-Boc3Arg, ktorý sa viaže nekovalentne. To naznačuje, že kovalentné pripojenie hydrofóbnych značiek k enzýmom je účinnejšou stratégiou degradácie proteínov.

Keďže TMP je vysokoafinitný inhibítor E. coli DHFR, sú potrebné ďalšie štúdie, aby sa zistilo, či malá molekula, ktorá je súčasne proteínovým inhibítorom a degradačným signálom, je účinnejšia pri rušení funkcie proteínu ako jednoduchý inhibítor. Ako uviedli autori, prípad botulotoxínu ilustruje výhodu degradačného prístupu. Najsilnejšia forma tohto toxínu, ktorý spôsobuje svalovú paralýzu, má polčas rozpadu v tele približne 3 mesiace. Hoci inhibítor toxínu by bol schopný krátkodobo potlačiť toxicitu, eliminácia toxínu je zjavne výhodným terapeutickým prístupom.

Avšak, Boc3Skupina Arg je veľká (hmotnosť takmer 500 daltonov) a veľké molekuly majú často slabé farmakokinetické vlastnosti, ktoré obmedzujú ich použitie ako liečiv. Takže jeho pridanie k existujúcemu inhibítoru by mohlo potenciálne zhoršiť farmakokinetické vlastnosti tohto inhibítora. Je zvláštne, že aj keď TMP má vysokú afinitu k E. coli DHFR a predpokladá sa, že má vynikajúcu priepustnosť buniek, Long a kol. potrebné na použitie vysokej koncentrácie TMP–Boc3Arg na pozorovanie degradácie proteínov. To naznačuje, že TMP–Boc3Arg ťažko preniká do buniek.

Je potrebné testovať ďalšie nekovalentné systémy ligand-proteín, aby sa stanovila minimálna afinita ligand-proteín potrebná na začatie degradácie proteínu. Medzitým je zaujímavé špekulovať o tom, ako by sa modularita tejto stratégie degradácie proteínov mohla použiť na objavovanie liekov. Dalo by sa uvažovať o zjednodušenom procese, v ktorom sa identifikujú ligandy pre neliečivý proteín, doplnené hydrofóbnymi skupinami (ako je adamantán alebo Boc3Arg) a testovali sa na ich schopnosť degradovať cieľový proteín. Nájdenie vysokoafinitných ligandov pre neliečiteľné proteíny bude určite výzvou, ale stávajú sa dostupné metódy, ktoré to uľahčia.

Napríklad chemické knižnice, v ktorých je každá zlúčenina pripojená k jedinečnému „čiarovému kódu“ DNA, môžu byť testované na proteínovú väzbu a chemické entity, ktoré majú najvyššie väzbové afinity, môžu byť následne identifikované pomocou čiarových kódov7. Táto metóda by umožnila rýchly skríning až 109 zlúčenín, zatiaľ čo najväčšie v súčasnosti používané skríningy testujú len približne 106 zlúčenín8. Kombinácia takýchto vysokovýkonných skríningových metód s prístupom hydrofóbneho značkovania by mohla urobiť z dnešných neliečiteľných proteínov atraktívne biologické ciele pri hľadaní zlúčenín, ktoré zlepšujú ľudské ochorenia.


Úvod

Podrobné pochopenie molekulárneho pôvodu hydrofóbneho účinku 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 v proteínoch a jeho úlohy ako hnacej sily pri skladaní a zostavovaní proteínov 10,11,12 ,13,14 je stále otvorený problém. Táto situácia nastáva, pretože proteínové sekvencie zahŕňajú komplexnú kombináciu hydrofóbnych (nepolárnych) a hydrofilných (polárnych) oblastí. Výsledné vzory nepolárnych oblastí majú typické rozmery, ktoré zodpovedajú kritickej hodnote pre hydrofóbny efekt 1,2,3,4,5,6,7,8. Táto hodnota, ktorá je približne 1 nm, zodpovedá rozdielu medzi malými a veľkými nepolárnymi rozpustenými látkami 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Aby sme pochopili molekulárny pôvod tejto charakteristickej dĺžky, mali by sme vychádzať z pozorovania, že molekuly vody majú tendenciu vytvárať siete vodíkových väzieb na úkor svojej rotačnej entropie. Nepolárne rozpustené látky menšie ako 1 nm zaberajú objem, ktorý je príliš malý na to, aby výrazne narušil tvorbu takýchto sietí vodíkových väzieb. Naproti tomu molekuly vody v blízkosti povrchov nepolárnych rozpustených látok väčších ako 1 nm nemôžu vytvoriť všetky vodíkové väzby, ktoré by vytvorili vo veľkom. Tieto dve situácie zodpovedajú rozdielnemu meraniu hydrofóbnych síl s objemom alebo povrchom pre malé alebo veľké ideálne hydrofóbne rozpustené látky 1 .

Naším cieľom je najprv objasniť, či sa proteíny, ktorých povrchy, ako je uvedené vyššie, vyznačujú prítomnosťou zložitých polárnych a nepolárnych vzorcov, správajú efektívne ako malé alebo veľké nepolárne rozpustené látky, a potom preskúmať dôsledky tejto skutočnosti na ich skladacie správanie 11,12,13 . Riešenie tejto otázky si vyžaduje presnú charakterizáciu konformačného priestoru proteínu vo vode, aby sa študoval počet vodíkových väzieb tvorených molekulami vody v blízkosti jeho povrchu vzhľadom na objem.

