Informácie

Biologické replikáty

Biologické replikáty


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

V súčasnosti robíme skríning, kde sa supernatany z rodu baktérií testujú proti bunkovej kultúre patogénnych baktérií v 96-jamkovej platni, kde sa OD meria každé 2 hodiny.

Každý supernatant z kmeňa má 3 replikáty a kontrolná bunková kultúra fatogénnych baktérií má približne 11 replikátov vo vnútri platne.

Po ukončení každého experimentu sa modelujú krivky rastu buniek a určia sa 3 rastové parametre (mí, lambda a maximálna absorbancia) z každého testovaného supernatantu a z kontroly. Potom sa vykoná Mann-withney U test pre každý rastový parameter z každého kmeňa oproti zodpovedajúcemu kontrolnému parametru, aby sa skontrolovalo, či existuje nejaký druh možnej inhibície.

Kmene, ktoré majú určitý inhibičný účinok proti týmto patogénnym baktériám, budú znovu testované v ďalších experimentoch, aby sa potvrdila možná pozitívnosť.

Mám pochybnosti o tom, či je vykonanie štatistického testu na porovnanie supernatantov z každej platne s jej zodpovedajúcou kontrolou správne, ak vezmeme do úvahy, že možní kandidáti budú znovu testovaní v ďalších experimentoch, aby sa potvrdila jej inhibícia. Keďže je potrebné testovať množstvo kmeňov, opakovanie každého jednotlivého experimentu viac ako 3-krát by trvalo príliš dlho.

Aký je váš názor? Je správne robiť štatistiku pre jednu platňu (technické replikáty), aby sa zhromaždili možné pozitívne výsledky na neskoršie potvrdenie (biologické replikáty)?

Ďakujem

Sú biologické replikáty v tomto prípade nevyhnutne potrebné?


Replikuje sa a opakuje v navrhnutých experimentoch

Repliky sú viaceré experimentálne cykly s rovnakými nastaveniami faktorov (úrovňami). Repliky podliehajú rovnakým zdrojom variability, nezávisle od seba. Môžete replikovať kombinácie úrovní faktorov, skupiny kombinácií úrovní faktorov alebo celé návrhy.

Napríklad, ak máte tri faktory s dvoma úrovňami a testujete všetky kombinácie úrovní faktorov (úplný faktoriálny návrh), jedna replika celého návrhu by mala 8 cyklov (2 3 ). Môžete si vybrať, či urobíte návrh raz alebo budete mať viacero replikátov.

  • Skríningové návrhy na zníženie veľkého súboru faktorov zvyčajne nepoužívajú viacnásobné replikácie.
  • Ak sa pokúšate vytvoriť predikčný model, viacnásobné replikácie môžu zvýšiť presnosť vášho modelu.
  • Ak máte viac údajov, možno budete môcť zistiť menšie efekty alebo mať väčší výkon na zistenie efektu pevnej veľkosti.
  • Vaše zdroje môžu diktovať počet replikácií, ktoré môžete spustiť. Ak je váš experiment napríklad mimoriadne nákladný, možno ho budete môcť spustiť iba raz.

Hodnotenie stratégií na normalizáciu biologických replikátov údajov Western blot

Údaje Western blot sa široko používajú v kvantitatívnych aplikáciách, ako je štatistické testovanie a matematické modelovanie. Aby sa zabezpečila presná kvantifikácia a porovnateľnosť medzi experimentmi, replikáty Western blot sa musia normalizovať, ale nie je jasné, ako dostupné metódy ovplyvňujú štatistické vlastnosti údajov. Tu hodnotíme tri bežne používané normalizačné stratégie: (i) pevným normalizačným bodom alebo kontrolou (ii) súčtom všetkých údajových bodov v replike a (iii) optimálnym zoradením replikátov. Zvažujeme, ako tieto rôzne stratégie ovplyvňujú variačný koeficient (CV) a výsledky testovania hypotéz s normalizovanými údajmi. Normalizácia pevným bodom má tendenciu zvyšovať priemerný CV normalizovaných údajov spôsobom, ktorý prirodzene závisí od výberu bodu normalizácie. V kontexte testovania hypotéz teda normalizácia pomocou pevného bodu znižuje falošné pozitíva a zvyšuje falošne negatívne. Analýza publikovaných experimentálnych údajov ukazuje, že výber normalizačných bodov s nízkou kvantifikovanou intenzitou vedie k vysokému CV normalizovaných údajov a malo by sa mu preto vyhnúť. Normalizácia súčtom alebo optimálnym zoradením redistribuuje neistotu nespracovaných údajov spôsobom závislým od priemeru, pričom znižuje CV bodov s vysokou intenzitou a zvyšuje CV bodov s nízkou intenzitou. To spôsobuje, že účinok normalizácií na základe súčtu alebo optimálneho zarovnania na testovanie hypotéz závisí od priemeru údajov testovaných pre body s vysokou intenzitou, falošne pozitívne sa zvyšujú a falošne negatívne sa zmenšujú, zatiaľ čo v prípade bodov s nízkou intenzitou sa falošne pozitívne klesajú a sú falošné. negatíva sa zvyšujú. Tieto výsledky pomôžu používateľom Western blottingu vybrať si vhodnú stratégiu normalizácie a tiež pochopiť dôsledky tejto normalizácie pre následné testovanie hypotéz.

