Informácie

B9: Hemové proteíny – biológia

B9: Hemové proteíny – biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Doteraz sme skúmali tri rôzne druhy hemových proteínov.

  • Prvý, hemoglobín (a myoglobín) slúžia ako nosiče dikyslíka. Aj keď viažu jedno z najlepších oxidačných činidiel v okolí (dikyslík), hem Fe2+ sa neoxiduje na Fe3+. Ak sa tak stane, ako v prípade met-Hb, proteín stráca schopnosť prenášať kyslík.
  • Cytochróm C na druhej strane neviaže dikyslík, ale slúži skôr ako nosič elektrónov, ktoré prechádzajú na dikyslík v oxidáze cytochrómu C. Jeho ión Fe ľahko cykluje medzi stavmi 2+ a 3+, pretože slúži ako nosič elektrónov.
  • Nakoniec, Fe2+ v heme cytochrómu P450 (takto pomenované, pretože majú maximum absorbancie pri 450 nm, keď viažu CO) robí oboje. Viaže dikyslík a cykluje medzi stavmi 2+ a 3+, pretože aktivuje dixoxygén pre hydroxylačné reakcie.

Ako mohol hem plniť také rôznorodé funkcie? Môžeme to vysvetliť odkazom na jednu z hlavných tém kurzu – štruktúra sprostredkúva funkciu. Prostredie každého hemu musí byť iné. Je zrejmé, že proteínové ligandy koordinujúce ióny Fe sú odlišné. Piaty ligand je proximálny His v hemoglobíne, zatiaľ čo dikyslík sa viaže na 6. miesto. V cytochróme C sú 5. a 6. ligandom His a Met. V cytochróme P450 je 5. miesto obsadené Cys a 6. dioxygénom. Prostredia obklopujúce hemy sú pravdepodobne tiež odlišné. Opäť sme videli analogický príklad, v ktorom sú chemické vlastnosti ovplyvnené mikroprostredím. pKa daného aminokyselinového bočného reťazca sa môže značne meniť v závislosti od polarity lokálneho prostredia. Podobne štandardný redukčný potenciál pevne viazaného FAD/FADH2 závisí od mikroprostredia.

Ako sme videli (zo štúdia hemových proteínov a oxidačných enzýmov buniek), prechodné kovy ako Fe, Zn a Cu majú životne dôležité biologické úlohy ako väzbové miesta a kofaktory v mnohých reakciách. Napriek tomu tiež predstavujú problémy, pretože môžu viesť k oxidačnému poškodeniu buniek. Ako sme videli pri cytoplazmatických metalotioniénoch, ktoré sa viažu na ťažké kovy a chránia bunku pred takýmto poškodením, mnohé proteíny sa podieľajú na väzbe a regulácii prechodných kovov v bunke. Na viazanie a transport týchto katiónov do cytoplazmy sú potrebné integrované membránové proteíny. Iné proteíny fungujú ako senzory koncentrácie prechodných iónov (ako sú latentné transkripčné faktory, ktoré viažu ťažké kovy a stávajú sa aktívnymi transkripčnými faktormi pre metalotioniény. Iné pôsobia ako chaperónové proteíny, ktoré viažu kovové ióny a prenášajú ich na apometaloproteíny. Nedávna práca naznačuje, že sa podieľajú transportéry a chaperóny v biológii kovových iónov viažu tieto ióny s nezvyčajnou koordinačnou geometriou, ktorá pravdepodobne uľahčuje prenos iónu do apo-cieľového proteínu.

Prechodné kovy Zn a Fe sa často nachádzajú v E. coli v koncentrácii 0,1 mM v porovnaní s Cu a Mn, ktoré sú prítomné v koncentráciách od 10 do 100 μM. Tiež asi jedna tretina všetkých proteínov vykazuje špecifickú väzbu kovových iónov a možno ich klasifikovať ako metaloproteíny. Hmotnostná bilancia naznačuje, že kovové ióny by boli distribuované v proteínoch s nízkou, strednou a vysokou väzbovou afinitou kovov, ako aj vo voľných zásobách, ktoré sú potenciálne toxické pre bunky. Metaloproteíny, v závislosti od ich Kd pre väzbu kovového iónu, by teda boli v rôznom stave ligácie. Voľná ​​koncentrácia niektorých iónov (Cu a Zn) je taká nízka, že novosyntetizované apoproteíny, ktoré viažu tieto ióny, by nezískali ión z voľného poolu. V takýchto prípadoch by boli potrebné kovové chaperóny.


Endoteliálny NOS

Endoteliálny NOS (eNOS), taktiež známy ako syntáza oxidu dusnatého 3 (NOS3) alebo konštitutívne NOS (cNOS), je enzým, ktorý je u ľudí kódovaný NOS3 gén lokalizovaný v oblasti 7q35-7q36 chromozómu 7. [5] Tento enzým je jednou z troch izoforiem, ktoré syntetizujú oxid dusnatý (NO), malú plynnú a lipofilnú molekulu, ktorá sa zúčastňuje viacerých biologických procesov. [6] [7] Medzi ďalšie izoformy patrí neuronálna syntáza oxidu dusnatého (nNOS), ktorá je konštitutívne exprimovaná v špecifických neurónoch mozgu [8] a indukovateľná syntáza oxidu dusnatého (iNOS), ktorej expresia je typicky indukovaná pri zápalových ochoreniach. [9] eNOS je primárne zodpovedný za tvorbu NO vo vaskulárnom endoteli, [10] monovrstve plochých buniek lemujúcich vnútorný povrch krvných ciev, na rozhraní medzi cirkulujúcou krvou v lúmene a zvyškom steny cievy. [11] NO produkovaný eNOS vo vaskulárnom endoteli hrá rozhodujúcu úlohu pri regulácii vaskulárneho tonusu, bunkovej proliferácie, adhézie leukocytov a agregácie krvných doštičiek. [12] Preto je funkčný eNOS nevyhnutný pre zdravý kardiovaskulárny systém.


Biologický význam a aplikácie hem c proteínov a peptidov

Hemy sú v biológii všadeprítomné a vykonávajú širokú škálu funkcií. Skupina hemu je do značnej miery invariantná medzi proteínmi s rôznymi funkciami, aj keď v prírode existuje niekoľko variácií. Najbežnejším variantom je hem c, ktorý vzniká posttranslačnou modifikáciou, pri ktorej je hem kovalentne naviazaný na dva Cys zvyšky na polypeptide prostredníctvom tioéterových väzieb. V tomto prehľade sa diskutuje o vplyve tohto kovalentného pripojenia na vlastnosti a funkciu hemu c a sú uvedené príklady toho, ako sa kovalentné pripojenie používa vo vybraných aplikáciách. Proteíny, ktoré viažu hem c, patria medzi najlepšie charakterizované proteíny v biochémii. Väčšina z týchto proteínov sú cytochrómy c (cyts c), ktoré slúžia ako nosiče elektrónov pri fotosyntéze a dýchaní. Napriek intenzívnemu štúdiu cyts c zostal funkčný význam kovalentnej väzby hemu nepolapiteľný. Jedným pozorovaním je, že hem c dosahuje v prírode nižší redukčný potenciál ako jeho nekovalentne viazaný náprotivok, hem b, pri porovnaní proteínov s rovnakými axiálnymi ligandami. Okrem toho je známe, že kovalentné pripojenie zvyšuje stabilitu proteínu a umožňuje, aby bol hem relatívne vystavený rozpúšťadlu. Chýba však pohľad z anorganickej chémie na účinky kovalentnej väzby. Spektroskopické merania a výpočty na cytsc a modelových systémoch odhaľujú množstvo účinkov kovalentného pripojenia na elektrónovú štruktúru a reaktivitu hemu. Jedným z nich je, že prevládajúce nerovinné skreslenie zvlnenia pozorované v heme c znižuje potenciál redukcie hemu. Ďalším je, že kovalentné pripojenie ovplyvňuje interakciu hemového železa s proximálnym His ligandom. Ukázalo sa tiež, že hemové vlnenie ovplyvňuje elektronické spojenie s redoxnými partnermi, a teda aj rýchlosti prenosu elektrónov zmenou distribúcie orbitálnej diery na porfyríne v oxidovanom cyt c. Ďalším dôsledkom kovalentného pripojenia hemu je silná vibračná väzba pozorovaná medzi železom a povrchom proteínu, ako sa ukázalo v štúdiách nukleárnej rezonančnej vibračnej spektroskopie. Nakoniec sa navrhuje, že kovalentné pripojenie hemu je dôležitou vlastnosťou podporujúcou viaceré úlohy cyt c pri programovanej bunkovej smrti (apoptóze). Kovalentná väzba hemu je nielen životne dôležitá pre biologické funkcie cytc, ale poskytuje aj užitočnú rukoväť v mnohých aplikáciách. Jednak sa ukázalo, že inžinierstvo hemu c na exponovanú časť požadovaného proteínu poskytuje viditeľnú afinitnú purifikačnú značku. Okrem toho boli peptidy s kovalentne naviazaným hémom, známe ako mikroperoxidázy, študované ako modelové zlúčeniny a oxidačné katalyzátory a v poslednom čase aj v aplikáciách na premenu a skladovanie energie. Bohaté poznatky získané o heme c prostredníctvom základných štúdií cyts c tvoria základ pre budúce úsilie o inžinierstvo prírodných a umelých cytochrómov pre rôzne aplikácie.