Na riešenie tohto problému sme využili príležitosti, ktoré ponúka prípad kvasinkového frataxínu (obr. 1a). Frataxín, čo je proteín podieľajúci sa na zostavovaní zhlukov železa a síry, tiež súvisí s Friedreichovou ataxiou, smrteľným neurodegeneratívnym stavom 15 . Uvažovali sme o kvasinkovom frataxíne, pretože tento proteín predstavuje jeden z mála príkladov, pre ktoré boli pozorované studené aj horúce denaturované stavy pri neutrálnom pH a bez pridania destabilizačných činidiel (pri 272 K a 323 K) a charakterizovaný nukleárnou magnetickou rezonanciou (NMR) chemické posuny a cirkulárny dichroizmus (CD) 15,16,17,18. Ako ukazuje priekopnícka práca Privalova, termodynamická analýza denaturácie za studena v porovnaní s analýzou tepelnej denaturácie ponúka jedinečné výhody na pochopenie molekulárnych determinantov hydrofóbnosti19,20. V skutočnosti sa všeobecne uznáva, že kým tepelná denaturácia je dôsledkom teplotne vyvolaného zvýšenia konformačných fluktuácií, studená denaturácia je dôsledkom entalpického zisku rozpúšťadla 19,20. Nie je však známych veľa atomistických detailov o štrukturálnych dôsledkoch tohto zisku entropie alebo entalpie v teplom a studenom denaturovanom stave. Modelovanie studených a horúcich denaturovaných stavov kvasinkového frataxínu v neprítomnosti akéhokoľvek ďalšieho činidla by teda malo zdôrazniť rôzne úlohy, ktoré zohráva proteín a rozpúšťadlo pri rôznych teplotách.

(a) Štruktúra prirodzeného stavu frataxínu. (b) Povrch voľnej energie v studenom denaturovanom stave (CDS) určený pri 272 K ako funkcia kolektívnych premenných náčrtu-map 63, ktoré opisujú konformačné znaky súborov (pozri Metódy). Je znázornených deväť mikrostavov reprezentujúcich lokálne a globálne minimá. Tieto mikrostavy tvoria >90 % celkovej populácie. (c) Povrch voľnej energie horúceho denaturovaného stavu (HDS) stanovený pri 323 K ako funkcia rovnakých dvoch kolektívnych premenných. Je zobrazených šestnásť mikrostavov reprezentujúcich lokálne a globálne minimá. Tieto mikrostavy tvoria >90 % celkovej populácie (pozri Metódy). (d,eSekundárna štruktúra populácie CDS (d) a HDS (e). α-helixy sú znázornené modrou farbou, β-reťazce červenou farbou a polyprolín II zelenou farbou voľné energie sú uvedené v kJ/mol.

V nasledujúcom texte používame chemické posuny merané v podmienkach denaturácie za studena a za tepla 15, 16, 17 spolu so simuláciami replikácie priemernej metadynamiky (RAM) 21, 22 (pozri Materiály a metódy), aby sme pri atómovom rozlíšení objasnili štruktúru a dynamiku studený denaturovaný stav (CDS) a horúci denaturovaný stav (HDS). V simuláciách RAM sú experimentálne informácie poskytované chemickými posunmi NMR začlenené v zmysle štrukturálnych obmedzení 22 a súčasne je vzorkovanie konformačného priestoru posilnené metadynamikou 23. Tento celkový prístup umožňuje súčasne meniť silové pole používané v simuláciách molekulárnej dynamiky, aby sa zlepšila ich zhoda s experimentálnymi údajmi v duchu princípu maximálnej entropie 24 a výrazne sa znížili výpočtové zdroje potrebné na dosiahnutie konvergencie pri vzorkovaní. Potom pomocou analýzy hodnôt Φ25,26,27 a molekulárnych simulácií obmedzených hodnôt Φ26 sme určili ich stav prechodu za studena (CTS) a stav prechodu za tepla (HTS), aby sme opísali rozdiely v zodpovedajúcich procesoch denaturácie za studena a za tepla. na rozdiely medzi studeným a horúcim denaturovaným stavom.


Steroidné hormóny

Steroidné hormóny, ktoré sú hydrofóbnymi molekulami, voľne difundujú do všetkých buniek. Avšak ich "cieľové" bunky obsahujú cytoplazmatické a/alebo jadrové proteíny, ktoré slúžia ako receptory hormónu. Hormón sa viaže na receptor a komplex sa viaže na prvky hormonálnej odozvy &mdash úseky DNA v promótoroch génov reagujúcich na hormón. Komplex hormón/receptor pôsobí ako a transkripčný faktor zapnutie (alebo vypnutie) cieľových génov.


Príbeh dvoch typov

Dozviete sa o dvoch typoch membránových proteínov: periférne bielkoviny a integrálne bielkoviny. Periférne proteíny majú slabšie a dočasné spojenia s membránou. Niektoré len sedia na povrchu, ukotvené niekoľkými iónovými väzbami, zatiaľ čo iné môžu mať malé časti, ktoré sa ponoria do hydrofóbnej časti dvojvrstvy. Keď sa pozriete na celú membránu, existuje viac periférnych proteínov v porovnaní s počtom integrálnych proteínov.

Ako už z názvu tušíte, integrálne proteíny sú trvalo spojené s bunkovou membránou. Sú to tvrdo pracujúci a majú veľké časti vložené do hydrofóbne (stredná) vrstva membrány.

Transmembránové proteíny sú integrálne proteíny, ktoré prechádzajú membránou a môžu pôsobiť ako cesty pre ióny a molekuly. Polytopické transmembránové proteíny niekoľkokrát prechádzajú cez membránu. Niektoré sú receptorové proteíny, zatiaľ čo iné tvoria kanály. Pohyb iónov, ktorý nevyžaduje prácu, sa nazýva pasívny transport, zatiaľ čo aktívne transportné systémy využívajú prácu na pohyb molekúl. Aktívny transport sa pravidelne používa, keď membránové proteíny pumpujú ióny proti koncentračnému gradientu.


Závery

Súčasná analýza naznačuje, že zdieľaná stratégia haloadaptation proteínov v prítomnosti molárnej koncentrácie soli, ale nie v prítomnosti osmolytov, si vyžaduje oslabenie hydrofóbnych interakcií vo všeobecnosti, a to najmä na úrovni jadra a konzervovaných hydrofóbnych kontaktov. Oslabenie týchto interakcií vyvažuje ich posilnenie prítomnosťou solí v roztoku a môže pomôcť štruktúre zabrániť agregácii a/alebo strate funkcie v hypersalinných prostrediach. Zníženie hydrofóbnosti skutočne robí halofilné proteíny nestabilnými v roztokoch solí s nízkou koncentráciou a môže čiastočne vysvetliť požiadavku halofilných proteínov na vysoké koncentrácie solí. Na doplnenie obrazu je potrebné zvážiť destabilizáciu halofilných proteínov pri nízkej koncentrácii solí v dôsledku silného elektrostatického odpudzovania [18, 33]. Zmršťovanie hydrofóbnych kontaktov musí byť ešte kritickejšie pre skoré štádiá skladania, keď sa musia správne vytvoriť intramolekulárne hydrofóbne jadrá, aby viedli polypeptid cez skladací lievik do natívneho stavu.