Vyhlásenie o konflikte záujmov

Konkurenčné záujmy: Autori vyhlásili, že neexistujú žiadne konkurenčné záujmy.

Figúrky

Obrázok 1. Normalizácie replikátov Western blot…

Obrázok 1. Normalizácie replikátov Western blot v literatúre.

Nájdené normalizácie delíme...

Obrázok 2. Linearita signálu získaná rôznymi…

Obrázok 2. Linearita signálu získaná rôznymi detekčnými systémami Western blot.

Reprezentatívne experimenty západného…

Reprezentatívne experimenty Western blotov obsahujúcich 2-násobné sériové riedenie BSA. Zobrazené sú reprezentatívne výsledky z 3 nezávislých experimentov. BSA bol detegovaný pomocou (A,C) ECL s röntgenovým filmom a (B,D) ECL s CCD zobrazovačom. Modré štvorce označujú dátové body, ktoré sú lineárne, zatiaľ čo červené trojuholníky označujú dátové body mimo lineárneho rozsahu detekcie. Na zvýraznenie lineárnych a nelineárnych údajov používame lineárne trendové čiary, ktoré uvádzajú koeficient determinácie . Údaje v (A,B) sú v log-log stupnice, aby sa zlepšila vizualizácia.

Obrázok 3. Vplyv normalizácie na…

Obrázok 3. Účinok normalizácie na CV normalizovaných údajov.

Obrázok 4. Korelácia medzi intenzitou…

Obrázok 4. Korelácia medzi intenzitou normalizačných bodov a CV…

Obrázok 5. Účinky normalizácie na falošné…

Obrázok 5. Účinky normalizácie na falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky pri aplikácii t-testu na...


Typy replikátov: technické vs. biologické

Biologické aj technické replikácie sú kľúčom k vytváraniu presných a spoľahlivých výsledkov a pomáhajú riešiť rôzne otázky týkajúce sa reprodukovateľnosti údajov.

Technické repliky

Technické repliky sú opakované merania tej istej vzorky, ktoré demonštrujú variabilitu protokolu. Technické repliky sú dôležité, pretože sa zaoberajú reprodukovateľnosťou testu alebo techniky, ale neriešia reprodukovateľnosť účinku alebo udalosti, ktorú študujete. Skôr naznačujú, či sú vaše merania vedecky robustné alebo hlučné a aký veľký musí byť nameraný efekt, aby vynikal nad hlukom pozadia.[2] Príklady môžu zahŕňať načítanie viacerých dráh s každou vzorkou na rovnakom blote, paralelné spustenie viacerých blotov alebo opakovanie blotu s rovnakými vzorkami v rôznych dňoch.

Obrázok 1. Technické repliky pomáhajú identifikovať variácie v technike. Napríklad lyzát odvodený od myši, ktorý je nanesený trikrát (A1, A2, A3) na každú membránu, potom prebieha a meria sa nezávisle, pomôže identifikovať variáciu v technike.

Keď sú technické replikáty veľmi variabilné, je ťažšie oddeliť pozorovaný účinok od variácie testu. Možno budete musieť identifikovať a obmedziť zdroje chýb vo vašom protokole, aby ste zvýšili presnosť vášho testu. Technické replikácie neriešia biologickú relevantnosť výsledkov.

Biologické replikáty

Biologické replikáty sú paralelné merania biologicky odlišných vzoriek, ktoré zachytávajú náhodné biologické variácie, ktoré môžu byť predmetom štúdia alebo samotným zdrojom hluku.[3] Biologické replikácie sú dôležité, pretože riešia, do akej miery možno zovšeobecniť vaše experimentálne výsledky. Ukazujú, či je experimentálny účinok udržateľný v rámci iného súboru biologických premenných.

Napríklad bežné biologické replikácie zahŕňajú opakovanie konkrétneho testu s nezávisle vytvorenými vzorkami alebo vzorkami odvodenými z rôznych typov buniek, typov tkanív alebo organizmov, aby sa zistilo, či je možné pozorovať podobné výsledky. Príklady zahŕňajú analýzu vzoriek z viacerých myší, a nie z jednej myši, alebo z viacerých dávok nezávisle kultivovaných a ošetrených buniek.

Obrázok 2. Biologické replikáty odvodené z nezávislých vzoriek pomáhajú zachytiť náhodné biologické variácie. Napríklad od troch nezávislých myší sa odoberú tri biologické replikáty (A, B a C). Každý z týchto biologických replikátov sa uskutočnil v troch technických replikátoch (A1, A2, A3 B1, B2, B3 C1, C2, C3) v jednom teste Western blot.

Aby sa demonštroval rovnaký účinok v inom experimentálnom kontexte, experiment by sa mohol opakovať vo viacerých bunkových líniách, v príbuzných typoch buniek alebo tkanivách alebo s inými biologickými systémami. Pre každý experimentálny kontext by sa mala vyvinúť vhodná stratégia replikácie. Niekoľko nedávnych prác diskutuje o úvahách o výbere technických a biologických replikátov.[1,2,3].

Užitočný návod na výber a začlenenie správnych technických a biologických replikátov pre váš experiment nájdete v protokole Kvantitatívna analýza Western Blot s replikovanými vzorkami.

