Informácie

Výskum z ranej éry molekulárnej genetiky, ktorý podporoval proteín ako primárneho nosiča genetickej informácie?

Výskum z ranej éry molekulárnej genetiky, ktorý podporoval proteín ako primárneho nosiča genetickej informácie?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zdá sa, že sám nič nenachádzam. Určite boli vykonané experimenty (možno s použitím bakteriofágov), ktorým sa podarilo dospieť k tomuto záveru?

Konkrétne mám záujem o čokoľvek pred Hershey/Chase.


Je ťažké presvedčiť negatívnou odpoveďou, ale trúfam si, že odpoveď na vašu otázku je taká, že myšlienka, že bielkoviny boli genetickým materiálom, bola nie podporovaný akýmikoľvek experimentmi, ale bol a predpoklad založené na konvenčnej múdrosti, že proteíny sú komplexnejšie, a preto vhodnejšie na túto prácu.

Navrhujem, aby ste premýšľali skôr ako bakteriofág a Hershey a Chase. Bakteriofágy sa dostali do genetického výskumu až po vojne a experiment Hershey/Chase (1952) bol len dôsledným potvrdením záverov Averyho. a kol. v roku 1944 (spomínaný v tomto článku Scitable). Systém, ktorý Avery a kol. použitý (bakteriálna transformácia) sa vrátil k Griffithsovi v roku 1928 a musel byť prvým, ktorý umožnil akýkoľvek druh experimentovania v tejto oblasti. A myslím si, že to bola skôr otázka vyriešenia toho, čo sa stalo, než vymyslenie experimentu na rozlíšenie medzi proteínom a DNA ako genetickým materiálom.

Podľa mňa to niečo ilustruje o tom, ako veda napreduje. Často závisí od pokroku v technológii a zmenách v koncepčnom rámci, v ktorom vedci pracujú. (Niekedy – napr. Mitchellova hypotéza – potrebuje experimentálne výsledky na zmenu tohto koncepčného rámca.) Keď sa vrátime k experimentu Hershey/Chase, tento bol vykonaný, keď sa rovnováha vedeckého myslenia už zmenila na DNA ako genetický materiál.

Poznámka pod čiarou: Je to skôr, ako si myslíte

Vygeneroval som nižšie uvedený Google ngram, aby som dal výraz, ktorý používate, „molekulárna genetika“ do historickej perspektívy.

To ukazuje, že termín „molekulárna genetika“ sa v čase experimentu Hershey-Chase a Watsonovho a Crickovho postulátu o štruktúre DNA na začiatku 50. rokov takmer nepoužíval. Myslím si, že to odráža skutočnosť, že koncept nebol aktuálny. Populárnejší termín „molekulárna biológia“ sa presadil na základe štrukturálnej práce o DNA a proteínoch a názvu časopisu, v ktorom bola väčšina práce publikovaná (Journal of Molecular Biology). Otázkou je predpokladať stav vedy, ktorý pred 50. rokmi v skutočnosti neexistoval.


Veľmi sa spolieham na Morangeovu knihu (citovanú nižšie), pokiaľ ide o to, čo nasleduje.

Ako zdôraznil David, definitívny experiment, ktorý ukazuje, že nosičom genetickej informácie je skôr nukleová kyselina ako proteín, je experiment Averyho, MacLeoda a McCarthyho (1944). Ich záver, že DNA je „princíp transformácie“, však vedecká komunita, najmä biochemici, prijala veľmi neochotne (pozri Cobb, 2014), a to až v slávnom experimente „Waring blender“ Hersheyho a Chasea. (1953) a ďalej, že sa akceptovalo, že DNA je dedičný materiál.

Takže, aby som sa pokúsil odpovedať na vašu otázku, aký bol dôkaz, že proteíny (najmä enzýmy) sú dedičným materiálom?

  1. Bolo známe, že proteíny sú jednou z dvoch zložiek chromozómov (Morange, str. 35)

  2. Tetranukleotidová hypotéza Levene, publikovaná okolo roku 1910, tvrdila, že DNA je tvorená monotónnou, opakujúcou sa jednotkou tetranukleotidu, a to viedlo k myšlienke, že DNA má v chromozóme iba nešpecifické štruktúrne pravidlo (Morange, s. 34).

  3. V tridsiatych rokoch 20. storočia niekoľko enzýmov (vrátane ureázy) vykryštalizovali Northrop a Sumner a jednoznačne sa zistilo, že enzýmy sú proteíny a sú makromolekulárne, čím sa začala veľká éra enzymológie. V porovnaní s dynamickým svetom enzymológie bola DNA považovaná za nudnú.

  4. V roku 1935 Wendell M. Stanley izoloval vírus TMV ako „kryštalický proteín s vlastnosťami vírusu tabakovej mozaiky“ a výsledky publikoval v časopise Science. Kryštalizácia (nesprávne) implikovala čistotu a je pravdepodobne pochopiteľné, že takýto vysoký profil dodal váhu hypotéze, že gény a proteíny sú úzko prepojené. Tento výsledok bol kritizoval však. Bawden & Pirie (1938) v Spojenom kráľovstve experiment zopakovali, ale (na rozdiel od Stanleyho) našli v konečnom produkte 6 % RNA (Morange, s. 65).

  5. Beedle a Tatum (1941) publikovali hypotézu „jeden gén jeden enzým“ a (aby som opäť citoval Morangea) [s. 35] to „posilnilo viac-menej vedomú identifikáciu génov s enzýmami a proteínmi“. Myšlienka, že enzýmy musia byť dôležité v dedičnosti, bola ďalej posilnená prácou Garroda o vrodených chybách metabolizmu, ktorý tiež spájal enzýmy (konkrétne ich nedostatok) s dedičnými faktormi (Fruton, p431).

  6. Averyho práca bola v niektorých častiach ostro kritizovaná, najmä Alfredom E. Mirskym, ktorý poukázal na to, že ako vysvetlenie nemožno vylúčiť stopovú kontamináciu proteínmi. Veľkú správu o kontroverzii s Mirskym ao dôvodoch, prečo sa Averyho práca prijímala len pomaly, podáva Cobb, 2014 [pdf]. Jedna zaujímavá štatistika z tohto článku: Hershley a Chase necitoval žiadne Averyho práce a Hershey povedal, že „výsledky na mňa samého príliš nezapôsobili“ (Cobb, 2014). A to napriek skutočnosti, že prípravok DNA Hersheyho a Chasea obsahoval možno 20 % bielkovín, ale prípravok Averyho a kolegov obsahoval menej ako 0,2 % (Cobb, 2014). Kľúčový dokument v kontroverzii (od Mirksyho) možno nájsť tu [pdf]

J.B.S Haldane uviedol (v roku 1942), že „veľkosť génu je približne taká ako veľkosť molekuly proteínu a je veľmi pravdepodobné, že gény sú proteíny“ (citované podľa Frutona, str. 430).

Zdalo by sa teda, že biochemici považovali proteíny za „svätý grál“ dedičnosti a tento postoj prevládal v niektorých oblastiach ešte dlho po Watsonovi a Crickovi. Morange (s. 232) poukazuje na to, že Arthur Kornberg objavil DNA polymerázu v roku 1958 a v roku 1959 mu bola (spoločne) udelená Nobelova cena. Watson a Crick, ktorých hlavná práca o DNA bola publikovaná v roku 1953, boli tak ocenení až v roku 1962. zaujímavý a možno veľmi odhaľujúci bod.

A keď už hovoríme o Nobelových cenách, Avery žiadnu nedostal (zomrel v roku 1955), možno čiastočne kvôli kontroverzii s Mirským (pozri Cobb). Erwin Chargaff – on z pomerov A/T a G/C – (ktorý prijal Averyho prácu ako základ vo veľmi ranom štádiu) cituje, že Averyho práca si zaslúžila dve Nobelove ceny. A, samozrejme, ani sám Chargaff ho nedostal, čo si určite zaslúžil. Okrem známych pomerov bol Chargaff jedným z prvých, ktorí navrhli, že „rozdiely v proporciách alebo sekvencii niekoľkých nukleotidov tvoriacich reťazec nukleovej kyseliny môžu byť zodpovedné aj za špecifické účinky“ (pozri Cobb).

Fruton (s. 416-417) cituje výrok Francisa Cricka o prijatí dvojitej špirály. "Reakcia mnohých biochemikov, vrátane Josepha Frutona, sa pohybovala od chladnej po tlmenú nevraživosť. Dlho považovali biológiu génu za založenú na proteínoch, nie na nukleových kyselinách, a považovali tento problém za príliš náročný na to, aby sa v blízkej budúcnosti riešil." Nepomohlo ani to, že štruktúru navrhli dvaja ľudia, ktorí zjavne neboli biochemikmi, ktorí nosia karty“. Fruton (s. 417) odmieta tento názor a poukazuje na to, že v ich klasickej učebnici (so Sofiou Simmondsovou) bola Watsonova a Crickova štruktúra pre DNA ľahko prijatá a uzatvára (s. 417), že „môžem sa len domnievať, že Francis, ktorý ukázal Počas môjho pobytu v Cambridge v rokoch 1962 - 1963 som veľmi láskavý, možno som príliš ochotne prijal nejaké plané klebety."

To všetko a ešte viac možno nájsť nielen vo Frutonovi a Morangeovej, ale aj v Judsonovej skvelej knihe Ôsmy deň stvorenia (ktoré momentálne nemusím dávať do ruky).

Upraviť

Po odpovedi na Davidov komentár som vyhrabal niekoľko ďalších citátov Sydney Brennerovej z Biochemistry Strikes Back, ktoré sú tiež (trochu) relevantné.

„V minulých rokoch považovali biochemici väčšinu zvyšku biológie za deskriptívnu vedu a z ešte vznešenejšieho hľadiska fyziky ju Rutherford odmietol ako zbieranie známok.

Počiatky molekulárnej biológie boli poznačené tým, čo sa mnohým zdalo byť arogantným oddelením novej vedy od biochémie. Ľudia ako ja, ktorých žiadosť o prijatie na Katedru biochémie v Cambridge ignorovali a nedostali pozornosť ani zamietavého listu, často vyjadrovali prehnané názory na náš vzťah k biochémii. Náš argument sa však netýkal metód biochémie, ale iba ich zaslepenosti v ignorovaní novej oblasti chémie informácií." (Brenner, 2000)

(Pokračuje a hovorí: „Raz som poznamenal, že dve veci zmizli v roku 1990: jedna bola komunizmus a druhá biochémia a že len jedna by mala byť povolená späť. Samozrejme, že biochémia nikdy nezmizla, ale naďalej prekvitala v tisícoch neprečítaných strán biochemických časopisov") (Brenner, 2000).

Pár skvelých referencií:

Cobb, M (2014) Oswald Avery, DNA a transformácia biológie Current Biology, Volume 24, pR55-R60 free pdf

Fruton, J. S. (1999) Proteíny, enzýmy, gény. Súhra chémie a biológie. Yale University Press.

Judson, H. F. (1996) Ôsmy deň stvorenia. Tvorcovia revolúcie v biológii (25. výročie edn). Cold Spring Harbor Press.

Morange, Michel (1998) História molekulárnej biológie (preložil Matthew Cobb). Harvard University Press


Primárna ciliárna dyskinéza

Primárna ciliárna dyskinéza (PCD) je dedičná porucha, ktorá ovplyvňuje pohyb drobných vlasových štruktúr na telesných bunkách, známych ako riasinky. Cilia sú prítomné na mnohých typoch buniek, najmä na tých v dýchacom trakte. Pri PCD sú mihalnice abnormálne a nepohybujú sa správne. Ľudia s touto poruchou nedokážu vyčistiť hlien a tekutinu v pľúcach a dýchacích cestách. To vedie k častým infekciám dýchacích ciest a neustálemu upchatému nosu a kašľu. Okrem toho, pretože riasinky sa podieľajú na tom, ako sa orgány tvoria a vyvíjajú, mnohí ľudia s PCD môžu mať abnormálne umiestnenie orgánov v tele, známe ako abnormality situ. [1] [2] [3] Napríklad ich srdce môže byť na pravej strane hrudníka namiesto ľavej. Takmer všetci muži s PCD sú neplodní.

PCD je spôsobená mutáciami v jednom z viac ako 30 rôznych génov zapojených do tvorby riasiniek a zvyčajne sa dedí v rodinách autozomálne recesívnym spôsobom. Diagnostikuje sa na základe klinických príznakov. Ďalšie diagnostické testy môžu zahŕňať ciliárnu analýzu a genetické testovanie. Liečba je založená na starostlivosti o symptómy. Dlhodobý výhľad pre ľudí s PCD závisí od závažnosti symptómov. Ľudia s častými pľúcnymi infekciami môžu mať trvalé poškodenie pľúc a vyžadujú transplantáciu pľúc. Včasná diagnostika a liečba môžu zlepšiť dlhodobý výhľad pre ľudí s PCD. [4] [5]


Zdroje chýb v molekulárnych diagnostických analýzach

Úvod

Molekulárna diagnostika prešla v poslednom desaťročí obdobím prudkého rozvoja a rastu. Implementácia nových vysoko komplexných testov a integrácia nových technológií do laboratória klinickej molekulárnej diagnostiky bola rozhodujúca pre pokrok smerom k cieľu dosiahnuť presnú medicínu. Molekulárna diagnostika zahŕňa rôzne oblasti, ako sú infekčné choroby, genetika, farmakogenomika a onkológia, avšak základné princípy a potenciálne zdroje chýb sú medzi týmito rôznymi aplikáciami spoločné. Tu sú diskutované bežné chyby, ktoré sa môžu vyskytnúť pri diagnostických molekulárnych testoch. Rovnako ako v iných častiach klinického laboratória je potrebný silný program kontroly kvality a zabezpečenia kvality na zisťovanie problémov, monitorovanie chýb a implementáciu metód na zabezpečenie kvality.


Referencie

Pare JA, Fraser RG, Pirozynski WJ, Shanks JA, Stubington D

Geisterfer-Lowrance AA, Kass S, Tanigawa G, Vosberg HP, McKenna W, Seidman CE, Seidman JG

Green EM, Wakimoto H, Anderson RL, Evanchik MJ, Gorham JM, Harrison BC, Henze M, Kawas R, Oslob JD, Rodriguez HM a kol.

Charron P, Dubourg O, Desnos M, Isnard R, Hagege A, Millaire A, Carrier L, Bonne G, Tesson F, Richard P a kol.

Maron BJ, Spirito P, Wesley Y, Arce J

Maron BJ, Gardin JM, Flack JM, Gidding SS, Kurosaki TT, Bild DE

Zou Y, Song L, Wang Z, Ma A, Liu T, Gu H, Lu S, Wu P, Zhang dýka Y, Shen dýka L a kol.

Bick AG, Flannick J, Ito K, Cheng S, Vasan RS, Parfenov MG, Herman DS, DePalma SR, Gupta N, Gabriel SB a kol.

Semsarian C, Ingles J, Maron MS, Maron BJ

Nijenkamp LLAM, Bollen IAE, Niessen HWM, Dos Remedios CG, Michels M, Poggesi C, Ho CY, Kuster DWD, van der Velden J

Eberly LA, Day SM, Ashley EA, Jacoby DL, Jefferies JL, Colan SD, Rossano JW, Semsarian C, Pereira AC, Olivotto I a kol.

Rowin EJ, Maron MS, Wells S, Patel PP, Koethe BC, Maron BJ

Lakdawala NK, Olivotto I, Day SM, Han L, Ashley EA, Michels M, Ingles J, Semsarian C, Jacoby D, Jefferies JL a kol.

Watkins H, McKenna WJ, Thierfelder L, Suk HJ, Anan R, O’Donoghue A, Spirito P, Matsumori A, Moravec CS, Seidman JG

Niimura H, Bachinski LL, Sangwatanaroj S, Watkins H, Chudley AE, McKenna W, Kristinsson A, Roberts R, Sole M, Maron BJ a kol.

Thierfelder L, Watkins H, MacRae C, Lamas R, McKenna W, Vosberg HP, Seidman JG, Seidman CE

Levy S, Sutton G, Ng PC, Feuk L, Halpern AL, Walenz BP, Axelrod N, Huang J, Kirkness EF, Denisov G a kol.

Wheeler DA, Srinivasan M, Egholm M, Shen Y, Chen L, McGuire A, He W, Chen YJ, Makhijani V, Roth GT a kol.

Auton A, Brooks LD, Durbin RM, Garrison EP, Kang HM, Korbel JO, Marchini JL, McCarthy S, McVean GA, Abecasis GR

Kong A, Frigge ML, Masson G, Besenbacher S, Sulem P, Magnusson G, Gudjonsson SA, Sigurdsson A, Jonasdottir A, Jonasdottir A a kol.

Palamara PF, Francioli LC, Wilton PR, Genovese G, Gusev A, Finucane HK, Sankararaman S, Sunyaev SR, de Bakker PI, Wakeley J, et al.