Ak vezmeme do úvahy aj významný nárast biotechnologických aplikácií halofilov, pochopenie mnohostrannej etiológie halofility (vrátane elektrostatických faktorov) môže poskytnúť teoretický základ pre inžinierstvo proteínov veľkého záujmu, pretože stabilné pri koncentráciách solí, ktoré spôsobujú denaturáciu alebo agregáciu väčšiny makromolekúl.


Výsledky

Rámec na opis interakcií stabilizujúcich stav kvapiek.

Predpokladom tejto práce je, že stav kvapiek je charakterizovaný interakciami s nízkou špecifickosťou a konformačnou entropiou podobnou kvapaline. Predpokladali sme teda, že proteíny, ktoré sú vo svojich natívnych stavoch konformačne heterogénne a zachovávajú si túto vlastnosť po naviazaní, by boli obzvlášť náchylné na vytvorenie kvapôčkového stavu. Pri odhadovaní stupňa konformačnej heterogenity v natívnom aj viazanom stave pozorujeme, že proteíny pokrývajú kontinuum medzi štruktúrnym poriadkom a poruchou (23, 24), čo vyjadríme pravdepodobnosťou pD (slobodný štát) a pDD (viazaný stav). Poznamenávame tiež, že interakcie s vysokou konformačnou entropiou sa realizujú prostredníctvom mnohých rôznych väzbových konfigurácií, ktoré možno dosiahnuť usporiadanými aj neusporiadanými doménami (25). Na rozdiel od toho, usporiadané väzbové režimy s nízkou konformačnou entropiou sú sprostredkované dobre definovanými rozhraniami, ktorých príkladom je pevné dokovanie alebo šablónovité skladanie (26).

Usporiadané a neusporiadané väzbové režimy vykazujú charakteristické sekvenčné podpisy. Motívy sprostredkujúce usporiadané väzbové režimy majú silnú kompozičnú zaujatosť v porovnaní s ich vloženými proteínovými oblasťami. Na rozdiel od toho, motívy sprostredkujúce neusporiadané väzbové režimy sú viac podobné ich priľahlým oblastiam, ktoré možno realizovať prostredníctvom rôznych sekvenčných vzorov a typov kontaktov, pretože ich špecifickosť vyplýva z ich odlišného charakteru v porovnaní s ich priľahlými oblasťami (23). Už sme predtým demonštrovali (27), že identifikáciou takýchto interakčných prvkov na základe kompozičnej zaujatosti je možné odhadnúť štrukturálny poriadok alebo poruchu v bunkových podmienkach vo vynikajúcej zhode s in vivo proteomickými štúdiami (28).

Vlastnosti proteínov, ktoré môžu vytvárať kvapôčkový stav.

Súbory údajov proteínov reprezentujúcich stav kvapiek.

Analyzovali sme tri verejné súbory údajov o proteínoch, o ktorých sa uvádza, že podstupujú separáciu fáz kvapalina-kvapalina (Materiály a metódy). Prvým je súbor údajov PhaSepDB (http://db.phasep.pro/) (29), ktorý zhromažďuje údaje z troch zdrojov (Materiály a metódy a súbor údajov S1): 1) proteíny z literatúry s in vivo a in vitro experimentálnymi údajmi o separácii fázy kvapalina-kvapalina (REV, 351 proteínov Materiály a metódy a Dataset S1), 2) proteíny z UniProt spojené so známymi organelami (UNI, 378 proteínov Materiály a metódy a Dataset S1) a 3) proteíny identifikované vysokovýkonnými experimentmi separácie fáz kvapalina-kvapalina (HTS, 2 572 proteínov Materiály a metódy a súbor údajov S1). Druhým súborom údajov je PhaSePro (https://phasepro.elte.hu) (30), ktorý identifikuje proteínové oblasti spojené s oddelením fázy kvapalina-kvapalina (PSP, 121 proteínov Materiály a metódy a súbor údajov S1). Tretím súborom údajov je LLPSDB (http://bio-comp.org.cn/llpsdb) (31), ktorý zhromažďuje proteíny, u ktorých bolo pozorované, že podstupujú separáciu fáz kvapalina-kvapalina in vitro s dobre definovanými experimentálnymi podmienkami a fázovými diagramami (Materiály a metódy a súbor údajov S1). LLPSDB rozlišuje, či sa proteíny môžu spontánne oddeliť ako jedna zložka (proteíny poháňajúce kvapky, LPS-D, 133 proteínov Materiály a metódy a Dataset S1) alebo vyžadujú, aby partner podstúpil separáciu fázy kvapalina-kvapalina (proteíny typu kvapôčka-klient, LPS-C, 41 proteínov Materiály a metódy a súbor údajov S1). V tomto súbore údajov vykazuje 77 proteínov správanie sa kvapôčok aj kvapôčkových klientov.

Aby sme vytvorili súbor údajov na separáciu fáz kvapalina-kvapalina, zlúčili sme proteíny v súboroch údajov REV, PSP a LPS-D, ktoré považujeme za hnacie sily tvorby kvapiek (453 jedinečných proteínov, súbor údajov LLPS Materiály a metódy a súbor údajov S1). Vytvorili sme dva súbory údajov negatívnej kontroly, jeden s iba ľudskými proteínmi a druhý so zmesou organizmov (súbor údajov S2). Pre ľudský negatívny súbor (súbor údajov hsnLLPS, 18 108 proteínov Materiály a metódy), z ľudského proteómu Swiss-Prot sme vylúčili všetky proteíny, ktoré sa objavili v ktoromkoľvek zo súborov údajov o separácii fázy kvapalina-kvapalina (REV, UNI, HTS, PSP, LPS-D, LPS-C) (29 ⇓ –31) (Súbor údajov S2). Pre negatívny súbor zodpovedajúci viacerým organizmom (nsLLPS Materiály a metódy), odvodili sme distribúciu organizmu zo súboru údajov LLPS. Na vytvorenie súboru kontrolných údajov sme zvážili organizmy obývané viac ako 1 % v súbore údajov LLPS a použili sme ich proteómy z UniProt (Caenorhabditis elegans, Chlamydomonas reinhardtii, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Xenopus laevis Materiály a metódy) a odstránili všetky proteíny prítomné v súboroch údajov LLPS alebo HTS. Potom sme náhodne vybrali sekvencie podľa frekvencií týchto organizmov v súbore údajov LLPS s 10-násobným obohatením (nsLLPS Materiály a metódy a súbor údajov S2).