Ďalšie zdroje, ktoré vám pomôžu získať najlepšie údaje

LI-COR má ďalšie zdroje, ktoré môžete použiť pri plánovaní svojej kvantitatívnej stratégie Western blot.


Hlúpa otázka o replikách.

V súčasnosti replikujem niektoré kľúčové údaje, ktoré som vytvoril v rôznych bunkových líniách. S mojimi počiatočnými údajmi som vytvoril stabilný knockdown génov, takže všetko bolo jednoduché zistiť, ale pri replikácii údajov používam prechodný knockdown siRNA. Ak vykonám knockdown a potom rozdelím bunky z tohto experimentu do 3 replikátov funkčného testu, ktorý robím, mám 1 biologický replikát, pretože som vykonal iba jeden knockdown, alebo mám 3 biologické replikáty, pretože test bol vykonávané s 3 rôznymi skupinami rovnakého typu buniek?

Toto je pravdepodobne jednoduchá otázka, ale z nejakého dôvodu ma to podrazilo. Vopred ďakujeme za vašu pomoc!

Upraviť: Ďakujem všetkým za príspevky!

Myslím, že ak urobíte knockdown pred rozdelením buniek, potom máte tri technické repliky pre váš funkčný test. Ak rozdelíte bunky a potom nezávisle vykonáte knockdown v každej z troch platní, máte tri biologické replikáty. Alebo aspoň takto vidím tieto veci ja.

Vidíte, to bolo aj moje pôvodné myslenie, ale ak vytvoríte bunkovú líniu so stabilným knockdownom a použijete ju na tri replikácie testu, potom máte tri biologické replikácie a ja mám problém zistiť rozdiel.

Vzhľadom na nastavenie súhlasím a poviem, že máte tri technické replikáty (jeden biologický replikát). Všeobecným pravidlom je položiť si otázku: ak by som mal začať tento experiment odznova kvôli ďalšej biologickej replikácii, kde by som začal? So stabilne transfekovanou bunkovou líniou by ste nezačali experiment opätovným vykonaním transfekcie. Avšak s prechodným knockdownom génu siRNA by ste experiment začali znova vykonaním knockdownu. Preto je knockdown súčasťou biologického replikátu experimentu. Ak robíte iba jeden knockdown siRNA, potom máte čo do činenia s iba jedným biologickým replikátom experimentu, bez ohľadu na to, čo potom urobíte s bunkami.


Biologické vs technické repliky

Môj mozog je na to naozaj natiahnutý. Pýtam sa, či nasledujúce sú alebo nie sú tri biologické replikáty alebo len tri technické replikácie z rovnakého biologického zdroja.

Tak som rozmrazil ampulku s bunkami a dvakrát ich pasážoval. Pri každej pasáži robím riedenie 1:2, čo znamená, že mám štyri banky v tej istej pasáži. Teraz, tu, kde som uviazol: ak vezmem jednu fľaštičku a naočkujem ju na platňu s jamkami (povedzme liečba liekom s tromi opakovaniami) a urobím to isté pre všetky ostatné banky, to znamená, že mám štyri biologické replikáty?

Ak to nie je biologický replikát, mal by som prejsť jednou z baniek, aby to bola úplne nová pasáž a zopakovať. (Viem, že toto je základná biológia, ale niekedy máte jednoducho mozog na prd).

Biologický replikát = opakovanie experimentu v nový deň s novými materiálmi (tj. Ako opakovateľný je experiment?). Ak by ste povedali „Tento experiment som vykonal 3-krát“, máte tri biologické replikácie.

Technická replika = mať viacero vzoriek s rovnakými podmienkami v rámci jedného experimentu (tj. Aký je rozsah pre tento fenotyp?). Ak by ste povedali „Tento experiment som vykonal s n = 3 v každej podmienke“, máte technické repliky.

Rôzne liekovky pasážovaných buniek ešte nie sú biologickými alebo technickými replikáciami. Záleží na tom, či s nimi pracujete spoločne alebo oddelene. Ak ste teda nasadili dosku s jamkami iba jednou fľaštičkou a chystáte sa vykonať svoj experiment, potom nasledujúci deň (týždeň, mesiac, čokoľvek) nasadíte ďalšiu platňu s jamkami a zopakujete experiment znova, ale oddelene, máte biologické replikáty. Ak ste ich nasiali v rovnakom čase a zároveň na nich vykonali experiment, stanú sa technickými replikami.


Biologické replikáty - Biológia

Včera som vám povedal o niektorých všeobecných princípoch klinických skúšok a o tom, ako je skutočne dôležité, aby boli kontrolované, čo znamená, že ak máte 2 skupiny vecí, ktoré porovnávate (napr. liečba vs. žiadna liečba), chcete sa uistiť (čo najviac ), že jediná vec, ktorá sa medzi skupinami líši, je liečba. Nie som zapojený do klinických testov, ale experimenty, ktoré vykonávam v laboratóriu (to sú experimenty, ktoré som vykonal v laboratóriu a dúfam, že sa k nim budem môcť čoskoro vrátiť), sú ako mini (ľahšie kontrolované) testy &ndash veľa stále platia rovnaké princípy o závislých premenných, nezávislých premenných, replikách atď. Takže dnes som si myslel, že vám poviem niečo viac o experimentálnom dizajne.