Besenbacher S, Liu S, Izarzugaza JM, Grove J, Belling K, Bork-Jensen J, Huang S, Als TD, Li S, Yadav R a kol.

Campbell CD, Chong JX, Malig M, Ko A, Dumont BL, Han L, Vives L, O'Roak BJ, Sudmant PH, Shendure J a kol.

Tennessen JA, Bigham AW, O'Connor TD, Fu W, Kenny EE, Gravel S, McGee S, Do R, Liu X, Jun G a kol.

Daw EW, Lu Y, Marian AJ, Shete S

Daw EW, Chen SN, Czernuszewicz G, Lombardi R, Lu Y, Ma J, Roberts R, Shete S, Marian AJ

Alfares AA, Kelly MA, McDermott G, Funke BH, Lebo MS, Baxter SB, Shen J, McLaughlin HM, Clark EH, Babb LJ a kol.

Richard P, Charron P, Carrier L, Ledeuil C, Cheav T, Pichereau C, Benaiche A, Isnard R, Dubourg O, Burban M a kol.

Millat G, Bouvagnet P, Chevalier P, Dauphin C, Jouk PS, Da Costa A, Prieur F, Bresson JL, Faivre L, Eicher JC a kol.

Helms AS, Thompson AD, Glazier AA, Hafeez N, Kabani S, Rodriguez J, Yob JM, Woolcock H, Mazzarotto F, Lakdawala NK a kol.

Vignier N, Schlossarek S, Fraysse B, Mearini G, Krämer E, Pointu H, Mougenot N, Guiard J, Reimer R, Hohenberg H a kol.

Adalsteinsdottir B, Teekakirikul P, Maron BJ, Burke MA, Gudbjartsson DF, Holm H, Stefansson K, DePalma SR, Mazaika E, McDonough B a kol.

Calore C, De Bortoli M, Romualdi C, Lorenzon A, Angelini A, Basso C, Thiene G, Iliceto S, Rampazzo A, Melacini P

Kubo T, Kitaoka H, ​​Okawa M, Matsumura Y, Hitomi N, Yamasaki N, Furuno T, Takata J, Nishinaga M, Kimura A a kol.

Dhandapany PS, Sadayappan S, Xue Y, Powell GT, Rani DS, Nallari P, Rai TS, Khullar M, Soares P, Bahl A a kol.

Harper AR, Bowman M, Hayesmoore JBG, Sage H, Salatino S, Blair E, Campbell C, Currie B, Goel A, McGuire K a kol.

Poetter K, Jiang H, Hassanzadeh S, Master SR, Chang A, Dalakas MC, Rayment I, Sellers JR, Fananapazir L, Epstein ND

Satoh M, Takahashi M, Sakamoto T, Hiroe M, Marumo F, Kimura A

Carniel E, Taylor MR, Sinagra G, Di Lenarda A, Ku L, Fain PR, Boucek MM, Cavanaugh J, Miocic S, Slavov D, et al.

Rubattu S, Bozzao C, Pennacchini E, Pagannone E, Musumeci BM, Piane M, Germani A, Savio C, Francia P, Volpe M a kol.

Mogensen J, Klausen IC, Pedersen AK, Egeblad H, Bross P, Kruse TA, Gregersen N, Hansen PS, Baandrup U, Borglum AD

Osio A, Tan L, Chen SN, Lombardi R, Nagueh SF, Shete S, Roberts R, Willerson JT, Marian AJ

Ruggiero A, Chen SN, Lombardi R, Rodriguez G, Marian AJ

Chiu C, Bagnall RD, Ingles J, Yeates L, Kennerson M, Donald JA, Jormakka M, Lind JM, Semsarian C

Prondzynski M, Lemoine MD, Zech AT, Horváth A, Di Mauro V, Koivumäki JT, Kresin N, Busch J, Krause T, Krämer E, et al.

Geier C, Gehmlich K, Ehler E, Hassfeld S, Perrot A, Hayess K, Cardim N, Wenzel K, Erdmann B, Krackhardt F a kol.

Hayashi T, Arimura T, Itoh-Satoh M, Ueda K, Hohda S, Inagaki N, Takahashi M, Hori H, Yasunami M, Nishi H a kol.

Friedrich FW, Wilding BR, Reischmann S, Crocini C, Lang P, Charron P, Müller OJ, McGrath MJ, Vollert I, Hansen A a kol.

Christodoulou DC, Wakimoto H, Onoue K, Eminaga S, Gorham JM, DePalma SR, Herman DS, Teekakirikul P, Conner DA, McKean DM a kol.

Lim DS, Roberts R, Marián AJ

Arimura T, Matsumoto Y, Okazaki O, Hayashi T, Takahashi M, Inagaki N, Hinohara K, Ashizawa N, Yano K, Kimura A

Chen SN, Czernuszewicz G, Tan Y, Lombardi R, Jin J, Willerson JT, Marian AJ

Salazar-Mendiguchía J, Ochoa JP, Palomino-Doza J, Domínguez F, Díez-López C, Akhtar M, Ramiro-León S, Clemente MM, Pérez-Cejas A, Robledo M a kol.

Auxerre-Plantie E, Nielsen T, Grunert M, Olejniczak O, Perrot A, Özcelik C, Harries D, Matinmehr F, Remedios CD, Mühlfeld C, a kol.

Matsushita Y, Furukawa T, Kasanuki H, Nishibatake M, Kurihara Y, Ikeda A, Kamatani N, Takeshima H, Matsuoka R

Landstrom AP, Adekola BA, Bos JM, Ommen SR, Ackerman MJ

Chiu C, Tebo M, Ingles J, Yeates L, Arthur JW, Lind JM, Semsarian C

Valdés-Mas R, Gutiérrez-Fernández A, Gómez J, Coto E, Astudillo A, Puente DA, Reguero JR, Álvarez V, Morís C, León D a kol.

Gomez J, Lorca R, Reguero JR, Morís C, Martín M, Tranche S, Alonso B, Iglesias S, Alvarez V, Díaz-Molina B a kol.

Almomani R, Verhagen JM, Herkert JC, Brosens E, van Spaendonck-Zwarts KY, Asimaki A, van der Zwaag PA, Frohn-Mulder IM, Bertoli-Avella AM, Boven LG a kol.

Li L, Bainbridge MN, Tan Y, Willerson JT, Marian AJ

Hayashi T, Arimura T, Ueda K, Shibata H, Hohda S, Takahashi M, Hori H, Koga Y, Oka N, Imaizumi T a kol.

Saltzman AJ, Mancini-DiNardo D, Li C, Chung WK, Ho CY, Hurst S, Wynn J, Care M, Hamilton RM, Seidman GW a kol.

Page SP, Kounas S, Syrris P, Christiansen M, Frank-Hansen R, Andersen PS, Elliott PM, McKenna WJ

Jääskeläinen P, Heliö T, Aalto-Setälä K, Kaartinen M, Ilveskoski E, Hämäläinen L, Melin J, Kärkkäinen S, Peuhkurinen K, Nieminen MS a kol.

Jääskeläinen P, Heliö T, Aalto-Setälä K, Kaartinen M, Ilveskoski E, Hämäläinen L, Melin J, Nieminen MS, Laakso M, Kuusisto J a kol.

Alders M, Jongbloed R, Deelen W, van den Wijngaard A, Doevendans P, Ten Cate F, Regitz-Zagrosek V, Vosberg HP, van Langen I, Wilde A a kol.

Blair E, Price SJ, Baty CJ, Ostman-Smith I, Watkins H

Girolami F, Ho CY, Semsarian C, Baldi M, Will ML, Baldini K, Torricelli F, Yeates L, Cecchi F, Ackerman MJ a kol.

Nagueh SF, McFalls J, Meyer D, Hill R, Zoghbi WA, Tam JW, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Nagueh SF, Bachinski LL, Meyer D, Hill R, Zoghbi WA, Tam JW, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Ameur A, Kloosterman WP, Hestand MS

Rottbauer W, Gautel M, Zehelein J, Labeit S, Franz WM, Fischer C, Vollrath B, Mall G, Dietz R, Kübler W a kol.

Marston S, Copeland O, Jacques A, Livesey K, Tsang V, McKenna WJ, Jalilzadeh S, Carballo S, Redwood C, Watkins H

Tripathi S, Schultz I, Becker E, Montag J, Borchert B, Francino A, Navarro-Lopez F, Perrot A, Özcelik C, Osterziel KJ a kol.

Kraft T, Montag J, Radocaj A, Brenner B

Frischmeyer PA, van Hoof A, O'Donnell K, Guerrerio AL, Parker R, Dietz HC

Siwaszek A., Ukleja M., Dziembowski A

Sarikas A, Carrier L, Schenke C, Doll D, Flavigny J, Lindenberg KS, Eschenhagen T, Zolk O

Schlossarek S, Frey N, Carrier L

Stewart MA, Franks-Skiba K, Chen S, Cooke R

Anderson RL, Trivedi DV, Sarkar SS, Henze M, Ma W, Gong H, Rogers CS, Gorham JM, Wong FL, Morck MM a kol.

McNamara JW, Li A, Smith NJ, Lal S, Graham RM, Kooiker KB, van Dijk SJ, Remedios CGD, Harris SP, Cooke R

Witjas-Paalberends ER, Piroddi N, Stam K, van Dijk SJ, Oliviera VS, Ferrara C, Scellini B, Hazebroek M, ten Cate FJ, van Slegtenhorst M, et al.

Witjas-Paalberends ER, Güçlü A, Nemci T, Knaapen P, Harms HJ, Vermeer AM, Christiaans I, Wilde AA, Dos Remedios C, Lammertsma AA a kol.

Bloemink M, Deacon J, Langer S, Vera C, Combs A, Leinwand L, Geeves MA

Lombardi R, Bell A, Senthil V, Sidhu J, Noseda M, Roberts R, Marian AJ

Nagueh SF, Chen S, Patel R, Tsybouleva N, Lutucuta S, Kopelen HA, Zoghbi WA, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Solaro RJ, Varghese J, Marian AJ, Chandra M

Crilley JG, Boehm EA, Blair E, Rajagopalan B, Blamire AM, Styles P, McKenna WJ, Ostman-Smith I, Clarke K, Watkins H

Kraft T, Witjas-Paalberends ER, Boontje NM, Tripathi S, Brandis A, Montag J, Hodgkinson JL, Francino A, Navarro-Lopez F, Brenner B a kol.

Gupte TM, Haque F, Gangadharan B, Sunitha MS, Mukherjee S, Anandhan S, Rani DS, Mukundan N, Jambekar A, Thangaraj K a kol.

Cordero-Reyes AM, Youker K, Hamilton DJ, Torre-Amione G, Marian AJ, Nagueh SF

Litviňuková M, Talavera-López C, Maatz H, Reichart D, Worth CL, Lindberg EL, Kanda M, Polanski K, Heinig M, Lee M, et al.

Fraysse B, Weinberger F, Bardswell SC, Cuello F, Vignier N, Geertz B, Starbatty J, Krämer E, Coirault C, Eschenhagen T a kol.

Sequeira V, Wijnker PJ, Nijenkamp LL, Kuster DW, Najafi A, Witjas-Paalberends ER, Regan JA, Boontje N, Ten Cate FJ, Germans T a kol.

O'Hanlon R, Grasso A, Roughton M, Moon JC, Clark S, Wage R, Webb J, Kulkarni M, Dawson D, Sulaibeekh L a kol.

Schelbert EB, Piehler KM, Zareba KM, Moon JC, Ugander M, Messroghli DR, Valeti US, Chang C-CH, Shroff SG, Diez J a kol.

Helms AS, Alvarado FJ, Yob J, Tang VT, Pagani F, Russell MW, Valdivia HH, Day SM

Teekakirikul P, Eminaga S, Toka O, Alcalai R, Wang L, Wakimoto H, Nayor M, Konno T, Gorham JM, Wolf CM a kol.

Senthil V, Chen SN, Tsybouleva N, Halder T, Nagueh SF, Willerson JT, Roberts R, Marian AJ

Patel R, Nagueh SF, Tsybouleva N, Abdellatif M, Lutucuta S, Kopelen HA, Quinones MA, Zoghbi WA, Entman ML, Roberts R a kol.

Lim DS, Lutucuta S, Bacireddy P, Youker K, Evans A, Entman M, Roberts R, Marian AJ

Nagueh SF, Kopelen HA, Lim DS, Zoghbi WA, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Kramer CM, Reichek N, Ferrari VA, Theobald T, Dawson J, Axel L

Urbano-Moral JA, Rowin EJ, Maron MS, Crean A, Pandian NG

Monserrat L, Elliott PM, Gimeno JR, Sharma S, Penas-Lado M, McKenna WJ

O'Mahony C, Jichi F, Pavlou M, Monserrat L, Anastasakis A, Rapezzi C, Biagini E, Gimeno JR, Limongelli G, McKenna WJ a kol.

Olivotto I, Cecchi F, Casey SA, Dolara A, Traverse JH, Maron BJ

Siontis KC, Geske JB, Ong K, Nishimura RA, Ommen SR, Gersh BJ

Debonnaire P, Joyce E, Hiemstra Y, Mertens BJ, Atsma DE, Schalij MJ, Bax JJ, Delgado V, Marsan NA

Marián AJ, Asatryan B, Wehrens XHT

Eriksson MJ, Sonnenberg B, Woo A, Rakowski P, Parker TG, Wigle ED, Rakowski H

Klarich KW, Attenhofer Jost CH, Binder J, Connolly HM, Scott CG, Freeman WK, Ackerman MJ, Nishimura RA, Tajik AJ, Ommen SR

Kubo T, Ochi Y, Baba Y, Sugiura K, Takahashi A, Hirota T, Yamanaka S, Yamasaki N, Doi YL, Kitaoka H

Bagnall RD, Weintraub RG, Ingles J, Duflou J, Yeates L, Lam L, Davis AM, Thompson T, Connell V, Wallace J a kol.

Maron BJ, Doerer JJ, Haas TS, Tierney DM, Mueller FO

Sherrid MV, Barac I, McKenna WJ, Elliott PM, Dickie S, Chojnowska L, Casey S, Maron BJ

Maron BJ, Spirito P, Ackerman MJ, Casey SA, Semsarian C, Estes NA, Shannon KM, Ashley EA, Day SM, Pacileo G a kol.

Nishimura RA, Seggewiss H, Schaff HV

Olivotto I, Oreziak A, Barriales-Villa R, Abraham TP, Masri A, Garcia-Pavia P, Saberi S, Lakdawala NK, Wheeler MT, Owens A a kol.

Ho CY, Mealiffe ME, Bach RG, Bhattacharya M, Choudhury L, Edelberg JM, Hegde SM, Jacoby D, Lakdawala NK, Lester SJ a kol.

Tsybouleva N, Zhang L, Chen S, Patel R, Lutucuta S, Nemoto S, DeFreitas G, Entman M, Carabello BA, Roberts R a kol.

Marian AJ, Senthil V., Chen SN, Lombardi R

Shimada YJ, Passeri JJ, Baggish AL, O'Callaghan C, Lowry PA, Yannekis G, Abbara S, Ghoshhajra BB, Rothman RD, Ho CY a kol.

Nagueh SF, Lombardi R, Tan Y, Wang J, Willerson JT, Marian AJ

Maron MS, Chan RH, Kapur NK, Jaffe IZ, McGraw AP, Kerur R, Maron BJ, Udelson JE

Marian AJ, Tan Y, Li L, Chang J, Syrris P, Hessabi M, Rahbar MH, Willerson JT, Cheong BY, Liu CY a kol.

Olivotto I, Camici PG, Merlini PA, Rapezzi C, Patten M, Climent V, Sinagra G, Tomberli B, Marin F, Ehlermann P a kol.

Ho CY, Lakdawala NK, Cirino AL, Lipshultz SE, Sparks E, Abbasi SA, Kwong RY, Antman EM, Semsarian C, González A, et al.


Aplikácia genetického testovania pri hypertrofickej kardiomyopatii na predklinickú detekciu chorôb

Z Agnes Ginges Center for Molecular Cardiology, Centenary Institute, Sydney NSW, Austrália (JI, CB, CS) Central Clinical School, Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS) School of Population Health , Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (AB) a Department of Cardiology, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS).

Z Agnes Ginges Center for Molecular Cardiology, Centenary Institute, Sydney NSW, Austrália (JI, CB, CS) Central Clinical School, Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS) School of Population Health , Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (AB) a Department of Cardiology, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS).

Z Agnes Ginges Center for Molecular Cardiology, Centenary Institute, Sydney NSW, Austrália (JI, CB, CS) Central Clinical School, Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS) School of Population Health , Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Austrália (AB) a Katedra kardiológie, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney NSW, Austrália (JI, CB, CS).