Analýza zloženia aminokyselín kvapôčkových a kvapôčkových klientskych proteínov.

Proteíny poháňajúce kvapôčky sú obohatené o zvyšky podporujúce poruchu (P, G, S) a ochudobnené o zvyšky podporujúce poradie (F, I, V, C, W) v porovnaní s proteínmi, ktoré neoddeľujú fázu (obr. 2).A). N a Q, ktoré sa líšia v priónových doménach (32), sú hojnejšie v kvapôčkových proteínoch ako v tých, o ktorých sa neuvádza, že podstupujú LLPS. Avšak kvapôčkové proteíny nie sú významne obohatené o zvyšky, ktoré sprostredkovávajú interakcie π–π a katión–π (Y, R), v porovnaní s proteínmi bez separácie fáz (nsLLPS) (obr. 2A a množina údajov S3). Tieto výsledky naznačujú, že tvorba kvapiek nezávisí od konkrétneho typu kontaktu, ale môže sa skôr realizovať mnohými spôsobmi interakciami s nízkou špecifickosťou. Zloženie proteínov poháňajúcich kvapôčky je medzi zložením globulárnych proteínov (33) a neusporiadaných proteínov v databáze DisProt (33), v porovnaní s väčším množstvom zvyškov podporujúcich poriadok (W, C, Y, F, I, V). s neusporiadanými bielkovinami (Príloha SISIBa obohatené o zvyšky podporujúce poruchy (P, D, E) v porovnaní s globulárnymi proteínmi (34) (Príloha SISIA). Aromatické zvyšky pozorované v neusporiadaných oblastiach, napríklad v nukleoporínoch, často sprostredkovávajú interakcie s nízkou afinitou (35). Tieto kompozičné vlastnosti odrážajú preferenciu kvapôčkových proteínov pre neusporiadaný stav vo viazanej forme, ktorý je porovnateľný s proteínovými komplexmi s neusporiadanými väzbovými režimami (23).

Diferenciálne aminokyselinové kompozície proteínov vyvolávajúcich kvapôčky a kvapôčkových klientov. (A) Rozdiely v zložení aminokyselín (AAA) kvapôčkových hnacích proteínov v súbore údajov LLPS a proteínov, o ktorých sa neuvádza, že sú fázovo oddelené (nsLLPS). (B) Rozdiely v zložení aminokyselín kvapôčkových klientskych proteínov, ktoré vyžadujú ďalšie zložky na fázovú separáciu (súbor údajov LPS-C) a proteínov, o ktorých sa neuvádza, že by fázovo separovali (nsLLPS). (C) Rozdiely v zložení aminokyselín kvapôčkových klientskych proteínov (LPS-C) a kvapôčkových riadiacich proteínov (LLPS). Aminokyseliny zoskupené ako hydrofóbne (svetlo zelená), aromatické (zelené), hydrofilné (tyrkysové), nabité (oceľovo modrá) a podporujúce poruchy (tmavomodrá) (34). SE a významnosť rozdielov podľa Kolmogorov-Smirnovovho testu sú uvedené v súbore údajov S3.

V porovnaní s proteínmi, ktoré neoddeľujú fázu, sú proteíny kvapôčkových klientov obohatené o nabité zvyšky (D, K, E) a prolíny podporujúce poruchy (obr. 2B a množina údajov S3). Proteíny kvapôčkových klientov vykazujú charakteristické rozdiely od kvapôčkových proteínov, pretože sú obohatené o nabité zvyšky (K, E) a hydrofóbne motívy (L, V, I), zatiaľ čo sú ochudobnené o fosforyláciu podporujúcu amyloid (N, Q). - zvyšky podporujúce (S) a zvyšky podporujúce poruchu (G) (obr. 2C a množina údajov S3). Aminokyselinové zloženie kvapôčkových klientov je teda viac podobné štruktúrovaným ako neusporiadaným proteínom (Príloha SISIB).

Analýza konformačnej entropie kvapôčkových a kvapôčkových klientskych proteínov.

Zistili sme, že rôzne súbory údajov o proteínoch predstavujúce stav kvapiek majú výrazne odlišné charakteristiky vo svojej konformačnej entropii vo voľnom stave a jej zmene po väzbe. Poháňače tvorby kvapiek (LPS-D) majú vysoké úrovne porúch vo voľnom (pD) a viazané stavy (pDD), zatiaľ čo kvapôčkoví klienti (LPS-C) sa väčšinou objednávajú v oboch formách (obr. 3 A a B). Proteíny v súboroch údajov REV a PSP vykazujú neusporiadané väzbové režimy, ktoré sú porovnateľné s proteínmi vyvolávajúcimi kvapôčky, takže sa pravdepodobne spontánne oddeľujú. Proteíny spojené so známymi bezmembránovými organelami (UNI) alebo identifikované vysokovýkonnými experimentmi (HTS) (29) majú výrazne nižšiu konformačnú entropiu vo voľnom aj viazanom stave, a preto pravdepodobne majú zložky, ktoré tvoria kvapôčky prostredníctvom partnerských interakcií. Porovnanie spontánne fázovo separujúcich a fázovo neoddeľujúcich proteínov (obr. 3 C a D) naznačuje, že vysoká konformačná entropia je charakteristická pre stav kvapiek.