Dúfam, že v tomto príspevku vás zavediem do mysle vedca, keď plánujú experiment. Pri akomkoľvek experimente musíte robiť kompromisy, aby ste získali typ informácií, ktoré sú pre vás najdôležitejšie. Mnohé z týchto „kompromisov“ zahŕňajú riadenie premenných, kľúčový aspekt vedeckého procesu.

Myšlienkový experiment: Na ilustráciu niektorých bodov začnime „jednoduchým“ experimentom, ktorý ste možno urobili na vedeckom veľtrhu. Povedzme, že chcete otestovať účinky vystavenia vode a svetlu na rast rastlín. Vyzerá to celkom priamočiaro, však? Voda a svetlo sú „nezávislé premenné“, ktoré chcete testovať, a rast je „závislá premenná“, ktorá je „závislá“ od vašich nezávislých premenných. Takže vezmete nejaké semená, dáte im rôzne množstvo vody a svetla a zmeriate ich rast. Ale počkaj, čo myslíš pod pojmom rast? Zväčšuje sa výška, veľkosť listov, obvod, celková hmotnosť? V tomto jednoduchom experimente by ste ich mohli pozbierať všetky, ale často to nie je praktické. Keď si vyberiete svoj experiment &ldquoread out&rdquo, musíte určiť, kedy vykonať merania &ndash to závisí od toho, čo chcete vedieť. Zaujímajú vás zmeny v tempe rastu? Ak áno, chcete vykonať sériu meraní v pevných časových bodoch. Ak sa nestaráte o rýchlosť, iba o celkový rast, môžete vykonať iba jedno meranie v jednom časovom bode.

Pre jednoduchosť tohto myšlienkového cvičenia povedzme, že sa rozhodnete zmerať výšku rastliny po dvoch týždňoch. Teraz sa musíte rozhodnúť, ako chcete zmeniť svoje premenné. Ak zmeníte množstvo vody a svetla súčasne, akékoľvek zmeny v raste, ktoré uvidíte, sú kombináciou efektov meniacej sa vody a meniaceho sa svetla a budete vedieť, aká veľká časť zmien, ktoré vidíte, je spôsobená ktorým faktorom. Ak chcete získať informácie o individuálnom príspevku jednej premennej, musíte druhú premennú ponechať konštantnú &ndash, aby ste spustili dve paralelné sady experimentov. V jednom dáte každej rastline rovnaké množstvo vody, ale iné množstvo svetla a naopak pre druhú sadu.

Ak sú všetky premenné okrem tej, o ktorú sa zaujímate, konštantné, potom sa akékoľvek rozdiely v závislej premennej (v tomto prípade rast) považujú za spôsobené nezávisle premennou, ktorú ste zmenili. Ak by sa každá iná premenná skutočne udržiavala konštantná, bola by to pravda, ale tento teoreticky dokonale riadený systém neexistuje. Vo vašich premenných je vždy určitá variabilita! Napríklad môžu existovať genetické rozdiely v semenách, malé rozdiely v zložení pôdy, rozdiely vo vzdialenosti od svetla atď. Ťažkosti s kontrolou experimentálnych premenných sú obzvlášť výrazné v biológii, pretože živé organizmy sú neuveriteľne zložité.

Repliky: Nie je možné kontrolovať každú premennú, aby sa to zohľadnilo, vedci zahŕňajú repliky. Pri replikátoch dúfate, že hoci sa každý replikát bude mierne líšiť, tieto rozdiely sa budú navzájom „vyrovnávať“, podobne ako všetky farby v dúhe sa „zrušia“, aby vytvorili bielu. Existujú dva hlavné typy replikácií, ktoré sú oba dôležité:

Technické replikácie sú, keď testujete rovnakú vzorku viackrát, aby ste odstránili nezrovnalosti v meraní. V našom prípade by to znamenalo zmerať každú rastlinu niekoľkokrát &ndash Merali ste presne z rovnakého východiskového bodu? Počítali ste správne počet riadkov na pravítku?

Biologické replikácie sú, keď testujete rôzne vzorky, ktoré sú "identické" vo všetkých aspektoch okrem ich zdroja. V našom prípade rastlín by to znamenalo zahrnúť viacero semien do každej ošetrovanej skupiny. Keďže ide iba o teoretický experiment, mohli by sme zahrnúť toľko semien, koľko chceme, ale v skutočných experimentoch existujú praktické obmedzenia (napr. dostupnosť a cena vzoriek, množstvo času a energie potrebnej na zber údajov).

Viac praktických rád laboratória o replikáciách neskôr&hellip

Aby ste zistili účinky vašej liečby, musíte sa uistiť, že rozdiely medzi liečebnými skupinami sú väčšie ako rozdiely medzi jednotlivými vzorkami v rámci týchto liečebných skupín, a existujú štatistické testy, ktoré vedci používajú na odhadnutie toho, aká je pravdepodobnosť, že účinky sú spôsobené liečba.