Z Agnes Ginges Center for Molecular Cardiology, Centenary Institute, Sydney NSW, Austrália (JI, CB, CS) Central Clinical School, Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS) School of Population Health , Sydney Medical School, University of Sydney, Sydney NSW, Australia (AB) a Department of Cardiology, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney NSW, Australia (JI, CB, CS).

Hypertrofická kardiomyopatia (HCM) je najčastejším dedičným kardiovaskulárnym ochorením s prevalenciou najmenej 1 z 500 v bežnej populácii. 1,2 HCM je charakterizovaná hypertrofiou ľavej komory pri absencii iných zaťažujúcich stavov, ako je hypertenzia. 3 Charakteristickým znakom HCM je významná klinická heterogenita v prezentácii, siahajúca od asymptomatických pacientov až po tých, ktorí majú najzávažnejšie následky srdcového zlyhania a náhlej srdcovej smrti.

Bolo identifikovaných viac ako 1500 mutácií v najmenej 15 génoch kódujúcich sarkoméry. 4–7 Význam genetického vyšetrenia srdca v klinickej praxi je 2-násobný. Pre probanda môže identifikácia základnej genetickej príčiny v niektorých prípadoch objasniť príčinu hypertrofie, napríklad objasnenie fenokópií, ako je PRKAG2-glykogénová choroba a Fabryho choroba. Najväčšia využiteľnosť je však v kaskádovom genetickom testovaní asymptomatických príbuzných s jasným prínosom buď pre potvrdenie hraničnej klinickej diagnózy, alebo podozrivých klinických zmien naznačujúcich skoré ochorenie, alebo čo je najdôležitejšie, vylúčenie ochorenia u tých, ktorí testujú génovo negatívny. Identifikácia tichého génového nosiča bude viesť kaskádové testovanie ďalších členov rodiny, čím sa objasní ich rizikový stav. Najväčším prínosom je, že negatívny genetický výsledok môže potomkov uistiť, že im HCM nehrozí.

Eskalácia nášho chápania genetického základu HCM bola katalyzovaná implementáciou technológií sekvenovania novej generácie. V reakcii na rýchlejšie a cenovo dostupnejšie testovanie komerčné genetické testovanie na HCM v súčasnosti často zahŕňa obrovské srdcové génové čipy (tj 50 – 200 alebo viac génov). Tento prístup, aj keď je komplexný, tiež upriamuje pozornosť na obmedzenia našich súčasných vedomostí. Výzvy kardiologického genetického testovania sú čoraz viac dokumentované, ako je identifikácia variantov neurčitého významu (VUS), náhodné genetické nálezy, 8 reklasifikácia variantov, 9 zvýšená potreba predtestového genetického poradenstva 10 a vhodné začatie liečby u génových nosičov.

Napriek výzvam nemožno podceňovať výhodu vedomia s určitou istotou, že rodinný príslušník nie je nositeľom rodinnej mutácie a môže byť prepustený z klinického dohľadu a obáv. Čo to na druhej strane znamená pre asymptomatického príbuzného, ​​o ktorom sa hovorí, že je nositeľom génu? Máme jedinečnú príležitosť odhaliť včasné predklinické ochorenie, čo umožňuje terapeutickú intervenciu, aby sa zabránilo najhorším výsledkom? Alebo spôsobujeme zbytočné škody a starosti jednotlivcovi, u ktorého by sa nikdy nerozvinula klinicky významná choroba? V našej snahe predchádzať chorobám a liečiť ich včas, prehliadame rastúce zaťaženie zdrojov a nákladov zdravotnej starostlivosti? Vplyv kaskádového genetického testovania meraného výhodami a škodami zostáva do značnej miery neznámy (obrázok 1), ale mal by byť kľúčovou zložkou pri usmerňovaní najefektívnejšieho a najvhodnejšieho využitia tejto technológie.

Postava 1. Zváženie výhod a nevýhod predklinickej detekcie ochorení pre hypertrofickú kardiomyopatiu. HR-QoL označuje kvalitu života súvisiacu so zdravím.

Nadmerné používanie diagnostických testov a následná nadmerná diagnóza sa čoraz viac uznáva ako hlavný vedľajší účinok technologického pokroku. Týka sa to všetkých medicínskych odborov a často sa to prejavuje v prostredí nových vznikajúcich technológií, ako sú nové zobrazovacie modality na detekciu rakoviny alebo nevhodné používanie populačných skríningových testov, ako je testovanie antigénu špecifického pre prostatu pri včasnej detekcii rakoviny prostaty. 11 Odhaduje sa, že v roku 2011 sa v Spojených štátoch minulo 158 až 226 miliárd USD na nepotrebnú zdravotnú starostlivosť s nízkou hodnotou. 12 Iniciatívy ako Choosing Wisely vyzývajú lekárov a pacientov, aby si položili otázku, či je nariadený test alebo postup podložený dôkazmi, bez poškodenia a skutočne potrebný. 13

Cieľom tohto prehľadu je poskytnúť základ pre dôležitosť hodnotenia prínosov a poškodení nových technológií a načrtnúť dôkazy pre aplikáciu genetického testovania HCM ako prediktívneho nástroja pre asymptomatických členov rodiny. Niet pochýb o tom, že genetické testovanie, ak sa používa správne, poskytuje výkonný nástroj na diagnostiku a manažment. Adekvátne zváženie možných škôd však zabezpečí, že túto technológiu budeme aj naďalej používať efektívnym a udržateľným spôsobom. Navrhujeme praktické opatrenia, ktoré môžu minimalizovať potenciálne škody a umožniť realizáciu pozitívnych aspektov genetickej diagnózy.

Nové technológie genetického testovania a komplexnosť genetických údajov

Počas histórie medicíny došlo ku kľúčovým objavom, ktoré spôsobili revolúciu v starostlivosti o pacientov. To zahŕňa aplikáciu nových technológií, ktoré ponúkajú skoršiu a presnejšiu detekciu chorôb, od objavu diagnostického ultrazvuku až po zobrazovanie srdcovej magnetickej rezonancie, čo umožňuje vizualizáciu srdcových štruktúr v oveľa väčšom detaile, než by sme si doteraz dokázali predstaviť. Schopnosť presnejšie diagnostikovať štrukturálne ochorenie srdca znamená, že sa môžu začať vhodné stratégie manažmentu s celkovo zlepšenou liečbou pacienta. Aj keď je to ideálny scenár, nie všetky nové technológie poskytujú rovnaké celkové výhody a niektoré skutočne spôsobujú zbytočné škody. Posúdenie nových technológií pred ich rozsiahlou integráciou do klinickej praxe je nevyhnutné pre udržateľný zdravotný systém s cieľom definovať, ako by sa mohli rozumne využívať, využívať výhody a zároveň minimalizovať potenciálne škody.

Škody môžu vzniknúť tam, kde sa diagnostický test vykoná bez dôkazov o prínose (nadužívanie), čo vedie k tomu, že zdraví ľudia budú označení ako ohrození alebo chorí (nadmerná diagnóza) a ďalší ľudia sú zbytočne liečení (nadmerná liečba). Čistým výsledkom sú značné výdavky na zdravotnú starostlivosť s malým alebo žiadnym prínosom pre zdravie. V atmosfére sprísňovania výdavkov na zdravotnú starostlivosť by sa tieto zdroje mohli prideliť na užitočnejšie účely. Je potrebné zvážiť aj dodatočné náklady vrátane psychosociálnych a fyzických poškodení jednotlivca. V niektorých prípadoch môžu vzniknúť aj náhodné nálezy z testovania, teda nálezy, ktoré nesúvisia s konkrétnym ochorením, ale často si vyžadujú ďalšie vyšetrenie. Hoci existuje potenciál pre poškodenie v dôsledku mnohých nových diagnostických testov, kritické sú informovanosť a prísne pokyny týkajúce sa vhodného použitia.

V HCM technológie sekvenovania novej generácie zmenili naše chápanie genetického základu ochorenia a možností, ktoré majú naši pacienti k dispozícii. Základ technológie, masívne paralelné sekvenovanie, výrazne znížil čas a náklady potrebné na vykonávanie genetických testov. 14 Hoci aplikácia týchto technológií na panely klinického genetického testovania srdca pokročila rýchlo, naša schopnosť interpretovať generované údaje o variantoch zaostáva z dôvodu základného nepochopenia biologických mechanizmov, ktoré sú základom identifikovaných génov chorôb a genetických variantov. V ľudskom genóme už bolo hlásených viac ako 80 miliónov genetických variantov (www.1000genomes.org). U jedného zdravého človeka možno identifikovať viac ako 200 zriedkavých variantov, ktoré môžu spôsobiť ochorenie, a 12 až 20 variantov, ktoré možno hlásiť. 15,16 Interpretácia informácií o variantoch na klinické použitie je preto problematická. Medzi základnými génmi HCM existuje nízka tolerancia voči genetickým variáciám 17, a preto je počet variantov identifikovaných na vzorku vo všeobecnosti malý, čo však nemusí nevyhnutne platiť pre mnohé iné gény exprimované v srdci zahrnuté vo veľkých paneloch. Pravdepodobná povaha variantnej interpretácie je dobre opísaná, 10, 18 kde sa genetické výsledky zvažujú pozdĺž kontinua od benígneho po VUS, pravdepodobne patogénne a patogénne, a nie binárne (áno/nie) výsledky (tabuľka). Odovzdanie tohto výsledku rodine môže byť výzvou a genetické poradenstvo pred testom je nevyhnutné na zabezpečenie dôsledkov a pochopenie potenciálnych výsledkov genetických testov pred objednaním testovania. 19,20

Tabuľka. Rozsah výsledkov genetického testovania pre probanda a rodinu

HCM indikuje hypertrofickú kardiomyopatiu a VUS: variant neurčitého významu. Upravené podľa Ingles et al. 10

Najnovšie Americká vysoká škola lekárskej genetiky a genomiky navrhla usmernenia na určenie patogenity sekvenčných variantov pri Mendelovej chorobe. Dôkazy o príčinnej súvislosti sú založené na mnohých faktoroch, vrátane vzácnosti v populačných databázach, identifikácie u viacerých nepríbuzných pacientov so zodpovedajúcimi fenotypmi, kosegregácie s klinickým ochorením, zhody medzi modelmi in silico a konzervačných skóre prerušenia funkcie proteínu a ďalších. 21 Posun k prísnejšej klasifikácii variantov zdôraznil potrebu spoločného úsilia centralizovať údaje o variantoch a maximalizovať vyhliadky na priradenie príčinných súvislostí, informácií, ktoré sú klinicky relevantné pre rodinu. The National Institutes of Health-Financed Clinical Genome Resource (ClinGen) 22 poskytuje platformu na dosiahnutie tohto cieľa v globálnom meradle s hlavným cieľom zdieľať údaje a poznatky o genetických variantoch prostredníctvom verejne dostupnej stránky ClinVar (www.clinvar.com) .

Včasná genetická diagnostika a potenciál prevencie chorôb

Prípad 1: Zdravá 10-ročná žena utrpela zástavu srdca, keď bežala, aby stihla vlak. Je úspešne resuscitovaná a pri vyšetrení srdca sa zistilo, že má HCM s asymetrickou hypertrofiou ľavej komory 22 mm. Jej rodina je informovaná, že majú 50% riziko dedičnosti a podrobujú sa klinickému dohľadu. Zistilo sa, že jej otec je postihnutý, zatiaľ čo jej matka a bratia nevykazujú žiadne známky choroby. Uskutoční sa genetické testovanie a identifikuje sa génový variant MYBPC3 NM_000256.3:c.1484G>A, p.Arg495Gln. Tento variant bol predtým hlásený u niekoľkých nepríbuzných pacientov s HCM 23, 24 a je pozorovaný s nízkou frekvenciou v databáze Exome Aggregation Consortium (ExAC, http://exac.broadinstitute.org) a in silico predikčné modely/konzervačné skóre sú v dohody a podporovať škodlivú úlohu. Okrem toho boli u pacientov s HCM hlásené aj zmeny sekvencie Arg495Gly a Arg495Trp. Na základe tohto dôkazu bol variant klasifikovaný ako pravdepodobne patogénny a členom rodiny bolo ponúknuté kaskádové genetické testovanie. Po starostlivom predtestovom genetickom poradenstve je jej 16-ročný brat, súťaživý basketbalový hráč, napriek bežným klinickým vyšetreniam identifikovaný ako nosič génov.

Prevencia chorôb zostáva základným kameňom medicíny a intenzívnym zameraním úsilia v oblasti verejného zdravia. Včasná detekcia ochorenia, najmä v predklinickej asymptomatickej fáze, poskytuje príležitosť zasiahnuť pomocou stratégií prevencie alebo liečby na zníženie celkovej morbidity a mortality ochorenia. V roku 1968 Wilson a Jungner napísali: „Ústredná myšlienka včasnej detekcie a liečby chorôb je v podstate jednoduchá. Cesta k jeho úspešnému dosiahnutiu (na jednej strane priviesť k liečbe ľudí s predtým nezisteným ochorením a na druhej strane vyhnúť sa ublíženiu tým osobám, ktoré liečbu nepotrebujú) nie je ani zďaleka jednoduchá, hoci sa niekedy môže zdať zdanlivo jednoduchá. “. 25 Intuitívne skoré odhalenie ochorenia pravdepodobne zlepší zdravotné výsledky. Ukázalo sa napríklad, že včasné zistenie vysokého cholesterolu a následná úprava životného štýlu a farmakologická liečba znižujú kardiovaskulárnu morbiditu aj mortalitu. Avšak niekoľko nedávnych príkladov, ako je skríning prostatického špecifického antigénu pri rakovine prostaty, spochybnilo zovšeobecnenie takýchto prístupov. Bez dôkazov o prínose sa čoraz viac uznáva, že možno vytvárame novú populáciu zdravých pacientov, teda ustaraných studní alebo čakajúcich pacientov.

Predklinická detekcia HCM sa rutinne vykonáva na celom svete ako výsledok kaskádového genetického testovania asymptomatických rizikových členov rodiny. Pri chorobe s výraznou klinickou heterogenitou, ktorá sa často vyvíja počas dospievania alebo po ňom, klinický význam pozitívneho výsledku génu úplne závisí od veku člena rodiny. U tých, ktorí sú identifikovaní ako deti, existuje väčšia pravdepodobnosť rozvoja klinického fenotypu, hoci v súčasnosti v klinickej praxi neexistujú žiadne terapie na prevenciu alebo zmenu rozvoja hypertrofie ľavej komory. Pre tých, ktorí boli testovaní po tomto veku, teda pre dospelých, sa prístup k riadeniu týchto ľudí vyvinul v priebehu posledného desaťročia a prešiel z konzervatívneho pohľadu, že sú súčasťou spektra HCM a mali by byť liečení a mali by sa obmedziť na cvičenie na vysokej úrovni. k modernejšej stratégii bdelého čakania.

O prirodzenej histórii a výsledkoch tichých génových nosičov je známe len málo, čo vytvorilo niekoľko klinických dilem, vrátane frekvencie klinického sledovania a toho, či by jednotlivcom mali byť zakázané športovať. 26 Malé retrospektívne štúdie naznačujú, že tiché génové nosiče majú benígny klinický priebeh spojený s nízkym rizikom náhlej srdcovej smrti a nízkou pravdepodobnosťou rozvoja manifestného ochorenia po dosiahnutí dospelosti. 26–28 Doposiaľ najväčšia séria pacientov skúmala 339 tichých nosičov génov. 28 Z tých, ktorí absolvovali následné klinické vyšetrenia počas obdobia štúdie, sa u 29 zo 162 (18 %) vyvinul fenotyp. Celkovo nízky výskyt závažných srdcových príhod u pacientov bez manifestnej HCM poskytuje dôvod na menej časté klinické hodnotenie. 28 Klinicky je kľúčovým odporúčaním pre túto skupinu celoživotné klinické sledovanie, aj keď existuje nezhoda, či by sa mali zúčastňovať súťažných športov na vysokej úrovni, a preto sa odporúča zvážiť to od prípadu k prípadu. 3,29,30

Psychologický vplyv ohrozenia HCM bol študovaný 31–33, avšak vplyv na tichých génových nosičov je menej dobre pochopený. Neoficiálne skúsenosti z kliniky sú také, že za predpokladu, že existuje dobrá podpora a genetické poradenstvo pred testom, väčšina pacientov sa dobre prispôsobí pozitívnemu stavu nosiča. V sérii 89 tichých génových nosičov bola kvalita života a psychická pohoda (úzkosť a depresia) súvisiaca s vlastným zdravím buď podobná alebo výrazne lepšia ako normatívne údaje všeobecnej populácie. 34 Najsilnejšími indikátormi nízkej fyzickej kvality života bol rozvoj manifestných ochorení a vnímané negatívne dôsledky génového nosičstva. Skúmala sa aj motivácia pre vykonávanie kaskádového genetického testovania medzi členmi rodiny. Christiaans et al skúmali nositeľov mutácií, pokiaľ ide o ich skúsenosti s podstúpením kaskádového genetického testovania, pričom 90 % uviedlo, že „pretože je to dedičné a chcel som to vedieť“, 87 % „pretože som to chcel vedieť sám“ a 67 % „pretože deti“ ako dôvod podrobiť sa testovaniu. 35 95 % účastníkov bolo spokojných s procesom genetického testovania v multidisciplinárnom kardiologickom genetickom prostredí a len 4 % uviedli, že ľutujú zistenie, že sú nositeľmi mutácie.