Poruchy v dodávke energie

4.3.3 Neuroglobín a cytoglobín

Hémové proteíny viažuce dikyslík, ako je neuroglobín a cytoglobín, boli opísané aj v iných tkanivách. V porovnaní s hemoglobínom a myoglobínom sú tieto poznatky fragmentárne, keďže tieto proteíny boli objavené len nedávno na základe proteomickej analýzy [70–73].

Neuroglobín je exprimovaný v bunkách centrálneho a periférneho nervového systému, cerebrospinálnej tekutine, sietnici a endokrinných bunkách [70,73,74]. Tento monomérny hemový proteín reverzibilne viaže dikyslík s afinitou vyššou ako hemoglobín, ale nižšou ako myoglobín. Na rozdiel od hemoglobínu a myoglobínu má deoxygenovaný neuroglobín hexakoordinované hemové železo v redukovanej a oxidovanej forme. Pri väzbe dikyslík vytesňuje šiesty endogénny ligand.

Neuroglobín uľahčuje ako myoglobín difúziu dikyslíka do mitochondrií. Pomáha poskytovať rezervy dikyslíka neurónovým bunkám v hypoxicko-ischemických podmienkach [70,75,76]. Bolo navrhnuté pôsobenie neuroglobínu ako NADH oxidázy v podmienkach obmedzeného prísunu dikyslíka [73]. Ďalšou hypotetickou funkciou je účasť neuroglobínu na metabolizme NO [77].

Štvrtým ľudským hemovým proteínom zapojeným do väzby a skladovania dikyslíka je cytoglobín, ktorý je exprimovaný v širokom spektre tkanív [71]. Podobne ako neuroglobín je tento monomérny proteín charakterizovaný hexakoordinovaným hemovým železom v deoxygenovanej forme.

Podobné funkčné aktivity, ako sú opísané pre neuroglobín, sú tiež predmetom diskusie pre cytoglobín. Tento hemový proteín tiež vykazuje katalázovú aktivitu [78].


Anatómia nemožného hamburgera

Burger King sa chystá predávať Impossible Burger a McDonald&rsquos čoskoro bude nasledovať s vlastnou bezmäsitou karbonátkou. Tak som si myslel, že si pozriem brilantne značkový burger v patente aj na tanieri.

Variácia na tému Heme

Moje prvé stretnutie s Impossible Burgerom bolo, že som vo februári odtrhol kúsok z taniera môjho spoločníka na večeru. Vyzeralo to a zdalo sa, že krváca ako skutočný hamburger. Keď som žuval, vygooglil som si produkt v telefóne a zastavil som sa pri slove &ldquoheme.&rdquo

Prestal som žuť. Keď som sa dostal cez obraz hovädzieho svalu pulzujúceho na tanieri, predstavil som si atóm železa v jeho porfyrínovom kruhu, oba ležiace v okolitom globulárnom proteíne, trochu ako tootsie roll pop.

Hem v rôznych podobách sa nachádza vo všetkých druhoch, od baktérií cez fazuľu až po byvoly. Nachádza sa v srdci myoglobínu v našich svaloch a hemoglobínu v našej krvi, ktorý je najhustejšie zabalený do svalových buniek hovädzieho dobytka.

Proteíny, ktoré sú medzi rôznymi druhmi rovnaké alebo podobné, sa nazývajú „vysoko konzervované“. Evolúciou sa príliš nezmenili, pretože fungujú. Prirodzený výber odstraňuje mutácie, ktoré potláčajú schopnosť viazať kyslík, čo robí atóm železa v centre diania. Všetky hemy obsahujú železo, ale časti proteínového globínu sa medzi druhmi mierne líšia.

Trik pri vytváraní bezmäsitého burgeru, ktorý chutí a je mäsitý, je v nájdení organizmu, ktorého hem a proteíny prepožičiavajú to, čo sa opisuje ako pikantné, krvavé alebo len mäsité.

Skúšam rôzne značky vegetariánskych hamburgerov od doby, keď som pred 18 mesiacmi prestal s hovädzím mäsom po takmer simultánnej diagnóze rakoviny/výlete do Kostariky, na pozadí toho, ako nás naša dcéra nabádala, aby sme tak urobili už viac ako desať rokov (pozri Ako genetické Testovanie viedlo moju cestu proti rakovine prsníka k vyhýbaniu sa hovädziemu mäsu). Obrázky na obaloch zobrazujú lákavé kúsky sladkých zemiakov, čiernej fazule, hrášku a mrkvy, ktoré vykúkajú z placiek obsahujúcich všadeprítomný sójový proteín. Tieto produkty poskytujú príjemnú chuť alternatívy na hamburgery, ale nie sú celkom skutočné. Najbližšie je Impossible Burger.

52-stranový patent, udelený v roku 2017 po mnohých rokoch práce spoločnosti Impossible Foods z Redwood City, CA za „magický mix“, sa otvára dvojstĺpcovými stránkami patentov a citácií článkov.

Podstata patentu začína zoznamom, ktorý by mohol odzvoniť špecialistom v oblasti biológie alebo chémie: aminokyselinové sekvencie hemových proteínov z 25 druhov, vrátane najlepších kandidátov na ekvivalent mäsa stavovcov Impossible Burger. Medzi 25 uchádzačmi patrí hrach, baktérie, riasy, pôdne huby, kôň, dobytok, tabak, diviaky a paramecium.

Víťaz je na konci prvého patentového nároku: Mletý potravinársky výrobok podobný hovädziemu mäsu obsahujúci 0,1 % až 5 % hmotnosti proteínu obsahujúceho hem, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá má aspoň 80 % sekvenčnú identitu s polypeptidom uvedeným v SEQ ID N0:4.

SEQ ID č. 4 je Glycín max, alias sójové bôby.

Hemový proteín leghemoglobín (legHB) začervenal koreňové uzliny rastlín sóje. Poskytuje kyslík svojim symbiotickým baktériám, podobne ako hemoglobín prenáša kyslík v našej krvi a myoglobín v našich svaloch. Ale aj milióny akrov pokrytých sójovými bôbmi v USA nestačia na uspokojenie predpokladaného dopytu po legHB v hamburgeroch.

Technológia rekombinantnej DNA na záchranu

Zrejmý spôsob, ako zvýšiť produkciu špecifického proteínu, je použiť technológiu rekombinantnej DNA: vyrobiť sójový proteín v bunkách iného, ​​ľahšie využiteľného druhu.

Keď bola v sedemdesiatych rokoch vynájdená technológia rekombinantnej DNA, značka GMO bola ešte roky vzdialená. Čoskoro sa objavil vzorec, keď niektorí ľudia namietali proti poľnohospodárskym experimentom a dokonca ničili pokusné polia a jednu pozoruhodnú jahodovú náplasť, zatiaľ čo ľudia s cukrovkou začali používať inzulín vyrobený v baktériách, ako je napr. E. coli, ako to stále robia. Vždy to bolo rozbité pole, ale technológia rekombinantnej DNA tu zostane. Liekopis s láskavým dovolením technológie dnes zahŕňa faktory zrážanlivosti, enzýmové náhrady, lieky na srdce, cytokíny, povrchovo aktívne látky, hormóny a rastové faktory a mnoho ďalších.

Výskumníci z Impossible Foods prišili gén zo sójových bôbov, ktorý kóduje proteín legHB, do genómu iného organizmu, ktorý ho dokáže efektívnejšie (lacnejšie) pumpovať von: kvasiniek. Picchia pastoris. Kvasinka je jednobunková huba, ale na rozdiel od baktérie je to komplexná bunka.