Prehnaná kontrola? Riadenie premenných je kľúčové, ale aj keby ste mohli dokonale ovládať každú premennú okrem tej, ktorá vás zaujíma, stratili by ste tým dôležité informácie. Vo vede hovoríme o „neaditívnych efektoch“, kde súčet efektov jednotlivých premenných samotných je menší ako ich kombinovaný efekt, pretože samotné premenné sú vzájomne závislé. Povedzme, že chcete určiť optimálne množstvo svetla a vody pre rast rastlín a tieto premenné zmeníte nezávisle, ako sme načrtli vyššie, a určíte, že optimálne množstvo svetla je nejaká hodnota A a optimálne množstvo vody je B. nevyhnutne neznamená, že optimálne rastové podmienky sú A + B. Je možné, že svetlo má väčší účinok pri určitej hladine vody, ale tento efekt by ste videli, ak by ste testovali iba pri inej hladine vody. Môže sa tiež stať, že jedna z „riadených premenných“, ako je teplota, má podobný účinok, pričom účinky svetla alebo vody sú pri určitých teplotách výraznejšie. Je zrejmé, že je nemožné otestovať každú kombináciu premenných, takže vedci musia pri navrhovaní svojich experimentov robiť kompromisy.

Príklad zo &ldquoreálnejšieho sveta&rdquo. Aby sme ukázali, ako sa tieto koncepty prejavujú v realistickejšom scenári, zvážme vývoj farmaceutických liekov. Mnoho skorých experimentov sa vykonáva na bunkách v miske (bunková kultúra), čo umožňuje miernu kontrolu nad premennými, pričom stále pracuje v bunkovom kontexte. Ak chce vedec otestovať účinky lieku na ľudské bunky, mohol by odobrať bunky a naliať ich do 2 misiek a pridať liek do jednej misky a do druhej misky len aplikačné vehikulum (tekutinu, v ktorej je liek rozpustený). ako negatívna kontrola. Ako sme videli vyššie, technická a biologická variabilita by mohla ovplyvniť výsledky, takže vedec by v skutočnosti chcel pripraviť niekoľko jedál, nielen jedno z každého.

Povedzme, že vedec vidí, že liek má požadovaný účinok a nie je čas oslavovať. Aby sa ubezpečili, že pozorované výsledky boli špecifické pre daný bunkový prípravok, chceli by tiež zopakovať experiment v inom dátume s „novými“ bunkami. Potom pravdepodobne otestujú liek na inej bunkovej línii (počiatočný zdroj imortalizovaných buniek je odlišný, nielen "dávka" týchto buniek), aby sa ubezpečili, že účinky sú špecifické pre bunkovú líniu.

Ak má liek rovnaký účinok na viacero bunkových línií, je pravdepodobnejšie, že bude mať tento účinok v tele (in vivo), ale to ani zďaleka nie je zaručené, pretože životnosť bunky v miske je značne odlišná od životnosti bunka v tele, kde existuje zložitá dynamika medzi bunkami a ich okolitým prostredím, nehovoriac o potenciálnych „necieľových“ efektoch, ktoré by mohli spôsobiť nebezpečné komplikácie. To je dôvod, prečo je potrebné ďalšie testovanie lieku, aby sa zistilo, 1) je bezpečný a 2) funguje?

Pokiaľ ide o testovanie drog na ľuďoch, kontrola (a prílišná kontrola) premenných je často bodom sporu. Ak ste si mysleli, že bunky v miske sú prirodzene premenlivé, úplné ľudské bytosti sú o to viac! Aby sa u niektorých kontrolovala táto variabilita, často existujú prísne požiadavky na účasť v testoch liekov. Ako sme videli vyššie, existujú legitímne dôvody na takúto kontrolu – napríklad, ak testujete liek u pacienta, ktorý má ďalší zdravotný problém a tento pacient má komplikáciu, neviete, či je to spôsobené samotným liekom alebo už existujúcim stav alebo kombinácia oboch. Problém však často vzniká v súvislosti s nadmernou kontrolou premenných. Prísna kontrola môže viesť k tomu, že liek bude testovaný a schválený na populácii, ktorá je reprezentatívna pre skutočnú populáciu pacientov. Liek preto nemusí byť účinný u väčšiny pacientov (a môže mať dokonca nežiaduce účinky). Ako vidíte, vedci musia pri navrhovaní svojich experimentov robiť ťažké a starostlivé rozhodnutia.

Niečo viac o replikátoch: Aby ste si to mohli pozrieť, TECHNICAL REPLICATES testujú rovnakú vzorku viackrát, aby sa zohľadnili odchýlky v meraní, zatiaľ čo BIOLOGICKÉ REPLIKÁTY testujú rôzne vzorky. A oba tieto sa líšia od nezávislých experimentov, kde testujete rôzne vzorky v rôznych dňoch s čerstvými nastaveniami atď. Nezávislé experimenty môžu zodpovedať za veci ako „tam bolo niečo vo vode“ alebo častejšie, pokiaľ ide o biochémiu, niečo sa vynechalo z vody! (je skutočne ľahké náhodne zabudnúť pridať veci, takže chcete vyvinúť systémy, ako je presunutie skúmaviek do iného stojana po ich pridaní alebo začiarknutie vecí, ktoré ste pridali na kus papiera (ale pozor, chvíľu to trvá vypestujte si návyky, takže na začiatku sa môžete ešte viac zmiasť, pretože môžete niečo pridať, ale zabudnete to prečiarknuť alebo posunúť skúmavku, takže si potom budete myslieť, že ste to pridali, keď už máte!