Pri chorobe, ktorá sa nedá vyliečiť a ktorá vedie k zdanlivo nezvratnej hypertrofii, fibróze a poruche kardiomyocytov v ľavej komore, sa dlhodobý cieľ výskumu vždy zameriaval na prevenciu chorôb pri HCM. V tomto prostredí je veľmi žiadaná efektívna identifikácia zdravých jedincov, ktorí pravdepodobne konvertujú na fenotyp HCM, s potenciálom poskytnúť väčšie terapeutické okno na začatie stratégií včasnej prevencie. Títo jedinci predstavujú skutočnú príležitosť vyvinúť liek. Štúdie na zvieracích modeloch HCM ukázali, že včasná liečba farmakologickými látkami, ako je diltiazem 36 a losartan, 37 môže zabrániť nástupu ochorenia alebo oddialiť progresiu. Najnovšie predbežné štúdie u tichých génových nosičov s HCM ukázali, že predklinická liečba môže zlepšiť skorú remodeláciu ľavej komory pri HCM, 37 s niekoľkými ďalšími randomizovanými kontrolnými štúdiami, ktoré v súčasnosti prebiehajú (ako je HALT [Hypertrophic Regression with N-Acetylcysteine ​​in HCM], LIBERTY [Účinok eleklazínu (GS-6615) na cvičebnú kapacitu u subjektov so symptomatickou HCM] a štúdie VANISH [Valsartan na zmiernenie evolúcie ochorenia v ranom sarkomérnom HCM] http://clinicaltrials.gov). Štúdia INHERIT (Inhibícia renínového angiotenzínového systému s losartanom u pacientov s HCM), nedávna randomizovaná štúdia losartanu, blokátora angiotenzínových receptorov, ktorá už predtým vykazovala sľubné výsledky u transgénnych myší,38 nepreukázala žiadnu regresiu ochorenia, poukázala však na niektoré dôležité body. 39 Po prvé, úspešne sa preukázala uskutočniteľnosť veľkých multicentrických štúdií, ktoré sa kedysi považovali za nemožné pre relatívne zriedkavé ochorenie. Po druhé, predklinické štádium ochorenia je ďalej zdôraznené ako kritické okno pre účinnú intervenciu a štúdia VANISH je skutočne zameraná na tento časový bod. Namiesto použitia regresie ochorenia ako primárneho koncového bodu sa táto štúdia zameriava na prevenciu nástupu ochorenia, čo, ak sa dosiahne, bude vzrušujúcim krokom vpred.

Prínos eliminácie rizika a neistoty

Prípad 2: 42-ročný muž, ktorému bola ako tínedžerovi diagnostikovaná HCM, skolaboval pri cvičení a nedal sa resuscitovať. Bol zdatný muž a pravidelne nenavštevoval svojho kardiológa, pretože sa nikdy necítil zle. Kvôli obmedzenému prístupu ku genetickému testovaniu v roku 2002 sa 44-ročný brat zosnulej zúčastnil pravidelného klinického skríningu. Tieto vyšetrenia nepreukázali dôkaz o chorobe, ale to nezmierňuje jeho úzkosť týkajúcu sa rizika pre jeho deti. Výskumné genetické testovanie nedávno identifikovalo známy patogénny variant v MYBPC3 NM_000256.3:c.772G>A, p.Glu258Lys. Tento variant bol hlásený u mnohých nepríbuzných probandov HCM, ukázalo sa, že kosegreguje s ochorením vo viacerých rodinách a ovplyvňuje konsenzuálnu sekvenciu zostrihu na konci exónu 6, čo vedie k predčasnému skráteniu proteínu. 40,41 Brat podstúpil komplexné genetické poradenstvo pred testom a rozhodol sa pre kaskádové genetické testovanie, kde sa zistilo, že je génovo negatívny. Nesmierne sa mu uľavilo, keď s istotou vedel, že jeho a jeho deti nepostihne rovnaký osud ako jeho brata. Okrem toho by pri celoživotnom klinickom skríningu nevznikli žiadne priebežné náklady a využívanie zdrojov.

Najväčší a klinicky relevantný prínos genetického výsledku je pre rodinu 4 a konkrétnejšie v identifikácii členov rodiny, ktorí nie sú nositeľmi mutácie po kaskádovom genetickom testovaní. Genetické testovanie, na rozdiel od mnohých iných technológií, ponúka jedinečnú príležitosť skutočne vylúčiť riziko ochorenia kvôli špecifickému variantu. To môže byť užitočné pri riadení rodiny, so schopnosťou zastaviť prebiehajúce klinické vyšetrenia a zmierniť neistotu a obavy. Nie je prekvapením, že zdravotné ekonomické analýzy na určenie prírastkovej účinnosti genetického testovania HCM oproti samotnému klinickému skríningu zistili, že génovo negatívni jedinci sú jedným z kľúčových dôvodov celkovej priaznivej nákladovej efektívnosti. 42,43 Prepustenie člena rodiny z klinického skríningu si vyžaduje značnú dôveru v patogenitu variantu identifikovaného u probanda a zdôrazňuje kritický význam robustných metód klasifikácie variantov. Ak je variant neistý, nemal by sa použiť na kaskádové genetické testovanie členov rodiny (tabuľka). Dôležité je, že pacientovi treba pripomenúť, že riziko vzniku ochorenia u neho nie je nulové a že riziko zostáva nízke (tj rovnaké ako u bežnej populácie), pretože nemôžeme vylúčiť prítomnosť netestovaných variantov modifikátorov.

Reklasifikácia variantov a vplyv na klinickú relevanciu

Prípad 3: 52-ročný muž s dlhodobou diagnózou HCM a známou rodinnou anamnézou ochorenia podstúpil genetické testovanie. Identifikovali sa dva varianty, známy patogénny posun rámca v MYBPC3 NM_000256.3: c.2864_2865delCT, p.Pro955Argfs, hlásený u viacerých nepríbuzných probandov HCM a spôsobujúci predčasné skrátenie proteínu 44 a deléciu v TCAP NM_0036. 37_39delGAG, p.Glu13del, v tom čase hlásené ako pravdepodobne patogénne. Probandova sestra vo veku 40 rokov a bez klinických dôkazov o chorobe podstúpila predtestové genetické poradenstvo a rozhodla sa pre kaskádové genetické testovanie. Vzhľadom na to, že existovali 2 varianty, existovala šanca 3 ku 4, že zdedí aspoň 1 z variantov. 45 Zistilo sa, že je nositeľkou len delécie TCAP, teda delécie jedinej aminokyseliny, a hoci to bolo predtým hlásené u nepríbuzných probandov HCM, je pozorované aj pri frekvencii 2 % National Heart, Lung a Blood Institute Exome Sequencing Project a ďalšie hlásené kontrolné populácie, čo naznačuje pravdepodobnú benígnu úlohu. 46 Preklasifikovanie tohto variantu znamenalo, že nositeľský status sestry probanda bol nesprávny a že ona a jej deti v skutočnosti neboli vystavené riziku ochorenia.

S novými poznatkami nastáva zmena v našom chápaní príčin a patogenézy chorôb. Hoci boli vyvinuté a zdokonalené systémy interpretácie a klasifikácie variantov, musia brať do úvahy rýchlo sa vyvíjajúce ľudské genetické databázy, ako je databáza ExAC, projekt 1000 genómov, server Exome Variant Server a najnovšie aj projekt Genomics England 100 000 Genomes Project. Všetky tieto databázy vznikli vďaka dramatickému a rýchlemu pokroku v genetických technológiách. Hoci akonáhle by sme boli spokojní s tým, že by potenciálne patogénny variant chýbal v 200 kontrolných alelách, teraz často porovnávame s viac ako 50 000 kontrolnými exómami a genómami. Výsledkom je, že v priebehu času sa stav variantu môže zmeniť a môže byť znížený z patogénneho na VUS alebo benígny alebo v niektorých prípadoch upgradovaný z VUS na patogénny. To môže byť paralelné s predstavou falošne pozitívneho, nie v zmysle technického sekvenovania falošne pozitívneho, ale s variantnou interpretáciou, ktorá bola spočiatku pacientovi sprostredkovaná ako pozitívny výsledok, ale následne sa zistilo, že je falošný. V HCM sa odhaduje, že k tejto reklasifikácii dôjde najmenej u 10 % rodín 9 , hoci pri použití prísnejších kritérií klasifikácie variantov by sa dalo očakávať, že v budúcnosti to bude oveľa menej časté. Napriek tomu zdôrazňuje dôležitosť pravidelného prehodnocovania (každé 1–2 roky) všetkých variantov pri stanovovaní rýchlo sa rozvíjajúcich údajov všeobecnej populácie.

Klinické dôsledky náhodných nálezov génových variantov

Prípad 4: Rodina prichádza na špecializovanú srdcovú genetickú kliniku po identifikácii náhodného genetického nálezu v AKAP9 NM_005751.4:c.4342A>G, p.Ile1448Val počas celého sekvenovania exómu na vyšetrenie benígnej dedičnej chorey. AKAP9 je gén zodpovedný za LQT11, 47 a nález VUS pri syndróme potenciálne smrteľnej srdcovej arytmie vyvoláva množstvo kardiologických vyšetrení a segregačných štúdií medzi členmi rodiny. U žiadneho člena rodiny sa nezistil žiadny klinický dôkaz syndrómu dlhého QT intervalu a boli ubezpečení, že variant AKAP9 pravdepodobne nebude mať klinický význam. Nebolo odporúčané žiadne ďalšie vyšetrovanie. Po troch rokoch je známe, že tento variant je prítomný vo všeobecnej populácii s frekvenciou 0,05 % v databáze ExAC a variant bol znížený na pravdepodobný benígny stav.

Objavenie klinicky použiteľného nálezu počas vyšetrovania nesúvisiaceho problému nie je v medicíne novým konceptom. Príklad pľúcnej lézie identifikovanej počas rutinného zobrazovania srdcových štruktúr je dobre opísaný. Nastáva etická dilema, pri ktorej môžu vzniknúť problémy týkajúce sa preferencií pacienta prijímať neočakávané informácie, vzniknutej neistoty a strachu a rozhodnutí zdravotníckeho pracovníka, ktoré pravdepodobne vedú pacienta na cestu dodatočného testovania. Našou reflexnou reakciou na takéto zistenia je často obrovská vďačnosť, že ochorenie bolo zistené včas, a horlivosť urobiť všetko pre to, aby sa predišlo nepriaznivým výsledkom, a to zo strany pacienta aj lekára. Tento existenčný strach zo smrti poháňa veľkú časť reakcie na neistú diagnózu 48 a pre lekárov môže existovať dodatočný strach zo súdneho sporu, ak neurobia všetko, čo je v ich silách. Reakcia na náhodný nález je preto rovnakou súčasťou problému. V našom príklade náhodnej pľúcnej lézie zistenej počas rutinného zobrazovania, aj keď je cesta vyšetrovania, ktorá nasleduje, sporná, ide o dobre vyšľapanú cestu. Náhodné zistenia v genetickej medicíne predstavujú oveľa väčšiu neistotu, pričom sa málo vie, či je variant skutočne schopný spôsobiť ochorenie. 49

Náhodné genetické nálezy sú čoraz realitou v srdcovej genetike a predstavujú etickú výzvu. 50,51 Hoci klinický náhodný nález môže byť vyriešený rýchlo (napr. pečeňová lézia zistená počas pľúcneho počítačového tomografického vyšetrenia sa rýchlo vyrieši ako benígna cysta na ultrazvukovom zobrazení pečene), náhodné genetické nálezy môžu potenciálne zostať nevyriešené niekoľko rokov, pretože znalosti o géne alebo špecifickej mutácii je zle pochopený. Za najextrémnejších okolností budú náhodné genetické nálezy zahŕňať hlásenie dôležitých variantov nekardiálnych génov (napr. familiárnych rakovinových génov), a preto budú mať za následok, že pacientovi budú poskytnuté informácie úplne nesúvisiace s účelom genetického testu. Je ťažké tvrdiť, že ide v skutočnosti o neočakávané alebo náhodné výsledky, keď sa použije sekvenovanie celého exómu alebo celý genómový sekvenčný prístup skríningu všetkých 22 000 génov, a z tohto dôvodu existuje posun k uznaniu týchto výsledkov ako sekundárnych genetických výsledkov 49 a zdôrazňuje úlohu genetického poradenstva pred testom 10,52 a informovaného súhlasu. 53

Odporúčania American College of Medical Genetics and Genomics týkajúce sa hlásenia náhodných nálezov v klinickom exóme a sekvenovaní genómu kontroverzne poskytujú zoznam 56 génov, v ktorých by mali byť funkčné varianty hlásené späť pacientovi, bez ohľadu na účel testu a pacienta. preferencie pre poznanie týchto informácií. 51 Tieto hlásené varianty predstavujú veľkú klinickú výzvu, pričom na zdravého jedinca bolo identifikovaných 12 až 20 klinicky hlásených variantov, 15 a u 3 % až 5 % pacientov odoslaných na vyšetrenie fenotypu ochorenia. 54

Problematika náhodných genetických nálezov sa neobmedzuje len na sekvenovanie celého exómu/sekvenovanie celého genómu. Testovanie panelu srdcových génov môže tiež predstavovať výzvy neočakávaných zistení. Častejšie u probandov, ktorí majú genetický test na HCM, budú hlásené varianty v iných srdcových génoch, čo zatemňuje hodnotu výsledku. Tento jav má za následok zmätok pre pacienta, ale tiež zvyšuje zložitosť odpovede lekára pri skúmaní týchto výsledkov. Napríklad pacient s HCM, ktorý vráti výsledok VUS v DSP gén môže predstavovať klinickú dilemu. DSP je desmozómový gén spojený s arytmogénnou kardiomyopatiou pravej komory, ochorením klinicky odlišným od HCM. Je teda nepravdepodobné, že by nový, zriedkavý variant missense v DSP bol príčinou ochorenia u osoby s HCM, a skutočne je známe, že tento gén je do istej miery tolerantný voči variáciám. 55 Napriek tomu existuje trend vykonávať v týchto rodinách ďalšie vyšetrenia srdca pri hľadaní fenotypu, ktorý by mohol vysvetliť neistý genetický výsledok. Stratégie na minimalizáciu náhodných a neistých zistení (t. j. cielenejšie génové panely) a manažment rodiny vo vysokoobjemových špecializovaných klinikách s expertízou na genetiku HCM určite minimalizujú následné poskytovanie lacnej a nákladnej zdravotnej starostlivosti.

Vyvážený prístup ku genetickému testovaniu HCM: 6 kľúčových bodov

Hoci môže existovať nedostatok dôkazov, ktoré by naznačovali, že včasná detekcia ochorenia pri HCM má celkový prínos, účelom tohto prehľadu nie je odradiť lekárov od skutočnej hodnoty genetického testovania pri HCM a iných dedičných srdcových ochoreniach. Dúfame, že sme si posvietili na potenciálne obmedzenia, aby sa táto technológia dala použiť najefektívnejším a najvhodnejším spôsobom s celkovým cieľom dosiahnuť určité zlepšenie v klinickej starostlivosti. Nasledujúcich 6 bodov načrtáva kľúčové praktické klinické dôsledky, ktoré slúžia ako návod, ako sa vyhnúť niektorým nástrahám genetického testovania a minimalizovať poškodenie pacienta (obrázok 2).

Obrázok 2 Šesť bodov na minimalizáciu potenciálneho poškodenia genetického testovania hypertrofickej kardiomyopatie. VUS označuje variant neurčitého významu.

Vyberte si vhodný genetický test

Pri množstve komerčne dostupných genetických testov je výber najvhodnejšieho testu veľmi dôležitý. Obmedzenie vašej analýzy na menší počet génov (tj cielené panely v rámci širších prístupov, ako je sekvenovanie klinického exómu/genómu) zníži počet neistých a náhodných variantov. V podmienkach probanda s potvrdenou klinickou diagnózou HCM je skríning 10 až 15 génov úplne postačujúci. Vykonávanie genetických testov, ktoré v tomto prípade zahŕňajú viac génov, je potrebné spochybniť, hoci je to čoraz ťažšie, pretože laboratóriá pokračujú v rozširovaní dostupných génových panelov.Dôležitou výnimkou sú však rodiny s viacerými postihnutými jednotlivcami, čo umožňuje segregáciu neistých variantov na objasnenie príčinnej súvislosti, hoci tento prístup môže byť vhodnejší pre prostredie výskumu.