Jediná veta v 52-stranovom patente vysvetľuje toto: "Proteíny obsahujúce hem môžu byť tiež produkované rekombinantne s použitím techník expresie polypeptidov". a môžu rásť v bunkách baktérií, hmyzu, húb, rastlín alebo cicavcov. &ldquoTiež&rdquo označuje extrakciu z prírodných zdrojov alebo syntézu v laboratóriu.

Obsahuje Impossible Burger GMO? No áno aj nie. Áno, pretože gén zo sójových bôbov by sa prirodzene nachádzal v kvasinkovej bunke. Ale nie, pretože legHB, ktorú kvasinkové bunky vylomia, je identická, aminokyselina po aminokyseline, s proteínom z koreňov sóje. Kvasinky sú teda geneticky modifikované, produkt nie.

Je to ocenenie s precedensom a hlavný vedecký pracovník spoločnosti Impossible Foods David Lipman to získal v tomto rozhovore pre rok 2018 Food Dive. Cituje schválenie prvého potravinového produktu s rekombinantnou DNA v roku 1990 FDA, rennínu (alias chymozínu), po tom, čo bol považovaný za "geneticky uznaný za bezpečný" alebo GRAS.

Rennin, používaný na zrážanie mlieka pri výrobe syra, je súčasťou zmesi tráviacich enzýmov získaných z teľacích čriev. Vchod do E. coli vzhľadom na kravský gén pre potrebný enzým je oveľa lacnejší. Predpisy môžu byť mätúce. V USA rekombinantný chymozín nemusí niesť označenie GMO, pretože proteín, ktorý ho tvorí vo výrobku, je identický s proteínom priamo z organizmu z prirodzeného zdroja.

Lipman v rozhovore opakovane používa slovo &ldquofermentácia&rdquo, ktoré vyvoláva ľudové predstavy sudov so sladkým vínom a starnúcich štipľavých syrov. „Rekombinantná DNA“ a „geneticky modifikovaná“ vyvolávajú rôzne reakcie, ako napríklad v tomto príspevku, ktorý vyzýva Impossible Burger na jeho GMO zložku. FDA však v januári 2019 považovala magickú zmes za GRAS, a preto burger nevyžaduje označenie GMO.

Hemový proteín je len jednou zložkou magickej zmesi.

Na výrobu burgeru sa pridávajú „molekuly prekurzorov aróm“. Patria sem kokosové a iné rastlinné oleje, zemiakový a textúrovaný pšeničný proteín, cukry, aminokyseliny (ako glutaman sodný), jeden vitamín a známe zlúčeniny ako kyselina mliečna a kreatín.

Tu&rsquo patentový žargón: zlúčenina vybraná z glukózy, ribózy, fruktózy, laktózy, xylózy, arabinózy, glukóza-6-fosfátu, maltózy a galaktózy a cysteínu, cystínu, selenocysteínu, tiamínu, metionínu a zmesí dvoch alebo viacerých z nich. Ale všetky potraviny sú v konečnom dôsledku chemikálie. Všetko je chemikália.

Vytvorenie Impossible Burger tiež analyzovalo prchavé látky, ktoré zmes uvoľňuje pri varení. &ldquoVyškolení ľudskí panelisti a ďalší ľudia, ktorí nasadili plynovú chromatografiu&ndashmass spektrometriu, štandardný analytický chemický test, analyzovali uvoľňovanie mäsových aróm pri varení, čím vytvorili "čuchové mapy." Cieľom bolo optimalizovať chuť, chuť, vôňu, textúru a všetko ostatné. - dôležitý &ldquoústnypocit&dquo produktu. Rovnako ako softvér, nové verzie budú pravidelne vychádzať.

Mäsová kaša je tiež tvárna, tvarovaná do umelých častí tela, ako sú krídla a steaky, extrudovaná ako klobásy, jemne rozdrvená v základoch polievky a duseného mäsa a ľahko premeniteľná na desiatu, kocky a prášky.

Impossible Burger dávam známku &ldquoA&rdquo za pocit v ústach a textúru, čo môže byť to isté. Ale dal by som len B-plus za chuť, chuť a vôňu, pretože ich nemal. Ale pridajte syr, vyprážanú cibuľku, kyslú uhorku a kopček Sweet Baby Ray&rsquos a skutočne to môže byť poriadna placka. Bos taurus mäso. Aspoň ten, ktorý mi chýbal, hlboká chuť hamburgera s 85 % tuku, ktorý vychádza priamo z grilu.

Na stupnici od 0 do 10, pričom 10 je hovädzí burger a 0 najhorší vegetariánsky burger, aký si možno predstaviť, väčšinu produktov hodnotím v rozmedzí od 4 do 6, pričom Impossible Burger predstavuje robustných 9.

Papier nabitý údajmi v PLOS One dospel k podobnému záveru: &ldquoTým, že spĺňa rovnaké chuťové, kulinárske a nutričné ​​funkcie ako tradičné hovädzie mäso, PBB (&ldquoplant-based burger) má za cieľ znížiť prekážku prijatia spojenú s konzumáciou rastlinných bielkovín namiesto živočíšnych produktov.&rdquo Dvaja zo štyroch autorov pracujú v Impossible Foods, ale aj tak si myslím, že majú pravdu. Tento produkt môže nahradiť hamburgery pre všežravcov a možno si získa aj niektorých vegetariánov.

Okrem osobných preferencií a chutí dosahuje Impossible Burger svoj stanovený cieľ: jeho výroba nezabije žiadne zvieratá. Získava tiež vysoké známky za šetrnosť k životnému prostrediu. Podľa príspevku na Rýchla spoločnosťuhlíková stopa Impossible Burger je o 89 % menšia ako u cowburgeru a spotrebuje o 87 % menej vody, 96 % menej pôdy a znižuje kontamináciu vody o 92 %. The PLOS One Článok analyzuje aj vplyv na životné prostredie.

Teším sa na Impossible Burger v akejkoľvek podobe, ktorý sa dostane na pulty supermarketov.


Hemoglobíny: Štruktúra a vlastnosti | Biochémia

V tomto článku budeme diskutovať o štruktúre a vlastnostiach hemoglobínov.

Štruktúra hemoglobínov:

Ako naznačuje ich názov, hemoglobíny pozostávajú z protetickej skupiny hemu (4%) a proteínovej časti: globínu (96%).

A. Heme:

Toto je protetická skupina spoločná pre rôzne hemoglobíny (zatiaľ čo globín sa v rôznych hemoglobínoch líši). Obsahuje jednu molekulu protoporfyrínu a jeden atóm železa.

Štyri pyrolové kruhy spojené metenylovými mostíkmi = CH — medzi ich atómami uhlíka α a α’ tvoria porfín (pozri obr. 1-27).

Musíme si všimnúť striedanie dvojitých väzieb, ktoré sú všetky konjugované.

Porfyríny sú jednoducho deriváty porfínu, kde 8 β a β’ atómy uhlíka sú nosičmi rôznych substituentov. Je jasné, že existujú možnosti izomérie, ktoré budeme študovať na príklade uroporfyrínov, kde atómy uhlíka 8β a β’ nesú 4 octové radikály (A) a 4 propiónové radikály (P), obrázok 1-28 ukazuje, že s 2 rôzne substituenty existujú 4 možné usporiadania medzi prírodnými pigmentmi, väčšinou typu III a niekedy typu I.

Protoporfyrín hemoglobínov je typu III, ako možno vidieť na obrázku 1-29, pochádza z uroporfyrínu III dekarboxyláciou 4 octových radikálov (na metylové skupiny) a dekarboxyláciou a následnou dehydrogenáciou dvoch zo štyroch propiónových radikálov (ktoré sa takto transformujú do vinylových skupín).

To je niektorými autormi označované protoporfyrín IX, pretože s 3 rôznymi substituentmi je v skutočnosti 15 možných izomérov (a nie 4) a porovnanie s rôznymi porfyrínmi získanými syntézou ukázalo identitu prírodného protoporfyrínu s typom IX syntetických izomérov. Protoporfyrín obsahuje 4 metylové skupiny v 1, 3, 5 a 8 2 propiónových radikáloch v 6 a 7 a 2 vinylové skupiny v 2 a 4.

b) Väzba železa a protoporfyrínu:

Porfyríny majú schopnosť viazať svojimi pyrolovými atómami dusíka kovy ako Fe, Mn, Ni, Co, Mg metaloporfyríny obsahujúce železnaté železo (Fe ++ ) v konkrétnom prípade protoporfyrínu nazývame hemy, feroporfyrín sa nazýva protohém (tzv. termín “heme” sa používa skratkou). Metaloporfyríny obsahujúce železité železo (Fe + ++ ) sa nazývajú hematíny (ten, ktorý zodpovedá protoporfyrínu, je protohematín).