Každý z týchto typov „dvojitej kontroly“ má hodnotu, ale rôznymi spôsobmi. Aby sme ilustrovali rozdiel, pozrime sa na príklad. Typy replikátov sa často vysvetľujú z hľadiska pacientov alebo laboratórnych potkanov &ndash, napr. povedzme, že liečite 10 ľudí liekom, ktorý má znížiť krvný tlak, a potom zmeriate krvný tlak liečeným ľuďom. Ak by ste tej istej osobe zmerali krvný tlak 10-krát (možno ste si mysleli, že prístroje sa správajú divne alebo čo, alebo človeku chvíľu trvalo, kým sa uvoľnil), boli by to technické repliky (povedia vám o spoľahlivosti merania a variáciách v rámci vzorka). Ak zmeriate krvný tlak každej osoby, budú to biologické repliky (tieto vám povedia o rozdieloch medzi tým, ako ľudia reagujú). A ak by ste experiment zopakovali s inou skupinou ľudí, bol by to nezávislý experiment (to vám povie, ako reprezentatívna pre širšiu populáciu bola prvá skupina)

Povedzme, že 1 z ľudí reagoval na liečbu naozaj dobre, ale ďalších 9 nie. Ak ste tomuto 1 človeku namerali krvný tlak 5-krát, ale všetkým ostatným len raz, a potom ste zmerali priemer, zdá sa, že liek fungoval oveľa lepšie, ako v skutočnosti fungoval. Takže namiesto toho, keď robíte priemer, spriemerujete priemery technických replikátov (takže vezmete priemer tohto silného respondenta, aby to neskreslilo výsledky). Takže ak máte 10 ľudí, váš &ldquon&rdquo je 10 bez ohľadu na to, koľko meraní vykonáte.

Nepracujem s ľuďmi (dobre, pracujem s ľuďmi, ale nerobím na nich výskum) alebo so zvieratami &ndash, ale pracujem s mnohými replikátmi. Či už ide o rôzne proteínové prípravky (biologické replikáty) alebo testy rovnakého proteínového prípravku, ktoré sa však opakujú viackrát, aby sa zohľadnili veci, ako sú rozdiely v pipetovaní atď. (technické replikáty). A ak experiment zopakujem v iný deň s inými prípravkami, bol by to nezávislý experiment.

  • napr. prípravu rovnakého proteínu, paralelne zopakujte experiment alebo odoberte viacero vzoriek z rovnakej reakcie
  • odchýlky v meraní &ndash konzistentné pipetovanie (bola tam vzduchová bublina, nezabudli ste niečo pridať)
  • variácia vo vzorke &ndash bola vzorka dobre premiešaná? nevzal si si náhodou pipetu, ktorá bola super plná vecí?
  • viac technických replikátov -> lepší odhad priemeru, ale nemení veľkosť vzorky
  • aká reprezentatívna je vaša vzorka?
  • rôzni ľudia alebo zvieratá, rôzne bunkové línie, rôzne proteínové prípravky
  • sú rozdiely, ktoré ste videli v jednej vzorke, naozaj skutočné? Sú to len variácie pozadia

Mnoho prístupov: Ďalšia vec, ktorú treba vziať do úvahy, je, že v biochémii často existuje niekoľko prístupov k otázke. Povedzme, že chcem zistiť, či 2 proteíny interagujú a mal by som použiť EMSA, IP, analytickú chromatografiu? (Tieto techniky tu nebudem vysvetľovať, ale viac informácií o nich nájdete na mojom blogu). Jedna je vo svojej podstate „lepšia“ alebo „horšia“, len vám poskytujú iné informácie. Každý experiment vo všetkých oblastiach vedy má svoje silné a slabé stránky. Je dôležité, aby vedci preskúmali svoje možnosti, kriticky premýšľali a vybrali experiment, ktorý odpovie na otázku, ktorú hľadajú. V ideálnom prípade by vedecké závery mali vychádzať z viacerých dôkazov, viacerých typov experimentov. Podobne ako veľký počet biologických replikátov pomáha variácii „vyrovnávať“, použitie viacerých typov experimentov umožňuje, aby silné stránky jednej techniky dopĺňali slabé stránky inej.

Okrem starostlivého plánovania experimentov je dôležité, aby vedci rozpoznali slabé stránky a obmedzenia metód, ktoré sa rozhodnú použiť, a sprostredkovali tieto upozornenia svojmu publiku. Ak ty publiku, niektoré veci, ktoré treba hľadať, sú: replikácia (technická, ale najmä biologická) a viacnásobné dôkazy (použité rôzne typy experimentov).

Účelom tohto príspevku je zmierniť vaše nadšenie pre vedu, ale skôr vám má pomôcť uvažovať ako vedec a pochopiť, prečo robíme veci, ktoré robíme. Existuje mnoho spôsobov, ako odpovedať na podobné vedecké otázky a konkrétny experiment, ktorý si vyberiete, závisí od mnohých faktorov (praktických aj teoretických). Ako vo všetkom, aj medzi vedcami a technikami, ktoré si vyberáme, existuje variabilita, ale táto variabilita neznižuje honbu za vedou.