Buďte si istí, že variant identifikovaný u probanda skutočne spôsobuje ochorenie

Ak existujú pochybnosti o patogenite variantu u probanda, v rodine by sa nemalo vykonávať žiadne kaskádové genetické testovanie. Takéto zistenia VUS si vyžadujú ďalšie posúdenie a prehodnotenie a často tvoria základ prebiehajúcich výskumných štúdií. Pre lekára bez odborných znalostí v oblasti genetiky existujú niektoré všeobecné aspekty variantu, ktoré môžu pôsobiť ako varovný signál pre spochybnenie výsledku. Po prvé, hlásený variant by mal byť v géne, ktorý sa predtým podieľal na HCM. Po druhé, variant mal byť v mnohých prípadoch hlásený už predtým u nepríbuzných probandov s potvrdenou HCM, hoci výnimky z tohto sa môžu vyskytnúť pri radikálnych mutáciách, čo vedie k strate funkcie v géne, o ktorom je známe, že vedie k ochoreniu, napr. MYBPC3. Po tretie, variant by mal byť v databázach všeobecnej populácie mimoriadne zriedkavý a môže sa prehodnotiť, keď sa online uverejnia nové väčšie súbory údajov. Nie sú to kritériá bezpečné pre zlyhanie, ale mali by slúžiť ako návod na spochybnenie laboratórnych klinických správ o variantoch. Ak si máme uvedomiť niektorú z výhod genetického testovania HCM, musíme sa vyhnúť založeniu kaskádového genetického testovania na nesprávnych výsledkoch génových variantov.

Nie každý člen rodiny potrebuje kaskádové genetické testovanie

Kaskádové genetické testovanie rizikových členov rodiny je potrebné zvážiť od prípadu k prípadu. Je nevyhnutné zvážiť potenciálne prínosy s možnosťou spôsobenia škody. Kľúčom k tomuto rozhodnutiu sú preferencie člena rodiny. To, ako môže laik porozumieť komplexnej genetickej informácii a rozhodovať sa o nej, nie je dobre študované, ale musí sa stať prioritou, ak dúfame, že uľahčíme informovaný výber. Pre mnohých môžu byť spokojní s tým, že pravidelne navštevujú klinické vyšetrenie, vediac, že ​​žiadna liečba sa nezačne, pokiaľ neexistuje dôkaz o klinickom ochorení. Môže sa zvážiť aj potenciál diskriminácie v oblasti poistenia alebo zamestnania, hoci sa bude medzi krajinami líšiť, legislatíva, ako napríklad zákon o nediskriminácii genetických informácií (GINA), 56 zdôrazňuje, ako Spojené štáty americké pracovali na minimalizácii niektorých z týchto potenciálnych škôd. . Podrobné genetické poradenstvo pred testom je nevyhnutné na uľahčenie tohto rozhodnutia, avšak budúci výskum na objasnenie účinných metód na podporu informovaného výberu bude potrebný.

Oblasť, kde je informovaný výber problematický, je testovanie detí. Genetické spoločnosti na celom svete to uznali a mnohé z nich vyvinuli prísne usmernenia týkajúce sa procesov testovania detí, pričom kľúčovým predpokladom je, že by mal existovať nejaký bezprostredný zdravotný prínos. 57 V prípade HCM sa dá polemizovať o tom, či pozitívny genetický výsledok asymptomatického dieťaťa bude mať nejaký okamžitý medicínsky prínos, a z tohto dôvodu sa odporúča komplexné genetické poradenstvo so zapojením detského psychológa, ak je to praktické. 7

Nositelia tichých génov nie sú pacienti

Tiché nosiče génov vznikli ako priamy výsledok rozsiahlejšieho genetického testovania. Ako takí, pri absencii klinického fenotypu, by sa nemali považovať za pacientov, ale skôr za tých, ktorí sú pod dohľadom. Súčasné usmernenia American Heart Association navrhujú klinické sledovanie tichých nosičov génov každé 3 až 5 rokov po dosiahnutí veku 18 až 21 rokov, a čo je dôležité, nenavrhujú obmedzenie súťažných športov. 3 To, ako hovoríme s asymptomatickými členmi rodiny o výsledkoch kaskádového genetického testovania, to preto musí odrážať. To tiež zdôrazňuje potrebu usmernení založených na dôkazoch týkajúcich sa manažmentu tichých génových nosičov, aby sa zvýšila dôvera lekárov, ktorí riadia rodiny, a aby sa predišlo príliš horlivým a zbytočným klinickým vyšetreniam.

Rozumná reakcia a vyšetrovanie neistých variantov vrátane náhodných zistení

Ak sú identifikované varianty v génoch, ktoré nesúvisia s fenotypom HCM, potom sú podľa definície neisté. Interpretácia genetického výsledku v klinickom prostredí musí byť obmedzená len na tie gény, ktoré majú jasne preukázanú súvislosť s príslušným fenotypom. Skúmanie nových génov sa musí obmedziť na výskumné štúdie a centrá s významnou srdcovou genetickou expertízou. Identifikácia neistých a náhodných variantov môže byť problematická, ale rovnako dôležité sú rozhodnutia lekára o postupe. Je potrebné dbať na to, aby sa predišlo reflexívnej reakcii komplexných klinických štúdií a segregačných štúdií u rodinných príslušníkov, kde neexistuje jasný prínos.

Predtestové genetické poradenstvo a expertíza na choroby umožňujú informované rozhodovanie

Komplexné predtestové genetické poradenstvo je nevyhnutným a nevyhnutným krokom pred genetickým testovaním. 4,20 To znamená zabezpečiť, aby bol účastník informovaný a vedomý si možných výsledkov, diskusiu o psychosociálnych úvahách a podporu autonómneho rozhodnutia, ktoré je založené na individuálnych preferenciách a hodnotách. Ďalším aspektom informovaného výberu pri zvažovaní kaskádového genetického testovania sú presné a vhodné informácie o riziku, berúc do úvahy rôzne úrovne zdravotnej gramotnosti medzi populáciami. Ďalšie pochopenie prirodzenej histórie a klinických výsledkov pre tichých nosičov génov poskytne spoľahlivejšiu základňu dôkazov, na základe ktorej môžu členovia rodiny urobiť skutočne informované rozhodnutie o tom, či pokračovať v genetickom testovaní. Skúsenosti a odbornosť veľkoobjemových špecializovaných multidisciplinárnych centier HCM sú v tomto prostredí čoraz cennejšie. 32

Závery

Implementácia nových technológií na včasnú diagnostiku, zlepšenie výsledkov a prežitie je v medicíne samozrejmosťou. Vznik nových technológií genetického sekvenovania viedol predovšetkým k novej vzrušujúcej fáze v oblasti genetického testovania srdca. V HCM je potrebné zvážiť potenciál prínosov aj škôd. Vzhľadom na mnohé úvahy a potenciálne výsledky testovania asymptomatických rizikových jedincov je potrebné prijať vyvážený prístup. Toto by malo zvážiť klinickú situáciu, potreby pacienta a dostupné možnosti genetického testovania s celkovým cieľom prispieť k určitému zlepšeniu klinickej starostlivosti.

Poďakovanie

Dr Ingles je príjemcom National Health and Medical Research Council (NHMRC) a National Heart Foundation of Australia Early Career Fellowship (č. 1036756). Dr Semsarian je príjemcom štipendia NHMRC Practitioner Fellowship (č. 571084).


Materiály a metódy

Štrukturálna fylogenomická analýza

V tejto štúdii sme zmapovali vývoj domén aaRS v publikovanej evolučnej časovej línii vzhľadu domény na úrovni štrukturálnej abstrakcie [6], [7]. Táto časová os bola vybraná z niekoľkých dôvodov: FF vo všeobecnosti poskytujú štruktúry s jednoznačným priradením molekulárnych funkcií, časová os je dobre anotovaná a výsledky možno porovnávať s popisom vzostupu skorých štruktúr a funkcií [7]. Časová os bola odvodená z fylogenomického stromu 2 397 FF štruktúr (z 3 464 definovaných štruktúrnou klasifikáciou proteínov ( scop ) 1,73 [8]) rekonštruovaného zo štrukturálneho sčítania v genómoch 420 voľne žijúcich organizmov zo všetkých troch bunkových superkráľovstiev (FL420). Časová os bola pre všetky účely zhodná s časovou osou odvodenou z fylogenomického stromu 3 513 FF (z 3 902 definovaných pomocou scop 1,75) rekonštruovaných zo sčítania 989 genómov (A989) [14]. V týchto štrukturálnych genómových sčítaniach hmmscan balíka profilu HMMER3 skenuje genómové sekvencie (s pravdepodobnostnými limitmi E z 10 −4 ) oproti knižnici pokročilých lineárnych HMM so štruktúrnym rozpoznávaním v superrodine [73]. Všimli sme si, že fylogenomický prístup založený na štruktúre (zhrnutý vo vývojovom diagrame na obrázku 1A) je odolný voči množstvu obmedzení, ktoré trápia sekvenčnú analýzu, ako sú problémy zoradenia, nezávislosti znakov, nepoužiteľné znaky, saturácia a vzorkovanie taxónov [74]. a je dokonca odolný voči nerovnomernému vzorkovaniu genómov v rámci troch superkráľovstiev [75].

Napriek robustným evolučným trendom naprieč fylogenézami [5] môže byť presné poradie tesne umiestnených FF diskutabilné pri fylogenetických rekonštrukciách stromov s tisíckami listov. Z tohto dôvodu sme podvolili domény, ktoré boli súčasťou aaRS, a vytvorili sme zakorenené stromy popisujúce vývoj iba FF spojených s týmito enzýmami (obrázok S1, panel A). Rekonštrukcie stromov sa uskutočňovali s použitím maximálnej šetrnosti ako kritéria optimality a kombinovanej úspornej račne, ako už bolo opísané [6], [14]. Stromy boli zakorenené Lundbergovou metódou, ktorá neukladá požiadavku na mimoskupinové taxóny. Fylogenetická spoľahlivosť bola hodnotená neparametrickou bootstrap metódou s 1 000 replikátmi, pričom veľkosť prevzorkovania bola rovnaká ako počet vzorkovaných genómov, TBR a maxtrees bez obmedzenia. Štruktúra fylogenetického signálu v dátach bola testovaná šikmosťou (g1) distribúcie dĺžky 1 000 náhodných stromov [76]. Profily distribúcie stromov a metriky šikmosti indikovali silnú kladistickú štruktúru (p<0,01). Obnovené stromy boli dobre vyriešené a mali bazálne topológie, ktoré zodpovedali topológii homológnych podstromov v publikovaných stromoch FF. Hodnoty podpory bootstrapu (BS) pre bazálne vetvy boli 100 a pohybovali sa v rozmedzí 56–83 vo viac odvodených vetvách, veľmi odvodené oblasti boli variabilné v rámci 9 najšetrnejších stromov, ktoré sa zachovali. To naznačuje, že topológie poskytujú silnú podporu fylogenetickým vyhláseniam, pričom podpora sa zvyšuje smerom k základni stromu. V nedávnej štúdii sme tiež zrekonštruovali stromy domén aaRS [77]. Tieto stromy boli odvodené zo sčítania proteínovej štruktúry v 1 037 genómoch, ktoré zahŕňali organizmy v troch superkráľovstvách a vírusy. Topológie boli opäť pozoruhodne konzistentné. Vzhľadom na tieto výsledky sme použili vek domén získaný z globálne publikovaných fylogénií na umiestnenie aaRS do časovej osi spolu s ďalšími doménami spojenými s ribozómovými a neribozomálnymi proteínovými syntetázami (NRPS), ktoré sme použili ako referenciu (obrázok 2). Pre jednoduchosť sú tu identifikované domény s stručné klasifikačné reťazce (ccs). Napríklad katalytická doména tyrozyl-tRNA syntetázy [EC 6.1.1.1] zodpovedá c.26.1.1 FF, v ktorej c predstavuje triedu proteínov (α/β proteíny), 26 F (adenínnukleotid alfa hydroláza- ako fold), 1 FSF (nadrodina nukleotidyltransferáz) a 1 FF (aaRS triedy I, katalytická doména).

Relatívny vek proteínových štruktúr (nd) bol vypočítaný priamo z koreňových stromov pomocou skriptu, ktorý počíta počet uzlov od koreňa (základne) stromu ku každému listu a poskytuje ho v relatívnej mierke nula ku jednej. Títo nd hodnoty využívajú vysoko nevyváženú povahu stromov doménových štruktúr, ako sa nedávno diskutovalo [78]. Nerovnováha stromov v týchto stromoch je prirodzeným dôsledkom dedičnej črty [79], akumulácie doménových štruktúr v proteínoch a proteómoch [13], ktorá prirodzene vyvoláva speciáciu [80]. V skutočnosti δ-test [81] potvrdzuje, že nerovnováha v stromoch domén nebola výsledkom artefaktu hustoty uzlov a predstavuje skutočný evolučný proces. Okrem toho sme zistili, že stromy sa neriadia náhodnými alebo vianočnými modelmi speciácie, o ktorých sa dá predpokladať, že riadia evolúciu druhov [13]. The nd hodnoty sú tiež dobrým zástupcom pre geologický čas. Molekulové hodiny pre proteínové domény v záhybe (F) (t = -3,802 ndF +3,814) a násobná nadrodina (FSF) (t = –3,831 ndFSF Úrovne +3,628) (11) sa použili na výpočet geologického veku vybraných rodín (v miliardách rokov Gya), za predpokladu, že FF boli najstaršie v každej skupine. Poznamenávame, že rozšírenie hodín na FF ukázalo, že vek domény bol naďalej úmerný času, ale s väčším rozptylom pri vysokých ndFF hodnoty. Hodiny boli kalibrované s geologickým vekom odvodeným zo štúdia fosílií a geochemických, biochemických a biomarkerových údajov, ktoré sú ovplyvnené platnosťou predpokladov použitých v každej z podporných štúdií [13]. Poznamenávame tiež, že molekulárne hodiny odvodené zo stromov Fs a FSF sú nevyhnutne závislé od rýchlosti objavovania a akumulácie domén, ktoré by mohli byť deviantné pre niektoré doménové štruktúry. Tieto faktory by mohli spôsobiť odchýlky od času, pričom nadmerná disperzia niekedy vyplýva zo zmien v skladateľnosti a štrukturálnej stabilite domén [63].

Fylogenetická analýza štruktúry tRNA

Vek tu použitých molekúl tRNA bol odvodený z publikovaných časových línií nabíjania a kódovania aminokyselín generovaných zo stromov štruktúry tRNA [28]. Metóda extrahuje fylogenetické podpisy zo štruktúrnej topológie v RNA [22], [23], [28], [29], [82]–[87]. Tieto podpisy sú odvodené z väzieb medzi sekundárnou štruktúrou a konformáciou, dynamikou a adaptáciou [88]. Geometrické a štatistické vlastnosti subštruktúr RNA sú hodnotené v tisíckach molekúl a tieto informácie sa analyzujú modernými fylogenetickými metódami na výrobu stromy molekúl a stromy spodných stavieb ktoré zobrazujú históriu systému (molekuly), respektíve jeho komponentov (subštruktúry) (obrázok 1C). Fylogenetický model automaticky zakorení stromy za predpokladu, že konformačná stabilita sa v evolúcii zvyšuje, keď sa štruktúry kanalizujú. Platnosť polarizácie a zakorenenia závisí od axiomatickej zložky transformácie postavy, ktorá je podložená značnými dôkazmi a je tiež falzifikovateľná [87].

Fylogenetická analýza obmedzení obmedzuje hľadanie optimálnych stromov tRNA na vopred špecifikované topológie [29], [85] a môže poskytnúť dôležité poznatky zo stromov molekúl. Tu je minimálny počet ďalších krokov (S) potrebné na vynútenie skupín taxónov tRNA v stromoch (nevzájomne sa vylučujúce hypotézy) definovali miery predkov jednotlivých skupín a použili sa na zostavenie evolučných časových línií nabíjania aminokyselín a kódovania aminokyselín. Hypotézy s menšími S boli považované za menej ovplyvnené náborom a predstavovali procesy, ktoré boli starodávnejšie. Pomocou tohto prístupu boli chronológie nabíjania aminokyselín a objavu kodónov priamo odvodené pre izoakceptor (Saac) a antikodónovo špecifické (Streska) tRNA. Platnosť argumentácie postáv a predpoklad, že skupiny, ktoré vyžadujú nižší počet krokov, sa považujú za staršie, bola odvodená z koreňových stromov a modelu polarizácie postáv [87].