Konformačné vlastnosti v rôznych súboroch údajov proteínov LLPS vo voľnom a viazanom stave. Preskúmaná literatúra PhaSepDB (svetlomodrá), proteíny PhaSepDB spojené s ľudskými organelami od UniProt (oceľová modrá), proteíny PhaSepDB identifikované vysoko výkonnými experimentmi (tmavomodrá), PhaSePro (oranžová), jednozložkové proteíny LLPSDB (pšenica kvapôčky), a dvojzložkové (sivé kvapôčky klientov) proteíny oddeľujúce fázy. (A) Pravdepodobnosť neusporiadaného stavu (pD) vo voľnej forme bol charakterizovaný podielom neusporiadaných zvyškov, ako sa vypočítalo programom ESpritz NMR (36). Zvyšky sú klasifikované ako neusporiadané, ak majú ID skóre ≥0,3089. Frakcia neusporiadaných zvyškov sa vypočítala na proteín ako NID/NAA a tieto hodnoty boli spriemerované pre každý súbor údajov. (B) Pravdepodobnosť neusporiadanej väzby (pDD) bol vypočítaný programom FuzPred (23). Medián pDD pre každý proteín a tieto hodnoty boli spriemerované pre každý súbor údajov. (C a D) Porovnanie pD a pDD v kvapôčkovom riadení (LLPS svetlomodrá) a proteínoch neoddeľujúcich fázu (nsLLPS tmavomodrá). Štatistické významnosti vypočítal Mann-Whitney U otestujte pomocou programu R (**P < 10 −3 , ***P < 10 −5 , ****P < 10-10).

Sekvenčne založená predikcia profilov náchylnosti proteínov na kvapky.

Na základe analýzy uvedenej vyššie v tejto časti uvádzame metódu predpovedania sekvenčného profilu sklonu proteínov spontánne vytvárať kvapôčkový stav (pDP). Aby sme dosiahli tento výsledok, definujeme pravdepodobnosť rezíduí Ai podieľať sa na spontánnej separácii fáz tým pDP (Ai) pomocou binárneho logistického modelu ako p DP ( A i ) = exp FS ( A i ) 1 + exp FS ( A i ), [1] kde FS ( A i ) je skórovacia funkcia pre zvyšok FS ( A i ) = λ 1 p D ( A i ) + λ 2 p DD ( A i ) + γ , [2] kde p D ( A i ) je pravdepodobnosť pre neporiadok vo voľnom stave a p DD ( A i ) je pravdepodobnosť pre neusporiadanú väzbu (23). p D ( A i ) obsahuje odhad konformačnej entropie v neviazanej forme, kým p D D ( A i ) obsahuje odhad väzbovej entropie. λ1 a λ2 sú lineárne koeficienty prediktorových premenných a γ je skalárna konštanta (intercept), ktoré boli určené pomocou binárneho logistického modelu (Materiály a metódy a množina údajov S4). pD bola odvodená zo skóre poruchy vypočítaného pomocou algoritmu ESpritz NMR (36), s najlepším výkonom na neusporiadaných proteínových komplexoch (23). The pDD hodnoty boli predpovedané metódou FuzPred, ktorá popisuje väzbové režimy v bunkových podmienkach (27). The pD a pDD hodnoty zachytávajú rovnováhu medzi entalpiou a entropiou, ktorá stabilizuje stav kvapiek, čo je spojené s nešpecifickou povahou rôznych interakcií postranných reťazcov.

Na trénovanie nášho modelu sme použili súbor údajov oblastí podporujúcich kvapôčky s dôkazmi, že sprostredkúvajú spontánne oddelenie fáz (Materiály a metódy a súbor údajov S1). Ako negatívny súbor sme definovali oblasti v proteínoch bez separácie fáz s rovnakou distribúciou dĺžky ako v pozitívnom súbore (Materiály a metódy). Veľkosť negatívneho súboru bola 10-krát väčšia ako veľkosť pozitívneho súboru a v tréningu sme použili stratifikovaný výber. Zistili sme, že lineárne koeficienty boli robustné pri mnohých náhodných výberoch pozitívnych a negatívnych súborov, ako aj veľkosti tréningového súboru (údajový súbor S4). V konečnej parametrizácii boli lineárne koeficienty oboch režimov poruchy a väzby pozitívne, čo odrážalo preferenciu neusporiadaného viazaného stavu v kvapkách. Prahová hodnota na sprostredkovanie tvorby kvapiek bola odvodená z binárneho logistického modelu (pDP ≥ 0.60).

Aby sme odhadli výkonnosť metódy, vypočítali sme hodnotu plochy pod krivkou (AUC) 87,0 % na tréningovej sade a hodnotu AUC 85,9 % na testovacej sade (Materiály a metódy a množina údajov S4). Tieto koeficienty sme aplikovali na všetky oblasti kvapiek a získali sme hodnotu AUC 84,4 %. Tieto výsledky ukazujú, že parametre sú robustné v oblasti kvapiek z rôznych organizmov. Poznamenávame tiež, že profily náchylnosti proteínov, ktoré podporujú tvorbu kvapiek v bunkových podmienkach, a tie, ktoré boli detegované iba experimentmi in vitro, sa významne nelíšia (Príloha SI, Obr. S3).

Vyvinuli sme teda metódu FuzDrop na predpovedanie tendencií zvyškov z primárnej sekvencie podporovať kvapôčky na základe konformačnej entropie neusporiadaných väzbových režimov v kvapkách.

Profily náchylnosti TDP-43 a a-synukleínu podporujúce kvapky.

Použili sme metódu FuzDrop na predpovedanie sklonov dvoch proteínov, o ktorých sa uvádza, že podstupujú separáciu fáz kvapalina-kvapalina, TDP-43 (37) a a-synukleínu (38, 39). Naše výsledky naznačujú, že oblasť s nízkou zložitosťou TDP-43 (zvyšky 262 až 414) sprostredkuje spontánnu fázovú separáciu. We note that the α-helical segment (residues 320 to 331), which constitutes the amyloid core in TDP-43 fibrils (40) (Fig. 4A) and is predicted to undergo disorder-to-order transition upon binding, also has a high droplet-promoting propensity (Fig. 4A).

Droplet-promoting propensity profiles (pDP) of the TDP-43 low-complexity (LC) domain and of α-synuclein. (A) The TDP-43 LC domain has overall high droplet-promoting propensities. The depletion in the droplet profile corresponds to the α-helical segment (orange), which is involved in the amyloid core. The N- (lime) and C- (blue) flanking regions are disordered in the NMR structure of the G335D mutant (PDB ID code 2n4g). (B) The disordered C-terminal region of α-synuclein (blue) is predicted to drive droplet formation. The N-terminal region (lime), which folds into an α-helix, has intermediate pDP hodnoty. The ensemble is derived from the Protein Ensemble Database (PED9AAC). The pLLPS threshold is indicated by a bold gray line.