Najprv by ste sa mohli pozrieť na stupeň korelácie medzi týmito dvoma replikátmi – aký podiel vrcholov je medzi nimi spoločný v porovnaní s vrcholmi nájdenými iba v jednej vzorke? To poskytne predstavu o tom, ako je analýza opakovateľná a koľko píkov je variabilných medzi vzorkami alebo v dôsledku artefaktov metódy.

Pokiaľ ide o interpretáciu biológie za väzbovými vzormi, pravdepodobne budete chcieť interpretovať iba vrcholy, ktoré nájdete v oboch replikátoch.

Táto otázka je trochu všeobecná, takže všeobecná odpoveď je, že ENCODE má stránku Normy údajov a spracovania údajov ChIP-seq s transkripčným faktorom, ktorá vám môže poskytnúť užitočný východiskový bod.

V prípade údajov TF ChIP-seq s replikátmi metóda Irreproducible Discovery Rate (IDR) pomáha využiť replikáty na produkovanie špičkových hovorov s vyššou spoľahlivosťou, čím sa vytvárajú „optimálne“ aj „konzervatívne“ vrcholy definované určitým prahom IDR. Tu je popis metódy ENCODE:

Štatistický postup, ktorý funguje na replikovanom súbore píkov a porovnáva konzistentnosť radov týchto píkov v individuálnych replikátoch/pseudoreplikovaných súboroch píkov. Zachovajú sa vrcholy s vysokou konzistentnosťou. IDR môže fungovať na vrcholoch v páre skutočných replikátov, čo vedie ku „konzervatívnej“ sade výstupných vrcholov, alebo naprieč párom pseudoreplikátov, čo vedie k „optimálnemu“ súboru výstupných vrcholov. Vrcholy v konzervatívnom súbore vrcholov možno interpretovať ako vrcholy s vysokou spoľahlivosťou, ktoré predstavujú reprodukovateľné udalosti naprieč skutočnými biologickými replikáciami a zodpovedajú za skutočný biologický a technický šum. Vrcholy v optimálnom súbore možno interpretovať ako vrcholy s vysokou spoľahlivosťou, ktoré predstavujú reprodukovateľné udalosti a zodpovedajú za šum vzorkovania pri čítaní. Optimálna sada je citlivejšia, najmä ak má jeden z replikátov nižšiu kvalitu údajov ako druhý.

Kód Pythonu na spustenie IDR na špičkových súboroch možno nájsť na repozitári GitHub Chip-seq spoločnosti ENCODE.


Ale replikujú sa hodinky? Riešenie logickej výzvy argumentu hodinárov

Boli veci v minulosti lepšie ako dnes? Záleží na tom, koho sa pýtate.

Bezpochyby sú niektoré veci, ktoré boli v minulých rokoch lepšie. A je jasné, že existujú určité historické postoje a zvyky, ktorým dnes ťažko uveríme, že naši predkovia považovali za prijateľnú súčasť každodenného života.

Nie sú to len postoje a zvyky, ktoré sa časom menia. Aj myšlienky sa menia – niektoré k lepšiemu, iné k horšiemu. Zvážte spôsob, akým sa vyvinula veda, najmä štúdium biologických systémov. Bol spôsob, akým sme pristupovali k štúdiu biologických systémov v minulosti lepší ako dnes?

Ako kreacionista starej Zeme a zástanca inteligentného dizajnu si myslím, že prístup biológov v minulosti bol lepší ako dnes z jedného jednoduchého dôvodu. Pred Darwinom bola teleológia ústredným prvkom biológie. Koncom 18. storočia a začiatkom až polovici 19. storočia vedci považovali biologické systémy za produkt mysle. V dôsledku toho bol dizajn v popredí a stredobodom biológie.

V rámci darwinovskej revolúcie bola teleológia zavrhnutá. Mechanism replaced agency and design was no longer part of the construct of biology. Instead of reflecting the purposeful design of a Mind, biological systems were now viewed as the outworking of unguided evolutionary mechanisms. For many people in today’s scientific community, biology is better for it.

Prior to Darwin, the ideas shaped by thinkers (such as William Paley) and biologists (such as Sir Richard Owen) took center stage. Today, their ideas have been abandoned and are often lampooned.

But, advances in my areas of expertise (biochemistry and origins-of-life research) justify a return to the design hypothesis, indicating that there may well be a role for teleology in biology. In fact, as I argue in my book The Cell’s Design, the latest insights into the structure and function of biomolecules bring us full circle to the ideas of William Paley (1743-1805), revitalizing his Watchmaker argument for God’s existence.

In my view, many examples of molecular-level biomachinery stand as strict analogs to human-made machinery in terms of architecture, operation, and assembly. The biomachines found in the cell’s interior reveal a diversity of form and function that mirrors the diversity of designs produced by human engineers. The one-to-one relationship between the parts of man-made machines and the molecular components of biomachines is startling (e.g., the flagellum’s hook). I believe Paley’s case continues to gain strength as biochemists continue to discover new examples of biomolecular machines.

The Skeptics’ Challenge

Despite the powerful analogy that exists between machines produced by human designers and biomolecular machines, many skeptics continue to challenge the revitalized watchmaker argument on logical grounds by arguing in the same vein as David Hume. 1 These skeptics assert that significant and fundamental differences exist between biomachines and human creations.