Hľadanie koevolučných vzorov

Vek štruktúr proteínových domén na úrovni FF (ndFF) boli vynesené proti veku izoakceptorových tRNA (Saac) a antikodónovo špecifické tRNA (Streska). Zistili sme, že korelácie boli významné vo všetkých prípadoch (P< 0,0067). Regresné čiary rozvinuli vývojové časové línie archaických editačných funkcií a špecifík viazania antikodónov, akonáhle boli identifikované editačné a ďalšie doplnkové domény. Konkrétne katalytické a editačné domény, ktoré sa objavujú pred doménami viažucimi antikodón (ndFF <0,196) a editačné domény pre AlaRS, ThrRS a PheRS objavené po tomto veku (počas obdobia, v ktorom sa rozvíjal operačný aj štandardný genetický kód) boli zahrnuté do korelačných štúdií. Časové osi regresie sa tiež porovnávali s konzervatívnou idealizovanou časovou osou, ktorá pokrýva vek domény a podceňuje evolúciu tRNA (relatívne miery štrukturálnych zmien v proteínových doménach môžu byť 4, 3-krát vyššie ako v tRNA). Dve skupiny aaRS, ktoré sa objavujú blízko seba v idealizovanej časovej osi, sú súčasťou dobre zavedených superklastrov definovaných sekvenčnou a štrukturálnou analýzou [89], superklastrov triedy I LeuRS, MetRS, IleRS a ValRS a triedy II SerRS a ProRS (obrázok 2B). V tomto smere vyššie Saac hodnoty tRNA interagujúce so štrukturálne príbuznými ProRS, LysRS a MetRS ich robia evolučne odvodenými v porovnaní so SerRS, čo je skutočnosť, ktorá je explicitne vyjadrená koevolučnými vzormi. Nedávna sekvenčná analýza SerRS, ProRS a ThrRS skutočne ukazuje neskorý výskyt ThrRS [90]. Toto pozorovanie podporuje platnosť časovej osi a opätovné použitie doménových štruktúr vo vývoji na odhalenie rôznych špecifík.

Komplementarita genetického kódu a prvky identity

Predpokladané odtlačky primordiálnej komplementarity, o ktorej sa predpokladá, že existuje v genetickom kóde, boli požičané priamo od Rodina a Rodina [37]. Nukleotidy boli definované podľa IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature. Prvky identity v tRNA boli identifikované in vitro a in vivo prístupmi [25]–[27]. Strata účinnosti aminoacylácie (L) pre prvky identity v tRNA bola uvedená ako L = (k/Km)hmotn/(k/Km)mutant, pričom rýchlostné konštanty sú buď kkat alebo Vmax [25]. Vzory konzervácie v tRNA boli odvodené z tRNAdb a identifikované v tRNA pomocou zavedených čísel nukleotidov [91].

Analýza proteínových sekvencií a štruktúr

Analyzovali sme frekvencie aminokyselín v sekundárnych štruktúrach pre nevyradený a vyradený súbor proteínových záznamov z Protein Data Bank (PDB) (obrázok S1). Sekundárne štruktúry boli priradené pomocou programu DSSP [92]. Nevyzbieraný súbor zahŕňal 204 531 doménových sekvencií (51 392 487 aminokyselín) stiahnutých z PDB (20. júna 2012). Vyradený súbor vysokokvalitných záznamov PDB sa vybral pomocou servera PISCES na vyradenie proteínovej sekvencie [93] s nasledujúcimi prahmi: sekvenčná percentuálna identita, rozlíšenie ≤ 25 %, R-faktor 0,0–2,5, dĺžka sekvencie 0,25, vylúčenie 40–10 000 nerontgenových vstupov a vstupov obsahujúcich iba Ca, utratené reťazou. Zozbieraný súbor obsahoval 6 828 sekvencií (1 654 074 aminokyselín). Keďže veľkosti množín údajov sú veľké (n >gt100), je vhodné použiť parametrickú metódu (ANOVA) na testovanie, či existuje významný rozdiel medzi frekvenciami troch aminokyselinových skupín (helix, otočka a vlákno) v každej sekundárnej štruktúre.

Aby sme vypočítali frekvencie aminokyselín v rôznych FF, priradili sme štruktúry sekvenciám PDB s HMM z nadrodiny [73]. Priradenia FF boli definované podľa databázy SCOP [8]. Identita PDB sekvencií bola nastavená ako ≤ 25 % pomocou PISCES. Všetky sekvencie PDB s dvoma alebo viacerými FF alebo nepriradenými rozsahmi dlhšími ako 30 aminokyselín boli zo štúdie vylúčené. V konečnom súbore sekvencií PDB bolo 2 384 sekvencií pokrytých 1 475 FF.

Tiež sme skúmali, či každá z 20 aminokyselín alebo 408 možných dipeptidov, ktoré zahŕňali 2 nejednoznačné aminokyseliny, Z a X, bola alebo nebola obohatená o FF, ktoré boli staršie ako najstaršia antikodón viažuca doména časovej osi (305 sekvencií objavujúce sa skôr ako c.51.1.1, ndFF <0,2) v porovnaní so súborom 2 384 sekvencií a 1 475 FF, ktoré sa objavujú na celej časovej osi (nd = 0 – 1). Pre každý z dvoch súborov sekvencií sme spočítali počet viacnásobných výskytov aminokyselín alebo dipeptidov a potom vypočítali pravdepodobnosť obohatenia každej aminokyseliny alebo dipeptidu, ktorý bol prítomný v starom súbore 305 sekvencií pomocou hypergeometrickej distribúcie a nasledujúceho rovnica [75]:

Pozorované hodnoty M a k označujú počet viacnásobných výskytov skúmaných aminokyselín alebo dipeptidov v 2384-sekvencii a 305-sekvenčnej sade, v danom poradí. Hodnoty N a n sú počty viacnásobných výskytov všetkých aminokyselín alebo dipeptidov v dvoch súboroch sekvencií.Pravdepodobnosť P(X = k) znamená šancu, že náhodná premenná Xk viacnásobný výskyt aminokyselín alebo dipeptidov pre danú aminokyselinu alebo dipeptid. S odkazom na rovnicu a predchádzajúcu literatúru [94] sme vypočítali P hodnoty pre každú aminokyselinu alebo dipeptid, ktorý má k/n väčšie než M/Na vyhodnotili štatistickú významnosť obohatenia každej aminokyseliny alebo dipeptidu v starých FF na úrovni spoľahlivosti 99 % (P< 0,01).

Anotácie molekulárnych funkcií

Molekulárne funkcie spojené s FF boli anotované pomocou hierarchickej klasifikácie nadrodiny [73], ktorá priraďuje sedem všeobecných funkčných kategórií a 50 podkategórií k scop ID [8] na základe informácií v scop , Interpro, Pfam, SwissProt a v zdrojoch literatúry (http:/ /supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY/function.html). Doménové architektúry boli vyhľadávané v databáze PDB [95] (http://www.rcsb.org/pdb/home/) a anotované pomocou Gene Ontology (GO) [96] (http://www.geneontology.org). Termíny GO definujú slovník molekulárnych funkcií, biologických procesov a bunkových komponentov. Preskúmali sme termíny GO spojené s molekulárnymi funkciami translácie. Manuálne anotácie zahŕňali aj dotazy v databáze UniProtKB (proteínová znalostná báza) (http://www.uniprot.org/) a priraďovanie štruktúr na báze HMM. Anotácie boli namapované na časovú os domény.

Štrukturálne zarovnania

Štrukturálne zarovnania jednotlivých proteínových štruktúrnych vstupov so štrukturálnymi súbormi sa uskutočnili pomocou DALI konzervačného mapovania [97] alebo GANGSTA+ [98]. Server DALI vykonáva párové porovnania s PDB90 na základe systematického vyhľadávania medzi vetvami a hranicami, ktoré vracia neprekrývajúce sa riešenia v klesajúcom poradí Z-skóre zarovnania. Vybrané podmnožiny štrukturálnych susedov boli vizualizované vo viacerých 3D superpozíciách na vizualizáciu štrukturálnej a sekvenčnej konzervácie. Zarovnania s GANGSTA+, implementáciou, ktorá používa pokročilú metódu nesekvenčného zarovnania so správnym priradením helixov a vlákien v štruktúre, boli proti verzii 1.75 kompendia ASTRAL40.


Štatistická analýza

Riziká na úrovni populácie boli odhadnuté pre skupiny patogénnych alel, génov alebo lokusov s použitím pomerov pravdepodobnosti s prahmi významnosti (korigované pre viacnásobné testovanie) a 95 % intervalmi spoľahlivosti. 13,25 Pomery šancí boli prevedené na odhadovanú populačnú penetráciu (ekvivalent populačnej incidencie alebo rizika) s Bayesovým teorémom, za predpokladu výskytu 15 prípadov na 100 000 európskych predkov narodených. 11 Frekvencie alel medzi kontrolami boli získané z rôznych verejných zdrojov 17, 21, 26 na odhad populačného pripísateľného rizika. Ďalšie podrobnosti sú uvedené v časti Metódy v doplnkovej prílohe.


Referencie

Pare JA, Fraser RG, Pirozynski WJ, Shanks JA, Stubington D

Geisterfer-Lowrance AA, Kass S, Tanigawa G, Vosberg HP, McKenna W, Seidman CE, Seidman JG

Green EM, Wakimoto H, Anderson RL, Evanchik MJ, Gorham JM, Harrison BC, Henze M, Kawas R, Oslob JD, Rodriguez HM a kol.

Charron P, Dubourg O, Desnos M, Isnard R, Hagege A, Millaire A, Carrier L, Bonne G, Tesson F, Richard P a kol.

Maron BJ, Spirito P, Wesley Y, Arce J

Maron BJ, Gardin JM, Flack JM, Gidding SS, Kurosaki TT, Bild DE

Zou Y, Song L, Wang Z, Ma A, Liu T, Gu H, Lu S, Wu P, Zhang dýka Y, Shen dýka L a kol.

Bick AG, Flannick J, Ito K, Cheng S, Vasan RS, Parfenov MG, Herman DS, DePalma SR, Gupta N, Gabriel SB a kol.

Semsarian C, Ingles J, Maron MS, Maron BJ

Nijenkamp LLAM, Bollen IAE, Niessen HWM, Dos Remedios CG, Michels M, Poggesi C, Ho CY, Kuster DWD, van der Velden J

Eberly LA, Day SM, Ashley EA, Jacoby DL, Jefferies JL, Colan SD, Rossano JW, Semsarian C, Pereira AC, Olivotto I a kol.

Rowin EJ, Maron MS, Wells S, Patel PP, Koethe BC, Maron BJ

Lakdawala NK, Olivotto I, Day SM, Han L, Ashley EA, Michels M, Ingles J, Semsarian C, Jacoby D, Jefferies JL a kol.

Watkins H, McKenna WJ, Thierfelder L, Suk HJ, Anan R, O’Donoghue A, Spirito P, Matsumori A, Moravec CS, Seidman JG

Niimura H, Bachinski LL, Sangwatanaroj S, Watkins H, Chudley AE, McKenna W, Kristinsson A, Roberts R, Sole M, Maron BJ a kol.

Thierfelder L, Watkins H, MacRae C, Lamas R, McKenna W, Vosberg HP, Seidman JG, Seidman CE

Levy S, Sutton G, Ng PC, Feuk L, Halpern AL, Walenz BP, Axelrod N, Huang J, Kirkness EF, Denisov G a kol.

Wheeler DA, Srinivasan M, Egholm M, Shen Y, Chen L, McGuire A, He W, Chen YJ, Makhijani V, Roth GT a kol.

Auton A, Brooks LD, Durbin RM, Garrison EP, Kang HM, Korbel JO, Marchini JL, McCarthy S, McVean GA, Abecasis GR

Kong A, Frigge ML, Masson G, Besenbacher S, Sulem P, Magnusson G, Gudjonsson SA, Sigurdsson A, Jonasdottir A, Jonasdottir A a kol.

Palamara PF, Francioli LC, Wilton PR, Genovese G, Gusev A, Finucane HK, Sankararaman S, Sunyaev SR, de Bakker PI, Wakeley J, et al.

Besenbacher S, Liu S, Izarzugaza JM, Grove J, Belling K, Bork-Jensen J, Huang S, Als TD, Li S, Yadav R a kol.

Campbell CD, Chong JX, Malig M, Ko A, Dumont BL, Han L, Vives L, O'Roak BJ, Sudmant PH, Shendure J a kol.

Tennessen JA, Bigham AW, O'Connor TD, Fu W, Kenny EE, Gravel S, McGee S, Do R, Liu X, Jun G a kol.

Daw EW, Lu Y, Marian AJ, Shete S

Daw EW, Chen SN, Czernuszewicz G, Lombardi R, Lu Y, Ma J, Roberts R, Shete S, Marian AJ

Alfares AA, Kelly MA, McDermott G, Funke BH, Lebo MS, Baxter SB, Shen J, McLaughlin HM, Clark EH, Babb LJ a kol.

Richard P, Charron P, Carrier L, Ledeuil C, Cheav T, Pichereau C, Benaiche A, Isnard R, Dubourg O, Burban M a kol.

Millat G, Bouvagnet P, Chevalier P, Dauphin C, Jouk PS, Da Costa A, Prieur F, Bresson JL, Faivre L, Eicher JC a kol.

Helms AS, Thompson AD, Glazier AA, Hafeez N, Kabani S, Rodriguez J, Yob JM, Woolcock H, Mazzarotto F, Lakdawala NK a kol.

Vignier N, Schlossarek S, Fraysse B, Mearini G, Krämer E, Pointu H, Mougenot N, Guiard J, Reimer R, Hohenberg H a kol.

Adalsteinsdottir B, Teekakirikul P, Maron BJ, Burke MA, Gudbjartsson DF, Holm H, Stefansson K, DePalma SR, Mazaika E, McDonough B a kol.

Calore C, De Bortoli M, Romualdi C, Lorenzon A, Angelini A, Basso C, Thiene G, Iliceto S, Rampazzo A, Melacini P

Kubo T, Kitaoka H, ​​Okawa M, Matsumura Y, Hitomi N, Yamasaki N, Furuno T, Takata J, Nishinaga M, Kimura A a kol.

Dhandapany PS, Sadayappan S, Xue Y, Powell GT, Rani DS, Nallari P, Rai TS, Khullar M, Soares P, Bahl A a kol.

Harper AR, Bowman M, Hayesmoore JBG, Sage H, Salatino S, Blair E, Campbell C, Currie B, Goel A, McGuire K a kol.

Poetter K, Jiang H, Hassanzadeh S, Master SR, Chang A, Dalakas MC, Rayment I, Sellers JR, Fananapazir L, Epstein ND

Satoh M, Takahashi M, Sakamoto T, Hiroe M, Marumo F, Kimura A

Carniel E, Taylor MR, Sinagra G, Di Lenarda A, Ku L, Fain PR, Boucek MM, Cavanaugh J, Miocic S, Slavov D, et al.

Rubattu S, Bozzao C, Pennacchini E, Pagannone E, Musumeci BM, Piane M, Germani A, Savio C, Francia P, Volpe M a kol.

Mogensen J, Klausen IC, Pedersen AK, Egeblad H, Bross P, Kruse TA, Gregersen N, Hansen PS, Baandrup U, Borglum AD

Osio A, Tan L, Chen SN, Lombardi R, Nagueh SF, Shete S, Roberts R, Willerson JT, Marian AJ

Ruggiero A, Chen SN, Lombardi R, Rodriguez G, Marian AJ

Chiu C, Bagnall RD, Ingles J, Yeates L, Kennerson M, Donald JA, Jormakka M, Lind JM, Semsarian C

Prondzynski M, Lemoine MD, Zech AT, Horváth A, Di Mauro V, Koivumäki JT, Kresin N, Busch J, Krause T, Krämer E, et al.

Geier C, Gehmlich K, Ehler E, Hassfeld S, Perrot A, Hayess K, Cardim N, Wenzel K, Erdmann B, Krackhardt F a kol.

Hayashi T, Arimura T, Itoh-Satoh M, Ueda K, Hohda S, Inagaki N, Takahashi M, Hori H, Yasunami M, Nishi H a kol.

Friedrich FW, Wilding BR, Reischmann S, Crocini C, Lang P, Charron P, Müller OJ, McGrath MJ, Vollert I, Hansen A a kol.

Christodoulou DC, Wakimoto H, Onoue K, Eminaga S, Gorham JM, DePalma SR, Herman DS, Teekakirikul P, Conner DA, McKean DM a kol.

Lim DS, Roberts R, Marián AJ

Arimura T, Matsumoto Y, Okazaki O, Hayashi T, Takahashi M, Inagaki N, Hinohara K, Ashizawa N, Yano K, Kimura A

Chen SN, Czernuszewicz G, Tan Y, Lombardi R, Jin J, Willerson JT, Marian AJ

Salazar-Mendiguchía J, Ochoa JP, Palomino-Doza J, Domínguez F, Díez-López C, Akhtar M, Ramiro-León S, Clemente MM, Pérez-Cejas A, Robledo M a kol.

Auxerre-Plantie E, Nielsen T, Grunert M, Olejniczak O, Perrot A, Özcelik C, Harries D, Matinmehr F, Remedios CD, Mühlfeld C, a kol.