In the case of α-synuclein, the highly disordered C-terminal region (residues 98 to 140), which also remains disordered upon binding to lipid vesicles (41), is predicted to drive the formation of the droplet state (Fig. 4B). The central non-amyloid beta component (NAC) region has lower pDP propensity to spontaneously phase separate, but may be involved in droplets via hydrophobic protein interactions, which are absent from β-synuclein and γ-synuclein (38).

Sequence-Based Prediction of Droplet-Driving Proteins.

In this section, we present a method of ranking proteins according to their propensity to form the droplet state. In order to achieve this result, we estimate the probability of liquid–liquid phase separation (pLLPS) using a binary logistic model (Materiály a metódy) with a scoring function (FLLPS) derived from residue droplet-promoting propensities and a term for hydrophobic interactions F L L P S = λ 1 ∗ m e d i a n < p D P ( A i ) >+ λ 2 ∗ n D P R + λ 3 ∗ H + γ , [3] where m e d i a n < p D P ( A i ) >is the median of the residue droplet-promoting propensities, n D P R is the number of long droplet-promoting regions (DPRs ≥25 consecutive residues with pDP ≥ 0.6), and H is a hydrophobic term (≥6-residue hydrophobic motifs within disordered regions) (Materiály a metódy). λ1, λ2, and λ3 are the linear coefficients of the predictor variables and γ is a scalar constant (intercept), which we determined on the LLPSvlak and nsLLPSvlak datasets (Materiály a metódy and Dataset S5). We found that the linear coefficients were robust over many random selections of the positive and negative sets, as well as the training set size (Dataset S5). The threshold to mediate spontaneous liquid–liquid phase separation was derived from the binary logistic model (pLLPS ≥ 0.61). We propose that the pLLPS value expresses the droplet-driving potential under physiological conditions, as droplet-promoting propensities of proteins that form droplets under physiological conditions and those that were detected to phase separate only in vitro do not deviate significantly (SI Appendix, Fig. S2). We also note that using nonphysiological conditions, such as high concentrations of protein and crowding agents, can induce liquid–liquid phase separation at pLLPS values below the threshold, especially if droplet-promoting regions are present.

To estimate the performance of the method, we calculated an AUC value of 88.3% on the training set (0.75 of the LLPS dataset) and an AUC value of 90.7% on the test set, using stratified sampling (Materiály a metódy and Dataset S5). As an attempt to further improve performance, we incorporated a π–π term (19) into the scoring function of the logistic model (Materiály a metódy). Adding this term slightly increased the performance of the model (AUC 92.2% Dataset S5) with a moderate contribution to the scoring function. These results are in accord with the presence of π–π interactions in many droplet proteins, but also show that these interactions are not prerequisites for droplet formation.

The performance and robustness of the model (Eq. 3 and Dataset S5) demonstrate that the droplet state can be predicted from sequence based on the estimated conformational entropy of binding and a nonspecific enthalpy term. We also note that our model by Eq. 3 serves as a general framework for predicting droplet-driver proteins. Accumulating data collected using more systematic and uniform experimental approaches (8) will enable further refinement of the parameters in our model and to predict the minimum concentration for phase separation, although this property can be expected to be highly dependent on the cellular conditions.

Region Specificity of the FuzDrop Method and Experimental Validation of the Predictions.

We note that estimates of the overall propensity of a protein to form the droplet state cannot be readily obtained by a simple average of the values of the profiles of Eq. 2. This overall propensity is also determined by specific regions, rather than only by the general properties of the entire sequence, including in particular droplet-promoting regions and short motifs within disordered regions, which are prone to establish hydrophobic interactions (Eq. 3). This point can be illustrated by distinct behaviors of α-synuclein and β-synuclein (38). The C-terminal region of both proteins possesses a droplet-promoting region, with a preference for disordered binding modes (Fig. 4 and SI Appendix, Fig. S3). In addition, the NAC region of α-synuclein contains eight hydrophobic residues, biased for disordered binding, which can exert a nonspecific driving force (resembling hydrophobic collapse) for droplet formation. Notably, however, β-synuclein and γ-synuclein, which lack these residues (SI Appendix, Fig. S3), were not observed to undergo liquid–liquid phase separation under physiological conditions (38).

The predicted pLLPS values by the FuzDrop method (0.62 for α-synuclein, 0.54 for β-synuclein, and 0.40 for γ-synuclein) suggest that β-synuclein and γ-synuclein have lower propensity to adopt the droplet state as compared with α-synuclein. Indeed, γ-synuclein did not phase separate under any of the experimental conditions tested (38). To validate the predictions close to the prediction threshold, we explored β-synuclein phase behavior in a set of in vitro experiments (Fig. 5). In line with previous observations (38, 39), we did not observe any droplets after incubating high concentrations of fluorescein 5-isothiocyanate (FITC)-labeled β-synuclein on a glass surface, whereas we did observe droplets for FITC-labeled α-synuclein (Fig. 5 A a B). As hydrophobic effects are important for α-synuclein droplet formation and considering that β-synuclein lacks the predominantly hydrophobic segment in the NAC region, we reasoned that raising the experimental temperature would increase the strength of residual hydrophobic interactions, allowing the protein to cross the phase barrier. Indeed, β-synuclein formed micrometer-sized droplets when the temperature was raised by 10 °C and at high concentrations (Fig. 5C). Droplets formed by FITC–β-synuclein were initially liquid-like, as evidenced by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), but showed rapid conversion to a gel-like state (Fig. 5C). The phase separation behavior of β-synuclein illustrates that protein phase separation is highly dependent on the experimental conditions, that proteins with a predicted pLLPS below the threshold (pLLPS ≥ 0.61) require more extreme conditions to adopt the droplet state, and that the droplet state of these proteins is generally short-lived.

Region-specific phase behavior of α-synuclein and β-synuclein. (A) FITC-labeled β-synuclein (pLLPS 0.54), which lacks the characteristic NAC region found in α-synuclein, does not phase separate at high concentrations (200 μM) and under crowding conditions (10% [weight/volume] PEG), whereas FITC-labeled α-synuclein (pLLPS 0.62) readily forms droplets under the same conditions. (B) Increasing the experimental temperature by 10 °C does lead to rapid coalescence of β-synuclein into micrometer-sized droplets. (C) Rapid FRAP of a small area within a droplet (Hore) 1 min after phase separation FRAP 3 min after phase separation (Spodná časť) and a nonlinear fit of fractional fluorescence recovery over time (Správny). (Scale bars, 10 μm [A a B] and 5 μm [C].)