In a recent interaction on Twitter, a skeptic raised just such an objection. Here is what he wrote:

“Do [objects and machines designed by humans] replicate with heritable variation? Bad analogy, category mistake. Same one Paley made with his watch on the heath centuries ago.”

In other words, biological systems replicate, whereas devices and artefacts made by human beings don’t. This difference is fundamental. Such a dissimilarity is so significant that it undermines the analogy between biological systems (in general) and biomolecular machines (specifically) and human designs, invalidating the conclusion that life must stem from a Mind.

This is not the first time I have encountered this objection. Still, I don’t find it compelling because it fails to take into account manmade machines that do, indeed, replicate.

Von Neumann’s Universal Self-Constructor

In the 1940s, mathematician, physicist, and computer scientist John von Neumann (1903–1957) designed a hypothetical machine called a universal constructor. This machine is a conceptual apparatus that can take materials from the environment and build any machine, including itself. The universal constructor requires instructions to build the desired machines and to build itself. It also requires a supervisory system that can switch back and forth between using the instructions to build other machines and copying the instructions prior to the replication of the universal constructor.

Von Neumann’s universal constructor is a conceptual apparatus, but today researchers are actively trying to design and build self-replicating machines. 2 Much work needs to be done before self-replicating machines are a reality. Nevertheless, one day machines will be able to reproduce, making copies of themselves. To put it another way, reproduction isn’t necessarily a quality that distinguishes machines from biological systems.

It is interesting to me that a description of von Neumann’s universal constructor bears remarkable similarity to a description of a cell. In fact, in the context of the origin-of-life problem, astrobiologists Paul Davies and Sara Imari Walker noted the analogy between the cell’s information systems and von Neumann’s universal constructor. 3 Davies and Walker think that this analogy is key to solving the origin-of-life problem. súhlasil by som. However, Davies and Walker support an evolutionary origin of life, whereas I maintain that the analogy between cells and von Neumann’s universal constructor adds vigor to the revitalized Watchmaker argument and, in turn, the scientific case for a Creator.

In other words, the reproduction objection to the Watchmaker argument has little going for it. Self-replication is not the basis for viewing biomolecular machines as fundamentally dissimilar to machines created by human designers. Instead, self-replication stands as one more machine-like attribute of biochemical systems. It also highlights the sophistication of biological systems compared to systems produced by human designers. We are a far distance away from creating machines that are as sophisticated as the machines found inside the cell. Nevertheless, as we continue to move in that direction, I think the case for a Creator will become even more compelling.

Kto vie? With insights such as these maybe one day we will return to the good old days of biology, when teleology was paramount.


Metabolomics Study Design – Replicates & Volumes

The table below shows general guidelines and our preferences for minimal sample quantities required for common sample types.

Sample Replicates

For samples that will be directly compared to each other, sample preparation and measurements should be performed at the same time. This optimizes the amount of information collected for each assay and measures molecules of interest using the same conditions.

Two examples of experimental design (dose-response and temporal) recommendations in regard to minimum controls and biological replicates for mass spectrometry analysis are shown below.

In addition, for each project CIT staff pools together samples used for quality control (equal volume amounts of each sample) and injects these for analysis prior to and after every 10 individual sample injections. These quality control samples are used to assess instrument variability, data quality and injection volume variations. The number of required technical replicates will vary based on experimental design to ensure data quality is high and variations in samples owing to instrumentation variation is minimized.


References and Resources

Guided Paper

Meselson, M. and Stahl, F.W. (1958). The replication of DNA in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 44: 672–682.

Referencie

  • Matthew Meselson’s letter to James Watson from November 8, 1957, describing the results of their experiments on DNA replication. Download.
  • Meselson, M., Stahl, F.W., and Vinograd, J. (1957). Equilibrium sedimentation of macromolecules in density gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 43: 581–588.

This paper describes the use of the centrifuge and density gradient to analyze biological molecules, a technique that was used in their 1958 paper but also very broadly used for many applications in biology. See also Dig Deeper 3 .

An outstanding resource for those wanting a detailed, accurate description of the Meselson–Stahl experiment.

Zdroje

  • White Board Video on the Semi-Conservative Model of DNA and the Meselson–Stahl Experiment by iBiology. https://www.ibiology.org/genetics-and-gene-regulation/semi-conservative-replication-of-dna/

A nice 7:30 min video describing the Meselson–Stahl experiment and its conclusions.

This film documents the discovery of the structure and replication of DNA including interviews with James Watson who, along with Crick, proposed the double helix model of DNA.

This activity is often used in conjunction with the short film The Double Helix. It introduces students to Meselson and Stahl experiment and helps them understand the concepts generated via those experimental results.

This collection of resources from HHMI Biointeractive addresses many of the major concepts surrounding DNA and its production, reading, and replication.


Pozri si video: Biologické zbraně - Biological weapons.. Dokument cz (Septembra 2022).


Komentáre:

  1. Casey

    Táto téma je len veľmi zaujímavá, úcta k autorovi.

  2. Mori

    Well, well ... it will be necessary to take a closer look at this area :)

  3. Jordell

    Wonderful, very good message

  4. Watford

    Absolútne s tebou súhlasím. Toto je skvelý nápad. Som pripravený ťa podporiť.

  5. Cumhea

    Aká pekná fráza



Napíšte správu