V prototéme atóm železa nahrádza 2 atómy vodíka nesené dvoma zo štyroch atómov dusíka, ale je spojený so 4 atómami dusíka koordináciou. Okrem toho si Fe++ môže stále vymieňať 2 koordinačné väzby napríklad s dusíkovými bázami, čím vytvára hexakoordinovaný komplex (ako v ferokyanide). Tieto dve väzby sú kolmé na rovinu hemu.

c) Dôležité vlastnosti hemu:

Videli sme, že hém je železitá zlúčenina pôsobením oxidantov (ako sú napríklad alkalické ferrikyanidy), môže sa oxidovať na hematín (kde železo je železité), ktorý sa môže opäť redukovať na hém (napríklad hydrosiričitanom sodným). ).

Táto reverzibilná reakcia je základom účasti feroporfyrínov, podobne ako cytochrómov, na oxidačno-redukčných procesoch (neprebieha však pri premene hemoglobínu ⇋ oxyhemoglobínu).

Ako bude vidieť nižšie, hem sa môže spájať s globínom. Môže sa tiež spájať s inými dusíkatými bázami (pyridín, nikotíny) alebo s dusíkatými skupinami proteínov za vzniku homochromogénov.

Podobne sa hematín môže spájať s rôznymi proteínmi za vzniku parahematínov, ktoré majú často katalázové alebo peroxidázové vlastnosti.

B. Globin:

Toto je proteínová časť chromoproteínu, ktorú možno ľahko získať úpravou hemoglobínu acetónom obsahujúcim 5% HCl (globín sa vyzráža). Globín je špecifická časť hemoglobínu, ktorá sa mení podľa veku, druhu a pri určitých chorobách.

V myoglobínoch existuje jeden polypeptidový reťazec (kombinovaný s jedným hemom), ktorého primárna, sekundárna a terciárna štruktúra je známa, aspoň u určitých druhov (pozri obrázok 1-19). Molekulová hmotnosť je asi 17 000. Obsah histidínu je pomerne vysoký (6 až 10 %).

Krvné hemoglobíny sú tetraméry, ktoré obsahujú 4 polypeptidové reťazce (každý kombinovaný s jedným hemom) a ich molekulová hmotnosť je približne 68 000.

4 reťazce sú spojené väzbami, ktoré sa v prípade dospelého ľudského hemoglobínu (HbA) ľahko prerušia, získajú sa 2 typy reťazcov (α a β), ktoré sa kombinujú v pároch v pôvodnej molekule, čo je vyjadrené zápisom HbA = α2 A β2 A (A znamená “Dospelý”). α reťazec obsahuje 141 aminokyselín a β reťazec 146, sekvencie sú úplne známe.

Fetálny hemoglobín tiež obsahuje 4 reťazce, 2 α reťazce a 2 γ reťazce (posledné majú asi desať aminokyselín odlišných od aminokyselín prítomných v β reťazcoch). Môžeme písať HbF = α2 A γ2 F .

Patologické hemoglobíny sa líšia od HbA buď anomáliami v distribúcii reťazcov (existujú hemoglobíny so 4 β reťazcami alebo 4 γ reťazcami), alebo anomáliami v sekvencii α reťazca alebo β reťazca (napríklad v kosáčikovitej anémii anémia, kyselina glutámová normálne prítomná v polohe 6 β reťazca je nahradená valínom a práve tento rozdiel postačuje na zmenu fyziologických vlastností hemoglobínu).

C. Spojenie Hemu a Globinu:

V myoglobíne vorvaňa, ktorý bol dôkladne študovaný zo štrukturálneho hľadiska, je hém uložený v záhybe terciárnej štruktúry globínu (pozri obr. 1-19).

Vo všetkých týchto komplexoch feroporfyrín – proteín má atóm železa ok­tahedrickú štruktúru chemického typu d 2 sp 3 (dvojitá pyramída so štvorcovou základňou tvorenou 4 pyrolickými atómami dusíka).

5. koordinačná poloha železa je obsadená imidazolovým dusíkom N3 histidylového zvyšku v polohe 93 (F8 alebo 8. zvyšok helixu F v Perutzovej nomenklatúre). 6. koordinačná pozícia je voľná v neokysličenom alebo deoxy stave, ale je obsadená kyslíkom v okysličovanom alebo kyslíkovom stave (alebo uhlíkom oxidu uhoľnatého, kompetitívnym inhibítorom kyslíka).

V prípade α alebo β reťazcov hemoglobínu máme presne rovnaké Deoxy a Oxy štruktúry (obr. 1-30): železo je spojené s dusíkom N3 histidínu F8 nazývaného proximálna (pozícia 87 pre α a 92 pre β).

Ak je atóm železa oxidovaný do železitého stavu, jeho 6. koordinačnú polohu už nemôže zaujať molekula kyslíka, je obsadený atómom kyslíka molekuly vody, ktorej jeden protón je naviazaný vodíkovou väzbou na dusík N3 iného histidínu nazývaného distálny a ktorý zaujíma pozíciu E7 v Perutzovej nomenklatúre (7. zvyšok helixu E, príslušné polohy 64, 63 a 58 v myoglobíne, reťazec β a reťazec α).

Táto forma nazývaná metmyoglobín alebo methemoglobín je stabilný deoxy stav, v ktorom hexakoordinované trojmocné železo už nemôže hrať úlohu látky viažucej kyslík, na rozdiel od predchádzajúceho prípadu.

Pozorovalo sa, že v deoxy stave obsahuje vonkajšia elektrónová vrstva atómu železnatého železa 16 elektrónov, z ktorých 2 sú nepárové. Feroporfyrín-proteínový komplex je potom paramagnetický. V Oxy stave je táto vonkajšia vrstva nasýtená 18 elektrónmi, ktoré sú všetky spárované, a preto je komplex diamagnetický.

Vo forme metmyoglobínu alebo methemoglobínu má vonkajšia vrstva 17 elektrónov, z ktorých 1 je nepárový a komplex je paramagnetický. Táto forma môže byť stabilizovaná kyanidovým iónom CN –, ktorý privedie 3 elektróny k železitému iónu, ktorého vonkajšia vrstva je nasýtená 18 elektrónmi. Potom získame diamagneticky stabilnú formu Oxy, kde kyslík nemôže vytlačiť ión CN –.

Okrem tejto primárnej väzby medzi Fe a N3 proximálneho histidínu, dve soľné väzby (medzi 2 propionylovými radikálmi hemu a 2 základnými skupinami lyzínu alebo arginínu) a väzby Van der Waalsovho typu (medzi hydrofóbnymi skupinami hemu a globínu) udržujú stabilita konštrukcie.

Treba poznamenať, že ak máme nedenaturovaný globín, je možné in vitro pôsobiť kombináciou hemu + globínu, čím získame hemoglobín s vlastnosťami chromoproteínu, ktorý bol použitý na izoláciu globínu (bez ohľadu na pôvod globínu). heme). Naopak, kombinácia hemu s rôznymi globínmi produkuje chromoproteíny, ktoré sa líšia podľa pôvodu použitého globínu.

Vlastnosti hemoglobínov:

Keď odstredíme čerstvú krv alebo krv, ktorá sa nezráža, červené krvinky sedimentujú. Ich spätné privedenie do suspenzie v hypotonickom médiu (napríklad destilovaná voda) stačí na to, aby praskli (hemolýza) a po odstránení bunkového odpadu odstredením získame červeno sfarbený roztok.

Roztok je tmavočervený pre hemoglobín a jasne červený pre oxyhemoglobín (kvôli rozdielom v absorpčnom spektre) existuje teda oxidovaná forma hemoglobínu, ktorej fyziologická úloha – ako už bolo spomenuté v úvode – je transportovať kyslík po vytvorení s týmto plynom ľahko rozložiteľná kombinácia. Teraz preskúmame najdôležitejšiu vlastnosť hemoglobínov, a to ich schopnosť reverzibilne viazať určité plyny, najmä kyslík.

A. Kombinácie hemoglobínov s plynmi:

a) Kombinácia s kyslíkom:

Pre všetky hemoglobíny je maximálne množstvo kyslíka, ktorý sa môže viazať, funkciou množstva železa: jeden atóm-gram železa sa spája s jednou molekulou-gramom kyslíka (alebo jednou molekulou-gramom oxidu uhoľnatého).