As an additional test of our predictions, we ranked a set of proteins associated with Alzheimer’s disease (42) based on their predicted FuzDrop scores (Dataset S6) and selected one of the top candidates, complexin-1, to experimentally test our predictions (Fig. 6). To assess whether complexin-1 can form droplets through liquid–liquid phase separation, we incubated Alexa 488-labeled complexin-1 on a glass surface under crowding conditions at physiological pH (Materiály a metódy). After a brief lag phase (<1 min), complexin-1 formed micrometer-sized droplets in suspension (Fig. 6A). The droplets were characteristic of a liquid phase, as they showed distinct wetting behavior after prolonged incubation (>10 min) (Fig. 6A) and fused upon making contact (Fig. 6B). Furthermore, molecules within the droplets showed local rearrangement, as evidenced by rapid FRAP (Fig. 6C). We also predicted that the disordered N-terminal region of complexin-1 drives its liquid–liquid phase separation (SI Appendix, Fig. S4). This region cooperatively interacts with the SNARE complex and plasma membrane (43) to facilitate synaptic vesicle fusion (44). Phase separation may contribute to activation of complexin-1 by relieving its autoinhibition, which is a common mechanism by the droplet state (21).

Complexin-1 undergoes liquid–liquid phase separation. (A) Alexa 488-labeled complexin-1 (10 μM) coalesces into micrometer-sized droplets under crowding conditions (Vľavo). Droplets exhibit a wetting phenotype when encountering a glass surface (Správny). (B) Complexin-1 droplets readily fuse when in close proximity (<1 μm) and relax into a round structure after fusion, as noted by the arrows. (C) Rapid FRAP of a small area within a droplet (Hore) nonlinear fit of fractional fluorescence recovery over time (Spodná časť). (Scale bars, 5 μm [A] and 1 μm [B a C].)

Droplet-Driving and Droplet-Client Proteins in the Human Proteome.

We applied the prediction method to estimate the proteins capable of undergoing spontaneous liquid–liquid phase separation (droplet-driving proteins) in the Swiss-Prot human proteome. We thus ranked the proteins in the human proteome according to their propensity to form the droplet state (Dataset S7), and estimated that about 40% of them are capable of spontaneous droplet formation.

This list contains only about 60% of the human proteins currently associated with membraneless organelles (UNI). This fraction is even lower for proteins identified by high-throughput experiments (HTS), including organelle purification (45, 46), affinity purification (47, 48), immunofluorescence image-based screen (49, 50), and proximity labeling (51, 52) (SI Appendix, Fig. S5). As the FuzDrop approach was developed for proteins that drive droplet formation, our results indicate that membraneless organelles contain also proteins that undergo phase separation by being driven by a partner (droplet-client proteins). We observed that droplet clients have a lower conformational disorder in both free and bound states (Fig. 3), suggesting the involvement of distinguished, local motifs. Thus, the droplet-client mechanism can provide a route for structured proteins to be engaged in condensates via specific droplet-promoting regions.

To investigate the properties underlying the droplet-client mechanism, we analyzed the presence of long and short droplet-promoting regions in the droplet-driver (LLPS) and droplet-client (LPS-C) datasets (Table 1). We found that ∼90% of droplet-client proteins contain a short droplet-promoting region (≥10 residues), while only ∼60% have long ones (≥25 residues). The frequency of short and long droplet-promoting regions in proteins, identified by high-throughput experiments, is comparable to droplet-client proteins (Table 1), indicating that they follow a partner-induced client mechanism. In contrast, the frequency of droplet-promoting regions in proteins associated with human membraneless organelles is comparable to droplet drivers (Table 1). Considering their lower droplet-promoting propensities (Dataset S7), these results indicate that proteins in membraneless organelles likely follow both driver and client mechanisms.

Percentage in different datasets of proteins containing regions predicted to be droplet promoting

Overall, we thus estimate that over 80% of the proteins in the human proteome contain regions that can mediate droplet formation. Half of these proteins can condensate spontaneously, while the other half can do so by interacting with other components (Table 1). We have also observed that the number of droplet-promoting regions is comparable in proteins observed to form droplets under physiological conditions or detected by in vitro experiments (SI Appendix, Fig. S2), corroborating the relevance of the predictions under cellular conditions. We then extended these results to other organisms (Dataset S8), leading to the suggestion that the droplet state is a proteome-wide phenomenon.


Hydrophobic proteins in the body? - Biológia

Proteins have complex and dynamic shapes. The function of a protein is determined by its structure a change in the protein’s activity involves a change in some portion of the protein’s structure (shape). Čo teda určuje štruktúru proteínu?

Proteins are assembled as a linear chain of amino acids covalently linked by peptide bonds. As this chain is being assembled (each subsequent amino acid is added onto the free carboxy- terminus of the nascent polypeptide chain), the polypeptide chain begins to fold.

Biológovia rozlišujú 4 úrovne proteínovej štruktúry. Študenti by mali byť schopní identifikovať štyri úrovne proteínovej štruktúry a molekulárne sily alebo interakcie zodpovedné za stabilizáciu každej úrovne štruktúry.

Štyri úrovne proteínovej štruktúry

Primary – the linear sequence of amino acids, held together by covalent peptide bonds.

Secondary – alpha helices and beta sheets, stabilized by hydrogen bonds between peptide backbone amino groups and carboxyl groups of amino acids within the same polypeptide chain, but not immediately next to each other.

Tertiary – overall 3-D shape of the folded polypeptide chain, that can be described as the spatial relationships of the secondary structure elements linked by loops. Stabilized by various types of amino acid side chain interactions, including: hydrophobic and van der Waals interactions, hydrogen bonding, ionic bonds, covalent disulfide bonds between cysteine residues, and interactions with solvent water molecules.

Quaternary – assemblage of two or more folded polypeptides into a functional unit. Stabilized by interchain hydrophobic and van der Waals interactions, hydrogen bonding, ionic bonds, and covalent disulfide bonds between cysteine residues on different polypeptide chains.