Matsushita Y, Furukawa T, Kasanuki H, Nishibatake M, Kurihara Y, Ikeda A, Kamatani N, Takeshima H, Matsuoka R

Landstrom AP, Adekola BA, Bos JM, Ommen SR, Ackerman MJ

Chiu C, Tebo M, Ingles J, Yeates L, Arthur JW, Lind JM, Semsarian C

Valdés-Mas R, Gutiérrez-Fernández A, Gómez J, Coto E, Astudillo A, Puente DA, Reguero JR, Álvarez V, Morís C, León D a kol.

Gomez J, Lorca R, Reguero JR, Morís C, Martín M, Tranche S, Alonso B, Iglesias S, Alvarez V, Díaz-Molina B a kol.

Almomani R, Verhagen JM, Herkert JC, Brosens E, van Spaendonck-Zwarts KY, Asimaki A, van der Zwaag PA, Frohn-Mulder IM, Bertoli-Avella AM, Boven LG a kol.

Li L, Bainbridge MN, Tan Y, Willerson JT, Marian AJ

Hayashi T, Arimura T, Ueda K, Shibata H, Hohda S, Takahashi M, Hori H, Koga Y, Oka N, Imaizumi T a kol.

Saltzman AJ, Mancini-DiNardo D, Li C, Chung WK, Ho CY, Hurst S, Wynn J, Care M, Hamilton RM, Seidman GW a kol.

Page SP, Kounas S, Syrris P, Christiansen M, Frank-Hansen R, Andersen PS, Elliott PM, McKenna WJ

Jääskeläinen P, Heliö T, Aalto-Setälä K, Kaartinen M, Ilveskoski E, Hämäläinen L, Melin J, Kärkkäinen S, Peuhkurinen K, Nieminen MS a kol.

Jääskeläinen P, Heliö T, Aalto-Setälä K, Kaartinen M, Ilveskoski E, Hämäläinen L, Melin J, Nieminen MS, Laakso M, Kuusisto J a kol.

Alders M, Jongbloed R, Deelen W, van den Wijngaard A, Doevendans P, Ten Cate F, Regitz-Zagrosek V, Vosberg HP, van Langen I, Wilde A a kol.

Blair E, Price SJ, Baty CJ, Ostman-Smith I, Watkins H

Girolami F, Ho CY, Semsarian C, Baldi M, Will ML, Baldini K, Torricelli F, Yeates L, Cecchi F, Ackerman MJ a kol.

Nagueh SF, McFalls J, Meyer D, Hill R, Zoghbi WA, Tam JW, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Nagueh SF, Bachinski LL, Meyer D, Hill R, Zoghbi WA, Tam JW, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Ameur A, Kloosterman WP, Hestand MS

Rottbauer W, Gautel M, Zehelein J, Labeit S, Franz WM, Fischer C, Vollrath B, Mall G, Dietz R, Kübler W a kol.

Marston S, Copeland O, Jacques A, Livesey K, Tsang V, McKenna WJ, Jalilzadeh S, Carballo S, Redwood C, Watkins H

Tripathi S, Schultz I, Becker E, Montag J, Borchert B, Francino A, Navarro-Lopez F, Perrot A, Özcelik C, Osterziel KJ a kol.

Kraft T, Montag J, Radocaj A, Brenner B

Frischmeyer PA, van Hoof A, O'Donnell K, Guerrerio AL, Parker R, Dietz HC

Siwaszek A., Ukleja M., Dziembowski A

Sarikas A, Carrier L, Schenke C, Doll D, Flavigny J, Lindenberg KS, Eschenhagen T, Zolk O

Schlossarek S, Frey N, Carrier L

Stewart MA, Franks-Skiba K, Chen S, Cooke R

Anderson RL, Trivedi DV, Sarkar SS, Henze M, Ma W, Gong H, Rogers CS, Gorham JM, Wong FL, Morck MM a kol.

McNamara JW, Li A, Smith NJ, Lal S, Graham RM, Kooiker KB, van Dijk SJ, Remedios CGD, Harris SP, Cooke R

Witjas-Paalberends ER, Piroddi N, Stam K, van Dijk SJ, Oliviera VS, Ferrara C, Scellini B, Hazebroek M, ten Cate FJ, van Slegtenhorst M, et al.

Witjas-Paalberends ER, Güçlü A, Nemci T, Knaapen P, Harms HJ, Vermeer AM, Christiaans I, Wilde AA, Dos Remedios C, Lammertsma AA a kol.

Bloemink M, Deacon J, Langer S, Vera C, Combs A, Leinwand L, Geeves MA

Lombardi R, Bell A, Senthil V, Sidhu J, Noseda M, Roberts R, Marian AJ

Nagueh SF, Chen S, Patel R, Tsybouleva N, Lutucuta S, Kopelen HA, Zoghbi WA, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Solaro RJ, Varghese J, Marian AJ, Chandra M

Crilley JG, Boehm EA, Blair E, Rajagopalan B, Blamire AM, Styles P, McKenna WJ, Ostman-Smith I, Clarke K, Watkins H

Kraft T, Witjas-Paalberends ER, Boontje NM, Tripathi S, Brandis A, Montag J, Hodgkinson JL, Francino A, Navarro-Lopez F, Brenner B a kol.

Gupte TM, Haque F, Gangadharan B, Sunitha MS, Mukherjee S, Anandhan S, Rani DS, Mukundan N, Jambekar A, Thangaraj K a kol.

Cordero-Reyes AM, Youker K, Hamilton DJ, Torre-Amione G, Marian AJ, Nagueh SF

Litviňuková M, Talavera-López C, Maatz H, Reichart D, Worth CL, Lindberg EL, Kanda M, Polanski K, Heinig M, Lee M, et al.

Fraysse B, Weinberger F, Bardswell SC, Cuello F, Vignier N, Geertz B, Starbatty J, Krämer E, Coirault C, Eschenhagen T a kol.

Sequeira V, Wijnker PJ, Nijenkamp LL, Kuster DW, Najafi A, Witjas-Paalberends ER, Regan JA, Boontje N, Ten Cate FJ, Germans T a kol.

O'Hanlon R, Grasso A, Roughton M, Moon JC, Clark S, Wage R, Webb J, Kulkarni M, Dawson D, Sulaibeekh L a kol.

Schelbert EB, Piehler KM, Zareba KM, Moon JC, Ugander M, Messroghli DR, Valeti US, Chang C-CH, Shroff SG, Diez J a kol.

Helms AS, Alvarado FJ, Yob J, Tang VT, Pagani F, Russell MW, Valdivia HH, Day SM

Teekakirikul P, Eminaga S, Toka O, Alcalai R, Wang L, Wakimoto H, Nayor M, Konno T, Gorham JM, Wolf CM a kol.

Senthil V, Chen SN, Tsybouleva N, Halder T, Nagueh SF, Willerson JT, Roberts R, Marian AJ

Patel R, Nagueh SF, Tsybouleva N, Abdellatif M, Lutucuta S, Kopelen HA, Quinones MA, Zoghbi WA, Entman ML, Roberts R a kol.

Lim DS, Lutucuta S, Bacireddy P, Youker K, Evans A, Entman M, Roberts R, Marian AJ

Nagueh SF, Kopelen HA, Lim DS, Zoghbi WA, Quiñones MA, Roberts R, Marian AJ

Kramer CM, Reichek N, Ferrari VA, Theobald T, Dawson J, Axel L

Urbano-Moral JA, Rowin EJ, Maron MS, Crean A, Pandian NG

Monserrat L, Elliott PM, Gimeno JR, Sharma S, Penas-Lado M, McKenna WJ

O'Mahony C, Jichi F, Pavlou M, Monserrat L, Anastasakis A, Rapezzi C, Biagini E, Gimeno JR, Limongelli G, McKenna WJ a kol.

Olivotto I, Cecchi F, Casey SA, Dolara A, Traverse JH, Maron BJ

Siontis KC, Geske JB, Ong K, Nishimura RA, Ommen SR, Gersh BJ

Debonnaire P, Joyce E, Hiemstra Y, Mertens BJ, Atsma DE, Schalij MJ, Bax JJ, Delgado V, Marsan NA

Marián AJ, Asatryan B, Wehrens XHT

Eriksson MJ, Sonnenberg B, Woo A, Rakowski P, Parker TG, Wigle ED, Rakowski H

Klarich KW, Attenhofer Jost CH, Binder J, Connolly HM, Scott CG, Freeman WK, Ackerman MJ, Nishimura RA, Tajik AJ, Ommen SR

Kubo T, Ochi Y, Baba Y, Sugiura K, Takahashi A, Hirota T, Yamanaka S, Yamasaki N, Doi YL, Kitaoka H

Bagnall RD, Weintraub RG, Ingles J, Duflou J, Yeates L, Lam L, Davis AM, Thompson T, Connell V, Wallace J a kol.

Maron BJ, Doerer JJ, Haas TS, Tierney DM, Mueller FO

Sherrid MV, Barac I, McKenna WJ, Elliott PM, Dickie S, Chojnowska L, Casey S, Maron BJ

Maron BJ, Spirito P, Ackerman MJ, Casey SA, Semsarian C, Estes NA, Shannon KM, Ashley EA, Day SM, Pacileo G a kol.

Nishimura RA, Seggewiss H, Schaff HV

Olivotto I, Oreziak A, Barriales-Villa R, Abraham TP, Masri A, Garcia-Pavia P, Saberi S, Lakdawala NK, Wheeler MT, Owens A a kol.

Ho CY, Mealiffe ME, Bach RG, Bhattacharya M, Choudhury L, Edelberg JM, Hegde SM, Jacoby D, Lakdawala NK, Lester SJ a kol.

Tsybouleva N, Zhang L, Chen S, Patel R, Lutucuta S, Nemoto S, DeFreitas G, Entman M, Carabello BA, Roberts R a kol.

Marian AJ, Senthil V., Chen SN, Lombardi R

Shimada YJ, Passeri JJ, Baggish AL, O'Callaghan C, Lowry PA, Yannekis G, Abbara S, Ghoshhajra BB, Rothman RD, Ho CY a kol.

Nagueh SF, Lombardi R, Tan Y, Wang J, Willerson JT, Marian AJ

Maron MS, Chan RH, Kapur NK, Jaffe IZ, McGraw AP, Kerur R, Maron BJ, Udelson JE

Marian AJ, Tan Y, Li L, Chang J, Syrris P, Hessabi M, Rahbar MH, Willerson JT, Cheong BY, Liu CY a kol.

Olivotto I, Camici PG, Merlini PA, Rapezzi C, Patten M, Climent V, Sinagra G, Tomberli B, Marin F, Ehlermann P a kol.

Ho CY, Lakdawala NK, Cirino AL, Lipshultz SE, Sparks E, Abbasi SA, Kwong RY, Antman EM, Semsarian C, González A, et al.


2. MATERIÁLY A METÓDY

2.1 Pacienti

Indexový pacient (obrázok 1, jednotlivec I:2) bol vybraný z jednotlivcov sledovaných v Univerzitnom medicínskom centre Ľubľana (UMC) počas 8-ročného obdobia podľa diagnostického algoritmu pre erytrocytózu. 17 Kritériá zaradenia boli nasledovné: (a) hemoglobín a/alebo hematokrit nad referenčnými hodnotami aspoň dvakrát za 2 mesiace (b) absencia variantov JAK2 p.Val617Phe a JAK2 exón 12 (c) absencia akejkoľvek definovanej príčiny sekundárne získanej erytrocytózy a (d) absencia variantov v génoch pre trombopoetínový receptor (MPL), kalretikulín (CALRa receptor tyrozínkinázy (SÚPRAVA). 17 Indexovým pacientom bol 68-ročný muž, ktorý bol odoslaný na klinické oddelenie hematológie v UMC Ľubľana v roku 2013 kvôli vysokému počtu červených krviniek 6,36 x 10 12 buniek/l, vysokému hemoglobínu 221 g/l a vysoký hematokrit 0,650. Jeho hladina EPO bola v normálnom rozmedzí (11,4 IU/l). Pacient mal tiež zvýšený krvný tlak a srdcovú frekvenciu. Pacientovi bola predpísaná terapeutická flebotómia a pri poslednej kontrole v roku 2019 mal mierne zvýšený hemoglobín na 171 g/l. Pri revízii anamnézy uviedol, že aj jeho syn má klinické príznaky erytrocytózy.

Syn (obrázok 1, jednotlivec II:1) pacienta s indexom mal 41 rokov a pri prvom stretnutí v roku 2015 mal počet červených krviniek 6,29 × 10 12 buniek/l, vysoký hemoglobín 192 g/l a vysoký hematokrit 0,552, zatiaľ čo jeho hladina EPO bola normálna (8,3 IU/l). Syn bol pravidelným darcom krvi, a tak ho neposlali na flebotómiu. Títo dvaja pacienti boli testovaní na polycytémiu vera a dedičnú hemochromatózu a boli negatívni na varianty p.Val617Phe a exón 12 v JAK2 génu a tiež pre varianty p.Cys282Tyr, p.His63Asp a p.Ser65Asp v géne pre homostatický regulátor železa (HFE). Ani jeden z týchto dvoch pacientov nevykazoval žiadne pľúcne, srdcové alebo obličkové abnormality.

Manželka a matka týchto starších a mladších pacientov (obrázok 1, jednotlivec I:1) je mŕtva, ale mala normálny počet červených krviniek, hladiny hemoglobínu a hematokrit a žiadne známky erytrocytózy.

Všetci traja postihnutí a zdraví členovia rodiny boli spolu s referenčnou DNA kontrolou NA12878 zaradení do genetického testovania NGS na kongenitálnu erytrocytózu. Štúdia bola schválená Slovinskou etickou komisiou č. KME 115/07/15.

2.2 Genetická analýza

Pacientovi sa odobrala periférna krv na genetickú analýzu spolu s písomným informovaným súhlasom podpísaným všetkými pacientmi. Granulocyty sa izolovali z odobratej periférnej krvi a genómová DNA sa extrahovala z 1 až 2 x 107 buniek pomocou minisúprav QIAamp DNA (Qiagen). Pacienti podstúpili cielenú NGS s vlastným génovým panelom, ktorý pokrýval cieľové oblasti 39 vybraných génov: 21 génov predtým spojených s vrodenou erytrocytózou a polycytémiou vera, 12 troch ďalších génov spojených s erytrocytózou (PKLR, TET2 a GATA) a 15 génov predtým spojených s dedičnou hemochromatózou. 18 Všetky vybrané gény boli zamerané na oblasti exónu EPO, VHL a niektoré z ďalších génov mali prvý intrón, oblasti promótora a zosilňovača tiež zahrnuté 19, 20 (tabuľka 2).

asociácie Exon Intron 1 Promotor a zosilňovač
Gény spojené s erytrocytózou a Prevzaté z Camps et al. (2016). 12
BHLHE41, BPGM, EGLN1, EGLN2, EGLN3, EPAS1, EPO, EPOR, GFI1B, HBA1, HBA2, HBB, HIF1A, HIF1AN, HIF3A, JAK2, KDM6A, OS9, PKLR, SH2B3, VHL, ZNF197, GATA1 a TET2 VHL, EPO, EPOR, HBB, HBA1, HBA2 EPO
Dedičné gény spojené s hemochromatózou b b Adoptovaná forma Lanktree et al. (2017). 18
HFE, HJV, HAMP, TFR2, SLC40A1, FTH1, TF, B2 M, CP, FTL, CDAN1, SEC23B, SLC25A38, STEAP3 a ALAS2 - -
  • BHLHE41 gén pre základnú helix-loop-helix e41, BPGM gén pre bisfosfoglycerátmutázu, EGLN1 gén pre egl 1, EGLN2 gén pre egl, EGLN3 gén pre egl 3, EPAS1 gén pre endotelový PAS doménový proteín 1, EPO gén pre erytropoetín, EPOR gén pre erytropoetínový receptor, GFI1B gén pre 1B transkripčný represor nezávislý od rastového faktora, HBA1 gén pre hemoglobínovú podjednotku alfa 1, HBA2 gén pre hemoglobínovú podjednotku alfa 2, HBB gén pre podjednotku beta hemoglobínu, HIF1A gén pre podjednotku alfa faktora 1 indukovateľného hypoxiou, HIF1AN gén pre inhibítor podjednotky alfa faktora 1 indukovateľného hypoxiou, HIF3A gén pre podjednotku alfa faktora 3 indukovateľného hypoxiou, JAK2 gén pre Janus kinázu 2, KDM6A gén pre lyzíndemetylázu 6A, OS9 gén pre OS9 PKLR gén pre pyruvátkinázu L/R, SH2B3 gén pre adaptorový proteín 3 SH2B, VHL gén pre von Hippel-Lindauov supresor nádorov, ZNF197 gén pre proteín zinkového prsta 197, GATA1 gén pre GATA väzbový proteín 1, TET2 gén pre tet metylcytozín dioxygenázu 2, HFE gén pre homeostatický regulátor železa, HJV gén pre hemojuvelínový koreceptor BMP, HAMP gén pre hepcidínový antimikrobiálny peptid, TFR2 gén pre transferínový receptor 2, SLC40A1 gén pre rodinu nosičov rozpustených látok 40 člen 1, FTH1 gén pre feritínový ťažký reťazec 1, TF gén pre transferín, B2M gén pre beta-2-mikroglobulín, CP gén pre ceruloplazmín, FTL gén pre ľahký reťazec feritínu, CDAN1 gén pre kodanín 1, SEC23B SEC23 homológ B, SLC25A38 gén pre rodinu nosičov rozpustených látok 25 člen 38, STEAP3 STEAP3 metaloreduktáza, ALAS2 gén pre 5'-aminolevulinát syntázu 2.
  • a Prevzaté z Camps et al. (2016). 12
  • b Prijatá forma Lanktree et al. (2017). 18

Knižnice boli pripravené s použitím súprav na prípravu DNA knižnice Nextera (Illumina), pričom obohatenie sa uskutočnilo hybridizačným prístupom sondy s použitím vlastného génového panelu (Integrated DNA Technologies), po ktorom nasledovalo sekvenovanie (MiniSeq, Illumina). Identifikované varianty s rizikom ochorenia boli validované Sangerovým sekvenovaním (GATC Biotech). Sangerove sekvenovanie a predchádzajúca PCR amplifikácia sa uskutočnili s na mieru navrhnutými primérmi (Integrated DNA Technologies dostupné na požiadanie).