Keďže na molekulu hemoglobínu pripadajú 4 hemy (t.j. 4 atómy železa), môžeme písať:

(ale veľmi často je oxyhemoglobín reprezentovaný HbO2). Ide o okysličenie a nie o oxidáciu, pretože železo zostáva v železitom stave, 17 000 g Hb (zodpovedá monoméru, ktorý obsahuje 1 atóm železa) sa teda môže spojiť s 32 g O2 a keďže 1 mol kyslíka zaberá 22,4 1, možno odvodiť, že 1 g Hb môže viazať 1,34 ml O2. Ale 100 ml krvi obsahuje v priemere 15 gHb, takže dokáže naviazať 1,34 x 15, t.j. asi 20 ml O2 to predstavuje úplnú saturáciu v O2.

Rovnica okysličovacej reakcie ukazuje, že tlak kyslíka je dôležitým faktorom riadiacim túto rovnováhu. Vo vzduchu, ktorý dýchame, kde je stredný tlak 760 mm Hg a koncentrácia kyslíka asi 20 %, je parciálny tlak kyslíka 760/5, t.j. asi 150 mm.

V arteriálnej krvi je tlak kyslíka asi 80 mm, takže (pozri obr. 1-31) 19 ml O2 môže byť viazaný na 100 ml krvi (95% saturácia). V kapilárach parciálny tlak kyslíka klesá na 40 mm alebo dokonca 20 mm, preto O2 fixácia môže byť len 77 % a 40 % saturácie.

Obrázok 1-31 ukazuje, že táto fáza zodpovedá časti krivky, kde pomerne malý pokles tlaku kyslíka spôsobí pomerne veľké uvoľnenie kyslíka, keď tlak klesne zo 40 na 20 mm, množstvo kyslíka, ktoré môže byť prítomné v krvi, klesá od 20 x 77/100 tj 15,4 ml O2/100 ml až 20 x 40/100, t.j. 8 ml O2/100 ml, inými slovami sa uvoľní 7,4 ml O2/100 ml krvi v prospech tkanív.

Na obrázku 1-31 je vidieť, že saturačná krivka myoglobínu je vetvou hyperboly, zatiaľ čo krivka hemoglobínu je sigmoidálna (tvar S). Tento rozdiel je spôsobený skutočnosťou, že hemoglobín je tetramér, ktorého 4 hemy nie sú nezávislé, pretože okysličenie jedného z nich uprednostňuje okysličovanie iných (ktoré teda vyžadujú menej energie).

Táto interakcia neprebieha priamo, pretože hemy sú od seba príliš vzdialené (asi 30 Á), prebieha cez kvartérnu štruktúru hemoglobínu, aby sa dosiahol kooperatívny efekt medzi hemami, kvartérna štruktúra musí byť neporušená a patologický hemoglobín ( anomáliou distribúcie reťazcov) alebo sa denaturovaný hemoglobín správa ako myoglobín, röntgenové štúdie v skutočnosti ukázali – počas transformácie [Hb]4 → [HbO2]4 alebo inverzne - zmena konformácie molekuly, nazývaná alosterický prechod, ku ktorej dochádza iba s hemoglobínom, ktorého kvartérna štruktúra je natívna.

Toto je príklad vzťahu medzi kvartérnou štruktúrou a biologickou aktivitou, na ďalšie takéto prípady narazíme pri štúdiu enzýmov a uvidíme, že prítomnosť al­losterických enzýmov zabezpečuje reguláciu bunkového metabolizmu.

Nakoniec treba poznamenať, že oxyhemoglobín má v dôsledku zmien konfor­mácie väčší počet disociovaných kyslých skupín.

Preto koncentrácia iónov H + má tiež vplyv na rovnováhu, ktorá môže byť napísaná:

V tkanivách dochádza k produkcii CO2 čo povedie k zvýšeniu koncentrácie H+ a prispeje k uvoľneniu kyslíka. V kapilárach je teda toto uvoľnenie spôsobené najmä poklesom O2 tlaku, ale aj zvýšením CO2 tlak-, obrázok 1-31 ukazuje, že pre daný O2 tlaku, množstvo kyslíka, ktoré sa môže spojiť, je menšie, keď CO2 tlak je vyšší (krivka č. 3).

Naopak, v pľúcach O2 tlak je vysoký a CO2 tlak klesá (pretože CO2 sa eliminuje) a to znižuje kyslosť. Tieto dva faktory – najmä prvý – podporujú tvorbu oxyhemoglobínu.

b) Kombinácia s oxidom uhoľnatým:

To je veľmi podobné kombinácii s kyslíkom, kde sa viaže jedna molekula-gram CO na atóm-gram železa, ale stabilita kombinácie (Hb-CO)4 nazývaný karbonylhemoglobín (alebo karboxyhemoglobín) je asi 200-krát väčší, disocia­tácia je veľmi ťažká, čo vysvetľuje toxicitu plynu a skutočnosť, že pri liečbe intoxikácie oxidom uhoľnatým sú potrebné vysoké koncentrácie kyslíka (oxygenoterapia).

c) Kombinácia s inými plynmi:

Oxid uhličitý sa môže kombinovať s hemoglobínom za vzniku karbhemoglobínu, ale hem nehrá žiadnu úlohu, pretože CO2 viaže sa na základné skupiny globínu, viaže sa aj na ostatné bielkoviny (treba si však uvedomiť, že hemoglobín predstavuje asi 75 % celkových krvných bielkovín).

Približne jedna štvrtina CO2 prenášané krvou cestuje vo forme karbaminoproteínov:

Tu by malo byť zaujímavé preskúmať, ako vo všeobecnosti CO2 sa transportuje z tkanív, kde sa tvorí, do pľúc, kde sa vylučuje. Tento transport musí na jednej strane zabrániť progresívnemu okysľovaniu krvi pri prietoku cez tkanivá uvoľňujúce CO2a na druhej strane tvorba CO2 bubliny, pretože rozpustnosť tohto plynu je pomerne obmedzená.

Tieto ťažkosti sú prekonané tlmivou kapacitou krvných proteínov, ktoré môžu viazať ióny H +, ako už bolo spomenuté, a teda viac H2CO3 môže byť ionizovaný a teda viac CO2 možno rozpustiť (pozri obr. 1-32). Naopak, keď sa krv dostane do pľúc, CO2 sa uvoľní a reakcie na obrázku 1-32 prebiehajú v opačnom smere, proteíny sú opäť pripravené viazať ióny H+.

Je potrebné poznamenať, že systém H2 CO3 ↔ HCO3 – je vyrovnávacím systémom a že je z veľkej časti zodpovedný (spolu so systémom H2PO4 – ↔ HPO4 = ) na ochranu krvi pred prebytkom kyseliny alebo zásady.

B. Reverzibilná oxidácia hemoglobínu a oxyhemoglobínu:

Hemoglobín upravený miernym oxidačným činidlom, ako je ferrikyanid draselný, sa oxiduje na methemoglobín. Železo sa mení zo stavu Fe ++ na stav Fe + + +, takže hem sa oxiduje na hematín, pričom táto oxidácia je sprevádzaná modifikáciou absorpčného spektra a stratou vlastnosti protetickej skupiny spájať sa s O2 alebo CO.

Ak je oxyhemoglobín alebo karboxyhemoglobín podrobený tejto oxidácii, pozorujeme tiež tvorbu methemoglobínu sprevádzanú uvoľňovaním spojeného plynu, čo mimochodom umožňuje titráciu plynu kombinovaného s hemoglobínom.

Tvorba met hemoglobínu in vivo, buď v dôsledku závažnej intoxikácie alebo po metabolickom ochorení, má vážne následky, pretože je znemožnený transport kyslíka. Avšak methemoglobín môže byť opäť redukovaný na hemoglobín in vitro ako aj in vivo v normálnych červených krvinkách pôsobením redukčných činidiel. Tieto vzájomné konverzie možno zhrnúť do diagramu (pozri obr. 1-33).