1. The classic case exploring protein structure is hemoglobin. Functional hemoglobin is a tetramer, consisting of two alpha-globin and two beta-globin polypeptide chains. Hemoglobin also requires a cofactor, heme (also called a prosthetic group), containing an iron atom that binds oxygen.

a) What levels of protein structure does hemoglobin exhibit?

b) The most common sickle-cell disease mutation changes a glutamic acid (a negatively charged amino acid) in beta-globin to valine (a hydrophobic amino acid). Where would you most commonly expect to find a charged amino acid like glutamic acid, in the interior of the folded protein or on the surface?

c) Which of the following changes do you think might also cause sickle-cell disease?

i) the glutamic acid changes to an aspartic acid, a different negatively charged amino acid

ii) the glutamic acid changes to a lysine, a positively charged amino acid

iii) the glutamic acid changes to a tryptophan, a hydrophobic amino acid

iv) the glutamic acid changes to a serine, an uncharged, hydrophilic amino acid

d) Sickle cell hemoglobin mutations alter what levels of protein structure (when sickling of red blood cells is apparent)?

2. The most common mutation associated with cystic fibrosis causes a single amino acid, a phenylalanine, to be omitted from the protein called CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductor). The CFTR protein functions as a chloride channel in the membrane, formed as the single long CFTR polypeptide chain crosses the membrane back and forth several times. The absence of this phenylalanine, which has a large hydrophobic side chain, causes the protein to be mis-folded. This mis-folded protein is recognized by the cellular quality control system and sent to the cellular recycling center (the proteasome) only about 1 percent makes it to the proper destination, the plasma membrane. My case study is published as a blost post:

3. Microbes that live in extreme environments of temperature, salt and pH have proteins that are adapted for structural stability in these extreme environments.

Edits: 9/30/12 – replaced link to single video with 2 split videos of protein structure and sickle cell hemoglobin


Materiály a metódy

Protein Engineering.

Glu-containing variants of the Δ+PHS variant of SNase were prepared with QuickChange site-directed mutagenesis on a pET24A+ vector as described previously (9, 16). Purification was performed as described previously (33).

Thermodynamic Stability Measurements.

Stability measurements were performed with guanidinium chloride titrations using an Aviv Automated Titration Fluorimeter 105, as described previously (34). Linkage analysis of pH dependence of stability to obtain pKa values was performed as described previously (9, 10, 12).

Optical Spectroscopy.

pH titrations monitored with CD at 222 nm or with Trp fluorescence were performed with an Aviv Automated Titration Fluorimeter model 105 and with an Aviv circular dichroism spectrometer model 215, respectively. The experiments were performed following protocols published previously (34).


Difference Between Hydrophilic and Hydrophobic

Solvents, mixtures, compounds, and particles are just some of the components of a chemist’s life. Studies involving the observance of molecule behavior in any given state or environment may seem to be one of the most brain-whacking jobs for those with little background in chemistry and related sciences, but these are very helpful in coming up with the latest products and developments in various industries.

Chemists, biologists, and other individuals pursuing a career in the field of science, start their career by attaining the necessary training from universities and colleges. When they decide to have a career related to biochemistry, their education starts with lessons that give them a deeper understanding of molecular activities and behavior.

That being said, it is safe to assume that the basic courses offered during their first year of college include an evaluation of the hydrophobic and hydrophilic nature of molecules and other particles.

The word “hydro-” means “water.” Thus, studying hydrophobic and hydrophilic molecules concerns the solubility and other properties of particles as they interact with water. The term “–phobic,” originating from “phobia,” would translate into “fearful of (water).” Hydrophobic molecules and particles, therefore, can be defined as those that do not mix with water – they repel it. On the other hand, hydrophilic molecules are those that interact well with H2O.

In other words, the distinction between hydrophobic and hydrophilic molecules is drawn by observance of the hydrophobic particles’ repellency of water and hydrophilic molecules’ attraction to water.

In a laboratory experiment, for example, one can observe that there are particular solubles that dissolve in water, and others that do not. Crushed and powdered makeup, for example, may be able to dissolve in a glass full of cooking oil, but not in a glass full of water. Salt, on the other hand, is easily absorbed by water, but it may not dissolve in oil.

Crushed and powdered makeup, therefore, can be seen as hydrophobic particles. Meanwhile, students can arrive at the conclusion that the molecules of salt are hydrophilic. Salt can keep a strong affinity in water, ktorý can absorb and dissolve it. On the other hand, the oil-based makeup contains molecules that repel and refuse to combine with the molecules of water.

Aside from laboratory experiments, this molecular behavior in reference to the hydrophobic and hydrophilic nature is also observed when biologists look into the permeability of cell membranes. Note that several particles may enter and exit the cell through the membrane, which is made of lipid bilayers and proteins.

When the particles are hydrophobic, a simple passive diffusion occurs, which means that the molecule does not need the exertion of energy to enter or exit the cell. This is because the cell membrane comes with hydrophobic components that match the molecules.

On the other hand, hydrophilic particles may need protein carriers for facilitated diffusion. This is because the components of the molecules reject those of the cell membrane.

To get a clearer understanding of this, picture a glass of water and a glass of cooking oil. When water is added to the oil, there is repulsion between the molecules. But when one puts water into water and oil into oil, no reaction will be observed.

Organic chemistry provides an explanation for this phenomenon. Note that water contains polar molecules it therefore follows that polar substances and particles get absorbed or attracted by H2O. Hydrophilic molecules are known to be polar and ionic – they have positive and negative charges, which can attract water molecules. Conversely, hydrophobic particles are known to be non-polar.

Zhrnutie:

1.Hydrophilic means water loving hydrophobic means resistant to water.
2.Hydrophilic molecules get absorbed or dissolved in water, while hydrophobic molecules only dissolve in oil-based substances.
3.Hydrophilic molecules require facilitated diffusion, while hydrophobic molecules are suitable for passive diffusion in cellular activities.
4.Hydrophilic molecules are polar and ionic hydrophobic molecules are non-polar.


Pozri si video: Protein Quatro Pro Megabol l Videorecenzia l GymBeam l Igor Illeš (November 2022).