2.3 Bioinformatická analýza

Sekvenčná analýza sa uskutočnila pomocou vstavaných bioinformatických nástrojov (Illumina) a anotácie variantov pomocou online nástroja (Variant Interpreter Illumina). Sekvencie boli zarovnané s referenčným genómom hg19 (GRCh37). Na odstránenie variantov s nízkou kvalitou sekvenovania sa v rámci volajúceho variantu použili nasledujúce filtre: kvalita genotypu (tj hodnota GQX) gt -10 a hĺbka čítania JAK2 a HFE hodnotili sa aj gény, ktoré spôsobujú polycytémiu vera a dedičnú hemochromatózu. Naša analýza sa zamerala na malé varianty, ktoré zahŕňali jeden alebo niekoľko nukleotidov, ako sú varianty s jedným nukleotidom (SNV) a malé inzercie / delécie (INDEL).

S cieľom určiť stupeň zachovania variantnej polohy počas evolúcie bola vykonaná konzervačná analýza so serverom ConSurf (https://consurf.tau.ac.il/). 22 Server ConSurf predpovedá evolučnú konzerváciu aminokyselín alebo nukleotidov na základe viacnásobného zarovnania a fylogenetických vzťahov homológnych sekvencií, ktoré vedú k pozične špecifickému skóre konzervácie. Priebežné konzervačné skóre je rozdelené do škály deviatich farebných stupňov na vizualizáciu, od najvariabilnejšej polohy (1. stupeň), cez stredne konzervovanú polohu (5. stupeň) po najviac konzervovanú polohu (9. stupeň). Ku každému farebnému stupňu je každému skóre zachovania priradený interval spoľahlivosti. Ak interval pokrýva štyri alebo viac farebných stupňov, je zarovnaných menej ako šesť homológnych sekvencií a skóre zachovania je nespoľahlivé. 22 Parametre pre konzervačnú analýzu proteínových sekvencií boli nasledovné: CSI-BLAST vyhľadávací algoritmus 3 iterácie E-hodnota cut-off 0,0001 databáza proteínových sekvencií UNIREF90 počet analyzovaných homológov 150 minimálna 35% identita medzi homológmi maximálna 95% identita medzi homológmi viacnásobná algoritmus zarovnania sekvencií ClustalW a metóda na výpočet Bayesovskej paradigmy rýchlosti evolúcie. Na konzervačnú analýzu nukleotidových sekvencií sme manuálne hľadali homológne sekvencie pomocou programu Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 23 a vykonali sme viacnásobné zarovnanie sekvencií pomocou ClustalW (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). 24 Pre výpočet rýchlosti vývoja na serveri ConSurf sme zvolili Bayesovskú paradigmu.

Patogenita variantov v kódujúcich oblastiach bola hodnotená pomocou in silico nástroje na predikciu skóre CADD (https://cadd.gs.washington.edu/snv), 25 PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), 26 SIFT (https://sift. bii.a-star.edu.sg/), 27 MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org/index.html), 28 SNPs&GO (https://snps.biofold.org/snps-and-go/snps -and-go.html), 29 PANTHER (http://www.pantherdb.org/tools/csnpScoreForm.jsp), 30 PhD-SNP (https://snps.biofold.org/phd-snp/phd-snp .html), 31 PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php) 32 a Mutation Taster 2 (http://www.mutationtaster.org/) 33, ako ich opísali Schiemann a Stowell, 2016, 34 Bris a kol. 2018, 35 Wang a kol. 2020. 36 Predikcia patogenity variantov intrónu a vplyv na funkcie zostrihu boli analyzované pomocou nástrojov skóre CADD, 25 RegSNP-intron (https://regsnps-intron.ccbb.iupui.edu/), Human Splicing Finder (http:/ /www.umd.be/HSF/), 37 IntSplice (https://www.med.nagoya-u.ac.jp/neurogenetics/IntSplice/index.html) 38, ako je uvedené v Ohno et al. 2018 39 a Lin a kol. al. 2019. 40

S nástrojom CADD (Combined Annotation Dependent Depletion) vedie predikcia škodlivosti variantov k „surovému“ skóre a „PHRED-scaled“ skóre. Skóre škálované podľa PHRED vyjadruje stupeň patogenity variantu, napríklad skóre 10 naznačuje, že sa predpokladá, že variant je v 10 % najškodlivejších substitúcií a skóre 20 medzi 1 % najškodlivejších. Navrhovaná hranica je medzi 10 a 20 a hraničné skóre sme nastavili na >gt15. 25 PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping vs.-2.0) predpovedá účinok zmeny aminokyselín s klasifikátormi „benígny“, „možno poškodzujúci“ a „pravdepodobne škodlivý“ a skóre od 0,0 do 1,0: varianty s hodnotami blízkymi 0,0 sú klasifikované ako benígne a varianty s hodnotami blízkymi 1,0 sú s istotou predpovedané ako pravdepodobne škodlivé. Varianty so skóre nad 0,50 boli predpovedané ako patogénne. V bioinformatickej analýze s PolyPhen-2 uvádzame hodnoty získané predikčným modelom HumVar, ktorý je preferovaným modelom diagnostiky Mendelových chorôb. 26 Predikčný nástroj SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) kategorizuje vplyv zmeny aminokyselín na funkciu proteínu na základe skóre SIFT v rozsahu od 0 do 1: < 0,05 je klasifikované ako škodlivé a > 0,05 ako tolerované. 27 Výstup MutPred2 (predikcia mutácie vs.-2.0) pozostáva zo všeobecného skóre, ktoré sa pohybuje medzi 0,0 a 1,0, pričom vyššie skóre naznačuje väčšiu pravdepodobnosť, že bude patogénny. Hraničné všeobecné skóre >0,5 sa považovalo za patogénne. 28 Predikčný nástroj SNPs&GO používa index spoľahlivosti (RI) na vyhodnotenie spoľahlivosti predpovede, pričom 0 je najnespoľahlivejšia a 10 je najspoľahlivejšia. Varianty sa predpovedajú ako neutrálny polymorfizmus (neutrálny) alebo súvisiaci s chorobou (ochorenie), keď je skóre pravdepodobnosti >0,5. 29 PANTHER (Protein Analysis through Evolutionary Relationships) odhaduje pravdepodobnosť, že variant ovplyvní funkciu proteínu na základe evolučného zachovania pozície v proteíne. Pravdepodobnosť škodlivého účinku sa zvyšuje s dlhším časom uchovávania. Prahové hodnoty sú >450 miliónov rokov (my) pre predpoveď „pravdepodobne poškodzujúca“, medzi 200 my a 450 my pre „pravdepodobne poškodzovanie“ a <200 my pre „pravdepodobne neškodnú“ predpoveď. 30 Predikčný nástroj PhD-SNP (Predictor of Human Deleterious SNP) klasifikuje varianty na „neutrálny polymorfizmus“ alebo „súvisiaci s chorobou“ s hodnotami od 0 do 1 a prah rozhodovania pre spôsobenie ochorenia je >0,5. Používa tiež index spoľahlivosti (RI) v rozsahu od 0 do 10, od najnespoľahlivejšej po najspoľahlivejšiu predpoveď. Použila sa predpoveď s 20-násobnou krížovou validáciou. 31 PROVEAN (Protein Variant Effect Analyzer) používa skóre PROVEAN na binárnu klasifikáciu variantov na škodlivé alebo neutrálne. Prahová hodnota je nastavená na > -2,5 pre neutrálne predpovede a

Varianty boli pomenované v súlade so štandardnými medzinárodnými nomenklatúrnymi pokynmi Human Genome Variation Society. 41


Dať to všetko dohromady: Smerom k novej definícii „génu“

Kde nás opúšťajú všetky tieto úvahy? Od úplne abstraktnej formulácie pojmu „gén“ ako „jednotky dedičnosti“ Johannsenom trvalo približne pol storočia, kým sa dospelo k konceptu génu zo začiatku 60. rokov 20. storočia ako súvislého segmentu sekvencie DNA špecifikujúcej polypeptidový reťazec. Ďalšie polstoročie experimentálneho výskumu nás priviedlo k poznaniu, že definícia zo šesťdesiatych rokov už nie je adekvátna ako všeobecná. Napriek tomu pojem „gén“ pretrváva ako nejasne chápaný všeobecný opis. Je to prinajmenšom anomálna situácia, že ústredný pojem genetiky by mal byť teraz zahalený zmätkom a nejednoznačnosťou. To je nielen intelektuálne neuspokojivé pre disciplínu, ale má to škodlivý vplyv na všeobecné chápanie genetiky. Takéto nedorozumenie je najvýraznejšie vidieť v situácii uvedenej vyššie, všeobecne zaužívanom názore, že existujú jednotlivé gény zodpovedné „za“ určité zložité stavy, napr., schizofrénia, alkoholizmus atď. Jasnejšia definícia tohto pojmu by tak pomohla oblasti genetiky a v konečnom dôsledku aj porozumeniu verejnosti.

Tu preto navrhneme definíciu, o ktorej sa domnievame, že sa približuje k naplneniu spravodlivosti myšlienky „génu“ vo svetle súčasných poznatkov. Neobsahuje žiadnu zmienku o „jednotke dedičnosti“ – dlhotrvajúcom zmysle tohto pojmu –, pretože máme pocit, že teraz je jasné, že žiadna takáto generická univerzálna jednotka neexistuje. Odvolaním sa na sekvencie DNA však naša definícia stelesňuje dedičnú dimenziu génov (spôsobom, ktorý definície zamerané na čisto „proces“ zamerané na génovú expresiu nerobia). Okrem toho vo svojom dôraze na konečné molekulárne produkty a odkaze na GRN ako vyvolávateľov a sprostredkovateľov účinkov týchto produktov uznáva dlhé kauzálne reťazce, ktoré často fungujú medzi génmi a ich účinkami. Naša predbežná definícia je takáto:

Gén je sekvencia DNA (ktorej jednotlivé segmenty nemusia nevyhnutne fyzicky susediť), ktorá špecifikuje jednu alebo viacero sekvenčne súvisiacich RNA/proteínov, ktoré sú evokované GRN a zúčastňujú sa ako prvky v GRN., často s nepriamymi účinkami, alebo ako výstupy GRN, ten druhý prináša priamejšie fenotypové účinky.

Toto je výslovne „molekulárna“ definícia, ale myslíme si, že práve to je teraz potrebné. Na rozdiel od toho „gény“, ktoré sú identifikované čisto na základe ich fenotypových účinkov, ako napríklad v experimentoch genómovej asociácie (GWAS), by si podľa nášho názoru nezaslúžili takúto charakterizáciu, kým sa nezistí špecifikácia jednej alebo viacerých RNA/proteínov. . Genetické účinky získané pri takejto práci často identifikujú čisto regulačné prvky a tie by sa nemali kvalifikovať ako gény, ale iba ako súčasť génov. Naša definícia, podobne ako klasická formulácia zo 60. rokov, robí z identifikácie produktu (produktov) zásadný význam pre vymedzenie, teda identifikáciu samotných génov. Zdôrazňuje však aj molekulárny a bunkový kontext, v ktorom sa tieto produkty tvoria a fungujú. Tieto väčšie kontexty sa v skutočnosti stávajú nevyhnutnými na definovanie funkcie špecifikujúceho génu (génov).

Nová definícia je však trochu ťažkopádna. Preto ho ponúkame len ako predbežné riešenie, teda ako výzvu pre túto oblasť, aby sme našli lepšiu formuláciu, ktorá by však zodpovedala komplexnej realite genetického materiálu odkrytého v poslednom polstoročí.

Zásadný význam v operačnej definícii génu má cis-trans test (Lewis 1951 Benzer 1957). Testovať, či mutácie a a b patria k rovnakému génu alebo cistrónu (Benzer 1957), alebo rôznym cistrónom, cis-heterozygot a b/++ + a trans-heterozygot a +/+ b sa porovnávajú. Ak cis-heterozygoti a trans-heterozygoti sú fenotypovo podobní (zvyčajne divoký typ), hovorí sa, že sa navzájom „doplňujú“ a predpokladá sa, že mutácie spadajú do rôznych cistrónov. Ak však cis-heterozygoti a trans-heterozygoti sú fenotypovo odlišní, trans-heterozygot, ktorý je (zvyčajne) mutant, a cis-heterozygot (zvyčajne) divokého typu, mutácie sa nekomplementujú a predpokladá sa, že patria k rovnakému cistrónu. Priložený obrázok objasňuje myšlienku.

Princíp tzv cis-trans test. Ak mutácie a a b patria do rovnakého cistrónu, fenotypov cis- a trans-heterozygoti sú rôzni. Ak však cis- a trans-heterozygoti sú fenotypovo podobné, mutácie a a b patria k rôznym cistrónom. Označenie „funguje“ na obrázku znamená, že cistrón je schopný produkovať funkčný polypeptid. Mutácie a a b sú recesívne mutácie, ktoré obe ovplyvňujú rovnaký fenotypový znak, ako je farba očí D. melanogaster, napríklad.

Účinky genetického pozadia typicky vykazujú jednu z dvoch foriem, keď sa už existujúca mutácia s pridruženým fenotypovým prejavom skríži do iného kmeňa: redukcia („potlačenie“) mutantného fenotypu alebo jeho zvýšenie („posilnenie“). Účinky zahŕňajú buď zmeny v stupni („expresivita“) mutantného účinku, alebo počet postihnutých jedincov (jeho „penetrácia“), alebo oboje.Pri genetickej analýze možno tieto účinky často vysledovať k špecifickým „supresorovým“ alebo „zosilňujúcim“ lokusom, ktoré by mohli byť buď tesne spojené alebo vzdialené v genóme od pôvodného mutantného lokusu. Typicky považované za zbytočnú komplikáciu pri analýze pôvodnej mutácie, zvyčajne sa ďalej nesledovali. Z hľadiska súčasného chápania GRN však v zásade nie sú záhadné. Každý gén, ktorý je súčasťou GRN, možno považovať buď za vysielajúci signál na aktiváciu alebo represiu jedného alebo viacerých „downstream“ génov v tejto sieti, ale vzhľadom na hierarchickú povahu GRN z toho vyplýva, že mutačná zmena v špecifickom géne v sieti môže byť buď zosilnený alebo redukovaný inými mutačnými zmenami v sieti, buď upstream alebo downstream od pôvodnej mutácie. Konkrétny dosiahnutý účinok bude závisieť od charakteristík každej z dvoch zahrnutých mutácií – či už ide o mutácie so stratou funkcie alebo so ziskom funkcie – a presnej povahy ich konektivity. Takéto účinky sú najľahšie ilustrované lineárnymi sekvenciami pôsobenia génov, genetickými dráhami (Wilkins 2007), ale možno ich pochopiť v sieťach, keď je známa štruktúra siete a umiestnenie dvoch génov v nich. Niektoré účinky genetického pozadia však v zásade môžu zahŕňať čiastočne redundantné siete, v ktorých sú účinky týchto dvoch dráh aditívne. V týchto prípadoch môže byť mutantný efekt v jednej dráhe buď kompenzovaný, teda potlačený, alebo exacerbovaný druhou mutáciou v druhej dráhe, pričom presné účinky opäť závisia od špecifických charakteristík mutácií a stupňa redundancie medzi týmito dvoma GRNs.


Pozri si video: Proteosyntéza: od DNA k proteinu NEZkreslená věda II (Február 2023).