Globíny a iné proteíny reaktívne s oxidom dusnatým, časť A

Alessandra Pesce, . Martino Bolognesi, v Metódy v enzymológii, 2008

2 ZÁKLAD 2/2 HEMOGLOBÍNU

Kryštálové štruktúry skupiny I, skupiny II a skupiny III 2/2Hbs ukazujú, že ich sklad je založený na podskupine klasického globínového skladu (tzv. 3‐on‐3 α‐helikálny sendvič), typický pre myoglobín vorvaňa (Mb) (Holm a Sander, 1993 Perutz, 1979). V skutočnosti 2/2Hbs hosťujú hem v hre 2 na 2 α‐helikálny sendvič (2/2-násobný) založený na štyroch α‐závitnice, zodpovedajúce B‐, E‐, G‐ a H‐závitniciam klasického globínového záhybu ( Milani a kol., 2003 Nardini a kol., 2007 Pesce a kol., 2000 Vinogradov a kol., 2006). Dvojice antiparalelných špirál (B/E a G/H) sú usporiadané ako α‐helikálny zväzok, ktorý obklopuje a chráni hemovú skupinu pred rozpúšťadlovou fázou (obr. 17.1A). Ukázalo sa, že delécie, inzercie a náhrady rezíduí v porovnaní s klasickými globínovými sekvenciami stavovcov sú distribuované v celom 2/2Hb reťazci. Najvýraznejšie rozdiely medzi 2/2Hb a globínovými záhybmi s plnou dĺžkou sú drasticky skrátené (alebo chýbajúce) A‐helix, absencia D‐helixu a dlhý polypeptidový segment (pre‐F) v rozšírenej konformácii. veľmi krátkou F‐závitnicou, ktorá podporuje hemový proximálny zvyšok HisF8, čo umožňuje koordináciu hemového železa. Lokálne štrukturálne variácie v 2/2Hb záhybe sú zrejmé v každej z troch evolučných skupín ( Milani a kol., 2003 Nardini a kol., 2006, 2007 Pesce a kol., 2000 ).

Obrázok 17.1. Panel A: Stereo pohľad na 2/2Hb záhyb, zobrazujúci štyri hlavné helixy vytvárajúce proteínové lešenie a hemovú skupinu. Označenia identifikujú B, E, G a H helixy a proteínové konce. Panel B: Stereofónny pohľad na Ce‐2/2HbN zobrazujúci tunel proteínovej matrice, zobrazený ako mriežka hustoty medzier poskytovaná službou SURFNET. Okrem toho sú štyri atómy Xe identifikované pomocou opísaných kryštalografických analýz znázornené ako gule s polomerom úmerným ich obsadeniu v kryštálovej štruktúre ( Milani a kol., 2004). Obrázok nakreslený programom MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).


Výsledky a diskusia

Neredundantný súbor údajov o proteínoch viažucich hem

Existuje 1998 a 113 záznamov PDB obsahujúcich ligand HEM (typ hemu-b) a HEC (typ hemu-c), respektíve s rozlíšením 3Å alebo lepším k 24. novembru 2009 [18]. Z týchto položiek 10 (1BE3, 1BGY, 1FGJ, 1GWS, 1PP9, 1PPJ, 1S56, 1S61, 2A06 a 3H1J) obsahuje oba typy hemu b a c. In toto 4272 protein chains were identified as heme interacting protein chains as described in Methods. A non-redundant dataset of 125 protein chains (114 heme-b and 11 heme-c, Additional file 1, Table S1) were generated using PISCES with a sequence identity cutoff of 25%[43]. Eighty-two percent of these protein chains contain only one heme molecule while the number of heme molecules in the remaining protein chains ranges from 2 to 8 (Additional file 1, Table S1). Two examples of multi-heme protein chains, 1FS7A with 5 type b and 3F29A with 8 type c heme molecules, are shown in (Figure 2A & 2B).

Examples of three-dimensional structure of multi-heme proteins and identification of heme-binding environment. (A) Cytochrome c nitrite reductase of Wolinella succinogenes (PDB chain: 1FS7A) with 5 heme b molecules (B) Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome c nitrite reductase (PDB chain: 3F29A) with 8 heme c molecules (C) globin domain of globin-coupled sensor in Geobacter sulfurreducens (PDB chain: 2W31A). The red sticks are axial ligands of the heme iron and the blue sticks represent other heme interacting residues. For better visualization, the neighboring heme residues in A and B are colored yellow and green respectively. The heme molecules are shown as spacefill. The images were generated using Pymol http://www.pymol.org.

The dataset of heme binding proteins includes a wide variety of protein folds. A total of 86 protein chains (

69% of the dataset) have SCOP annotations (based on release 1.75 and Pre-SCOP) and belong to 31 distinct structural folds in all four major classes (Table 1) [42]. The dataset is dominated by proteins in the all-α class, making up 64% (55 of 86) of the total. The top 4 folds, Globin-like (a.1), Cytochrome P450 (a.104), Cytochrome c (a.3), and Multi-heme cytochromes (a.138) represent the well-known heme binding proteins that have been investigated extensively (Table 1).

Structural environment of the heme binding pockets

To investigate the structural environment of heme binding pockets, we identified both residues that make coordinate bonds with the heme iron and the ones that interact with the heme porphyrin structure (Figure 2C and Methods). Out of the 125 heme binding protein chains, only 2PBJA and 3HCNA do not have residues identified as axial ligands to heme iron though both have extensive interactions with heme instead other small molecules, such as glutathione (GSH) in 2PBJA (microsomal prostaglandin E synthase)[57] and imidazole (IMD) in 3HCNA (human ferrochelatase) [58] form coordinate bonds with heme iron. Five different amino acids (H, M, C, Y, K) are found to serve as axial ligands to the heme iron with histidine as the dominant residue (

80%) in both heme b and heme c types (Figure 3). Heme b utilizes more cysteine residues while heme c has slightly more methionine residues as axial ligands. It should be pointed out that there are only 41 residues as heme c ligands. Therefore the percentages of non-histidine ligands may have a relatively large change with a slight increase or decrease of ligand numbers due to the small dataset.

Distribution of the axial ligands for heme b (HEM) and heme c (HEC).

The conserved interactions between protein residues and heme were previously studied by calculating either the frequencies of residues that are in van der Waals contact with heme for each fold class of b-type heme proteins [27] or by calculating the mean number per binding site [41]. Smith a kol also applied normalized amino acid profiles to assess the composition and conservation of heme binding sites [41]. Here we explored the residue preferences in the heme binding pockets through calculating the relative frequencies of heme binding residues in our non-redundant dataset. The relative frequency of each amino acid is normalized to its background frequency.

Normally, the background frequencies used for comparisons are calculated from a non-redundant protein dataset. However, due to the dominant presence of all-α folds, it is not clear whether the residue distribution in heme proteins is different from that in other proteins. Therefore we first compared the residue distributions between non-redundant heme proteins and non-redundant all proteins. To avoid issues with missing residues and cloning artifacts (His-tags etc.) associated with PDB sequences, we used native full-length protein sequences to calculate residue compositions by mapping the PDB chains to Uniprot entries with PDBSWS [46]. The relative residue frequencies between heme proteins and all proteins show that heme proteins tend to contain more alanine, phenylalanine, histidine, methionine, and tryptophan residues and fewer cysteine, aspartic acid, isoleucine, lysine, asparagine, and serine residues (Additional file 2, Figure S1). Statistical analysis (χ 2 ) revealed a significant difference between these two frequency profiles (data not shown). In order to have a meaningful description of the enrichment or deficiency of residues in the heme interacting environment, we used the background frequencies from the non-redundant set of heme proteins as references.

The top five residues with high relative frequencies are cysteine (C), histidine (H), phenylalanine (F), methionine (M), and tyrosine (Y) (Figure 4A). Because four of the top five (C, H, M, and Y) can serve as axial ligands to heme iron (Figure 3), we removed axial ligands from the dataset and recalculated the relative frequencies. Figure 4B shows that the level of histidine decreases to the background level, suggesting the enrichment of histidine is essentially due to the large number of heme histidine ligands. The other four residues, on the other hand, have almost the same relative frequencies with or without ligand residues (Figure 4B). In heme c proteins, the occurrence of cysteine residues is extremely high with an eight fold enrichment compared to the background distribution. This is not surprising as the classic CXXCH binding motif, in which the histidine serve as ligand and the cysteine residues form covalent thioether bonds with the heme vinyl groups, has dominant presence in heme c proteins[28].

Relative frequency of the heme interacting amino acids. (A) Relative frequency of residues in heme b (HEM), heme c (HEC), and heme b a c (ALL) (B) the relative frequency of the 5 residues with or without them as axial heme ligands.

Consistent with earlier reports, the aromatic residues (phenylalanine, tyrosine, and tryptophan) play important roles in protein-heme interactions through stacking interactions with the porphyrin[27, 41]. One exception is tryptophan in heme c proteins, which showed a similar level of occurrences compared to the background (Figure 4A). Leucine, isoleucine, and valine, which make hydrophobic interactions with the heme ring structure, are slightly increased over the background frequencies. The residues with the fewest occurrences, aspartic acid, glutamic acid, and lysine are charged residues, suggesting the heme binding pocket is mainly a hydrophobic environment. In contrast, arginine, a positively charged residue that has been considered a major player in anchoring the heme propionates, has a much higher occurrence than other charged amino acids and shows a similar (HEM) or slightly higher (HEC) level of frequency to the background (Figure 4A) [27].

The secondary structure types for heme interacting residues are shown in Figure 5. There are more helical and less coil types in proteins with heme b no matter what dataset (heme proteins or all proteins) is used as a reference. Therefore the difference is not due to the large number of all-α proteins in the dataset. As for heme interacting residues in heme c, they have similar distribution to the background (Figure 5). Based on our 3-category classification of relative solvent accessibility [49], the heme interacting residues are less likely to be exposed. The buried residues are comparable to the background distribution. About 20% increase is observed in the intermediate category (Additional file 2, Figure S2).

Frequencies of secondary structure types for heme interacting residues.

Heme binding sequence motifs

To investigate possible sequence motifs involved in heme binding, the flanking sequences with four residues on each side of heme axial ligands were collected and aligned. The non-redundant dataset has 34 heme c ligands, 32 of which have histidine as axial ligands. The alignment of these sequences shows the classic CXXCH heme c binding motif [4, 28] (Figure 6A).

Sequence motifs surrounding the axial ligands. (A) Sequence logo from 32 heme c proteins with histidine as axial ligand shows the classic CXXCH heme c binding motif (B) Sequence logo from 18 heme b proteins with cysteine as axial ligand. The sequence logos were created with WebLogo [74] (C) Arginine-334 (red sticks) of 1N97A interacts with heme propionates (red spheres) and (D) Interactions between histidine-353 (red sticks) of 1GWIA and heme propionate groups (red spheres).

Another motif worthy of note, G X[HR]XC[PLAV]G, comes from the heme b proteins with cysteine as axial ligands (Figure 6B). The motif represents the classic CYP signature heme binding motif FXXGXXCXG in bacteria, plant, and mammalian cytochrome P450 s [59–61]. At the -4 and +2 positions (with ligand cysteine as reference position) are small amino acids (glycine) while the -2 position prefers a positively charged amino acid such as histidine or arginine. These positively charged residues interact electronically with the negatively charged heme propionates (Figure 6C and 6D). The small glycine residue at the -4 position may provide the flexibility needed for positioning the positively charged residues close to heme propionate groups. The +1 position is dominated by proline and hydrophobic amino acids, leucine, alanine, valine and isoleucine. Six of the eighteen cases have proline right after the axial ligand cysteine, reminiscent of the dipeptide CP motif being implicated in heme sensing and regulation [31–35, 62]. While the importance of CP motif has been studied through deletion or site-directed mutation experiments in several important proteins, including transcription repressor Bach1[63], iron regulatory protein 2 (IRP2) [31], circadian factor period 2 (Per2) [34] and δ-aminolevulinic acid synthase (ALAS) [33], the possible role of the CP motif in heme interaction from a structural point of view remains unclear as the structures for most of these proteins with such CP motifs are unknown.

All the six CP dipeptides that have direct physical interactions with heme exhibit similar structural roles with the cysteines serving as ligands to the heme iron and the proline residue introducing a bend for the downstream structures, mainly α-helices, to steer them away from the heme face (Figure 7B and 7C). A seventh protein chain, 2PBJA, contains a CP where the proline shows highly similar structural implication, whereas the cysteine residue interacts with heme but not as a ligand. Instead, the presence of a glutathione molecule (GSH), which forms a coordination bond with the heme iron, seems to push the cysteine slightly away from the axial ligand position (5.25 Å from heme iron) [57]. Considering the conformation in the proline-bend structure and the small distance between cysteine and heme iron, it is likely that the cysteine could serve as a heme ligand if GSH is not present in the structure. Interestingly, a closer examination of the structural conformation downstream of the proline residue in 2CIWA (cloroperoxidase), 3CQVA (Rev-erb), and 2PBJA (microsomal prostaglandin E synthase), which have the CP heme motifs with conserved proline, indicates nearly perpendicular orientation to the heme plane (Figure 7A, 7B and 7D). In contrast, in the P450 family where the proline residue is less conserved, with leucine, isoleucine, and methionine also found at the position of proline as shown in the motif logo (Figure 6B), the α-helices following the proline residue are in parallel with the heme plane (Figure 7C). The difference suggests a different structural role for the proline in conserved CP dipeptides from that in the less-conserved CP dipeptides, more specifically at the proline position.

Three-dimensional structures of heme proteins with "CP" motifs. (A) 3CQVA (B) 2CIWA (C) 1GIWA and (D) 2PBJA. The CP dipeptides are shown as red sticks. The immediate downstream structures of the CP dipeptides are shown in blue.

CP dipeptides have also been implicated in indirect interaction with heme. Ragsdale and colleagues reported a novel role for CP motifs in heme oxygenase 2 (HMOX-2) as a thiol/disulfide redox switch that localizes outside the heme-binding pocket [62, 64, 65], therefore regulating heme-protein interaction via sensing redox status in the environment. There are a total of twenty-nine CP dipeptides in our dataset. Less than a quarter of them (in 7 protein chains including 2PBJA) show physical interactions with heme molecules. It would be impractical at this point to predict the functional role of the remaining CP dipeptides in heme-protein interaction, mainly due to the limited sample size and the lack of structural details on heme pocket-CP interaction. Here we made use of statistical analysis to indirectly assess the functional relevance of CP dipeptides in heme interaction. The rationale behind the assay is that, if CP dipeptides are important heme signatures for heme interaction, the expected occurrences of CP dipeptides in hemoproteins should be higher compared to control population. We found no statistically significant difference between the presence of CP dipeptides in heme proteins and non-heme proteins (data not shown), suggesting other yet to be identified factors may exist to help determine the role CP dipeptides play in heme binding [31]. It should be noted that we do not exclude the possibility that in the control sample there exist unknown hemoproteins however for them to significantly affect the frequency of CP signals there would have to be a considerably large fraction of the control proteins being analyzed to be heme-interacting, which we anticipate as less likely.

Structure comparison between apo and holo heme proteins

An interesting question related to structure-based heme binding protein design and prediction is the degree of global conformational transition and the local changes of the heme-binding pocket upon heme binding. We collected 446 heme protein chains (after removing heme protein chains with at least 90% sequence identity) and compared their sequences with the protein chains without heme or heme-like ligands (Additional file 1, Table S2). One hundred seventy-nine heme protein chains are found to have apo structures with high sequence similarity and coverage. After removing redundant apo/holo pairs with a 25% sequence identity cutoff and proteins with non-heme or non-heme-like ligands occupying the heme binding pocket, the final dataset consists of 10 apo-holo protein pairs. Table 2 shows that 9 out of 10 proteins undergo very small global conformational changes after heme binding with RMSDs of 1.03Å or less. For example the 2ZDOA-1XBWD pair (iron-regulated surface determinant IsdG from Staphylococcus aureus) has an RMSD of 0.59 Å. In the absence of heme, the protein assumes the same conformation as the holo protein with heme (Figure 8A, B). Even the side chain positions of the histidine ligand are similar. The one with relatively large conformational changes is Rev-erb (3CQVA-2V7CA). Without heme the C-terminal helix (residues 568-576) moves towards the heme pocket with His568 (heme-binding ligand) facing away from the binding pocket (Figure 8C, D) [66].

Structural comparison of apo-holo heme protein pairs. (A,B) 2ZDOA-1XBWD (C,D) 3CQVA-2V7CA.

Three of the ten heme proteins in Table 2 have multiple known apo structures. 1KBIA (flavin-binding domain of Baker's yeast flavocytochrome b2), 1N45A (human heme oxygenase-1), and 1N5UA (human serum albumin) have 9, 3, and 28 apo structures respectively (with at least 99% sequence identity, Additional file 1, Table S3). Because proteins are inherently dynamic and conformational selection has been considered as a major mechanism for biomolecular recognition [67–69], we checked the conformational differences between each of the apo structures and the holo structures. Figure 9A shows the RMSD (Cα atoms of aligned residues) values of the apo-holo structural differences. The RMSDs are generally less than 1Å for 1KBIA and 1N45A. On the contrary, apo structures of 1N5UA form two clusters. Members of one cluster with 12 apo structures have RMSDs around 0.8Å while the other contains 15 apo structures with RMSDs ranging from 4 to 5Å. Through manual inspection, we found that the differences are caused by the numbers of non-heme ligands in structures. In addition to heme, 1N5UA also has 5 myristic acid (MYR) molecules (Figure 9B). The apo structures with higher RMSDs either do not have ligands (Figure 9C) or have only one or two non-MYR ligands. For example, 1E7AA and 2BX8B have 2 PFL and 1 AZQ respectively. On the other hand, apo structures with MYR ligands in similar positions as those in 1N5UA generally have smaller RMSDs (Figure 9D). Therefore, under similar environment, there are relatively small structural differences between holo and apo heme protein structures.

Examples of heme proteins with multiple apo structures. (A) RMSD distribution of apo structure of three heme protein chains, 1KBIA, 1N45A, and 1N5UA. The 28 apo structures of 1N5UA form two clusters (red ovals). (B) Structure of 1N5UA with one heme and five myristic acid molecules (MYR, red spacefill). (C) Structure of 1AO6A with no ligands. (D) Structure of 3CX9A with five myristic acid molecules (MYR, red spacefill) and one LPX ligand (orange spacefill).

It should be noted that the above comparisons are based on heme proteins that have stable apo structures solved through X-ray crystallography. For some proteins, as in the case of hemoglobin, the absence of ligand(s) can increase the flexibility and cause partial unfolding of the protein structure, making it difficult for structure determination [70, 71]. Furthermore, intrinsically disordered or unstructured regions are considered to be responsible for many important cellular functions such as ligand binding [72, 73]. However the existence of such flexible apo structures would not interfere with our goal in structure-based heme protein prediction as we aim to take the existing apo structures in PDB as inputs [18].

Other features useful for comparing apo-holo heme proteins are the pocket size and shape. Due to different heme binding modes (partially exposed or fully embedded, Additional file 2 Figure S3) and the difficulty in identifying the exact heme binding pocket from existing automatic programs, the sizes of heme binding pockets vary from small (

400 Å 3 ) to very large (over 2000 Å 3 ) (Table 2). In addition, the changes in absolute pocket volumes after heme binding are variable. Small changes are seen in 2ITFA-2ITEB, 2R7AA-2RG7 D, and 2ZDOA-1XBWD. Other pairs exhibited significant changes in volume despite the minimal conformational change (Table 2). To take the shape into consideration we calculated the Rvs value (the ratio of pocket volume over the pocket surface area) of each pocket. Most of the apo or holo proteins have Rvs values around 1.4. To further investigate whether the binding pocket can be used as one of the characteristics for heme protein prediction, we compared the Rvs distributions between heme binding pockets and pockets in non-heme proteins (proteins that don't have heme ligand(s) and are not homologous to heme proteins) with similar sizes ranging from 350 to 2000Å 3 . The Rvs of heme binding pockets has a narrow distribution whereas the Rvs from similar pocket sizes of non-heme proteins has a wide spread with a long right tail (Additional file 2, Figure S4-A). We also investigated the distribution of Rvs normalized to a sphere shape as introduced by Sonavane and Chakrabarti [56]. A similar trend was found (Additional file 2, Figure S4-B). It should be pointed out that, even though unknown heme proteins may be included in the non-heme dataset, many non-heme proteins share similar pocket characteristics.


Obsah

Cytochromes were initially described in 1884 by MacMunn as respiratory pigments (myohematin or histohematin). [4] In the 1920s, Keilin rediscovered these respiratory pigments and named them the cytochromes, or “cellular pigments”. [5] He classified these heme proteins on the basis of the position of their lowest energy absorption band in their reduced state, as cytochromes a (605 nm), b (≈565 nm), and c (550 nm). The ultra-violet (UV) to visible spectroscopic signatures of hemes are still used to identify heme type from the reduced bis-pyridine-ligated state, i.e., the pyridine hemochrome method. Within each class, cytochrome a, b, alebo c, early cytochromes are numbered consecutively, e.g. cyt c, cyt c1, and cyt c2, with more recent examples designated by their reduced state R-band maximum, e.g. cyt c559. [6]

The heme group is a highly conjugated ring system (which allows its electrons to be very mobile) surrounding an iron ion. The iron in cytochromes usually exists in a ferrous (Fe 2+ ) and a ferric (Fe 3+ ) state with a ferroxo (Fe 4+ ) state found in catalytic intermediates. [1] Cytochromes are, thus, capable of performing electron transfer reactions and catalysis by reduction or oxidation of their heme iron. The cellular location of cytochromes depends on their function. They can be found as globular proteins and membrane proteins.

In the process of oxidative phosphorylation, a globular cytochrome cc protein is involved in the electron transfer from the membrane-bound complex III to complex IV. Complex III itself is composed of several subunits, one of which is a b-type cytochrome while another one is a c-type cytochrome. Both domains are involved in electron transfer within the complex. Complex IV contains a cytochrome a/a3-domain that transfers electrons and catalyzes the reaction of oxygen to water. Photosystem II, the first protein complex in the light-dependent reactions of oxygenic photosynthesis, contains a cytochrome b subunit. Cyclooxygenase 2, an enzyme involved in inflammation, is a cytochrome b protein.

In the early 1960s, a linear evolution of cytochromes was suggested by Emanuel Margoliash [7] that led to the molecular clock hypothesis. The apparently constant evolution rate of cytochromes can be a helpful tool in trying to determine when various organisms may have diverged from a common ancestor. [8]

Several kinds of cytochrome exist and can be distinguished by spectroscopy, exact structure of the heme group, inhibitor sensitivity, and reduction potential. [9]

Four types of cytochromes are distinguished by their prosthetic groups:

Typ Prosthetic group
Cytochrome a heme A
Cytochróm b heme B
Cytochróm c heme C (covalently bound heme b) [10]
Cytochrome d heme D (Heme B with γ-spirolactone) [11]

There is no "cytochrome e," but cytochrome f, found in the cytochrome b6f complex of plants is a c-type cytochrome. [12]

In mitochondria and chloroplasts, these cytochromes are often combined in electron transport and related metabolic pathways: [13]

Cytochrómy Combination
a a a3 Cytochrome c oxidase ("Complex IV") with electrons delivered to complex by soluble cytochrome c (hence the name)
b a c1 Coenzyme Q - cytochrome c reductase ("Complex III")
b6 a f Plastoquinol—plastocyanin reductase

A distinct family of cytochromes is the cytochrome P450 family, so named for the characteristic Soret peak formed by absorbance of light at wavelengths near 450 nm when the heme iron is reduced (with sodium dithionite) and complexed to carbon monoxide. These enzymes are primarily involved in steroidogenesis and detoxification. [14] [9]


Structure𠄿unction Relationships in Heme-Proteins

Biological systems rely on heme-proteins to carry out a number of basic functions essential for their survival. Hemes, or iron–porphyrin complexes, are the versatile and ubiquitous active centers of these proteins. In the past decade, discovery of new heme-proteins, together with functional and structural research, provided a wealth of information on these diverse and biologically important molecules. Structure determination work has shown that nature has used a variety of different scaffolds and architectures to bind heme and modulate functions such as redox properties. Structural data have also provided insights into the heme-linked protein conformational changes required in many regulatory heme-proteins. Remarkable efforts have been made towards the understanding of factors governing redox potentials. Site-directed mutagenesis studies and theoretical calculations on heme environments investigated the roles of hydrophobic and electrostatic residues, and analyzed the effect of heme solvent accessibility. This review focuses on the structure–function relationships underlying the association of heme in signaling and iron metabolism proteins. In addition, an account is given about molecular features affecting heme's redox properties this briefly revisits previous conclusions in the light of some more recent reports.


Abstraktné

The deazaflavin cofactor F420 enhances the persistence of mycobacteria during hypoxia, oxidative stress, and antibiotic treatment. However, the identities and functions of the mycobacterial enzymes that utilize F420 under these conditions have yet to be resolved. In this work, we used sequence similarity networks to analyze the distribution of the largest F420-dependent protein family in mycobacteria. We show that these enzymes are part of a larger split β-barrel enzyme superfamily (flavin/deazaflavin oxidoreductases, FDORs) that include previously characterized pyridoxamine/pyridoxine-5′-phosphate oxidases and heme oxygenases. We show that these proteins variously utilize F420, flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide, and heme cofactors. Functional annotation using phylogenetic, structural, and spectroscopic methods revealed their involvement in heme degradation, biliverdin reduction, fatty acid modification, and quinone reduction. Four novel crystal structures show that plasticity in substrate binding pockets and modifications to cofactor binding motifs enabled FDORs to carry out a variety of functions. This systematic classification and analysis provides a framework for further functional analysis of the roles of FDORs in mycobacterial pathogenesis and persistence.


Pozri si video: Centrálna dogma molekulárnej biológie (Február 2023).